CN115120636A - 一种无花果乳浆提取物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用 - Google Patents

一种无花果乳浆提取物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无花果乳浆提取物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用，涉及抗癌药物技术领域。本发明通过从无花果乳浆中获得提取物AFFL，经过体内外研究表明，AFFL具有显著的抗肿瘤效果，可以抑制A549、H460等NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成，抑制A549异种移植肺癌小鼠的肿瘤生长，降低由肿瘤增殖导致的TNF‑α和IL‑6炎症因子的异常分泌，并增加IL‑1β和IL‑18的含量，促进肿瘤细胞凋亡和焦亡蛋白的形成，降低肿瘤组织中Ki67因子的表达，且对正常组织无明显的药物毒性。

Description

一种无花果乳浆提取物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的 应用
技术领域
本发明属于抗癌药物技术领域，具体涉及一种无花果乳浆提取物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
背景技术
无花果乳浆是一种在植物特殊分泌细胞中发现的复杂分子混合物的水悬浮液，可以合成和储存相当数量的不同次生代谢物，如含有有机酸、脂肪酸、三萜类化合物、类固醇、蛋白质和氨基酸等(Oliveira A P,Silva L R,Andrade P B,et al.Further insightinto the latex metabolite profile of Ficus carica[J].J Agric Food Chem,2010,58(20):10855-10863.Oliveira A P,Silva L R,Ferreres F,et al.Chemicalassessment and in vitro antioxidant capacity of Ficus carica latex[J].J AgricFood Chem,2010,58(6):3393-3398.)。此外由于无花果乳浆组分部分来自于果实，与果实在化学成分上具有一定的相似性，包含黄酮、香豆素、甾醇和三萜类化合物等(Barolo M I,Ruiz Mostacero N,López S N.Ficus carica L.(Moraceae):an ancient source offood and health[J].Food Chem,2014,164:119-127)。
无花果产品在全世界范围内均有广泛的食疗应用。中医记载无花果可治疗便秘，作为泻药，治疗痢疾和肠炎(Abbasi A M,Khan M A,Khan N,et al.Ethnobotanicalsurvey of medicinally important wild edible fruits species used by tribalcommunities of Lesser Himalayas-Pakistan[J].J Ethnopharmacol,2013,148(2):528-536)，《法国药典(2007年)》和《英国药典(2012年)》都将无花果及其制剂纳入顺势疗法，在北美洲无花果干果加热后可用于促进皮肤脓疱和疖子的成熟破溃(MartínezG.Farmacopea natural y tratamiento de afecciones de la piel en la medicinatradicional de los campesinos de las sierras de Córdoba(República Argentina)[J].Dominguezia,2008)，此外，无花果乳浆在世界各地广泛地用于治疗各种类型的疣(Bohlooli S,Mohebipoor A,Mohammadi S,et al.Comparative study of fig treeefficacy in the treatment of common warts(Verruca vulgaris)vs.cryotherapy[J].Int J Dermatol,2007,46(5):524-526)。
本发明的研究人员通过纯化制备了无花果乳浆醇沉部位(AFFL)，经体外药效筛选发现AFFL可显著抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成，促进细胞凋亡，并可抑制A549异种移植小鼠肿瘤的生长，降低体内TNF-α，IL-6等肿瘤炎症因子表达，且对小鼠正常组织(肝、肾)无明显损伤。分子机制研究发现，AFFL可通过激活肿瘤细胞内caspase-3、caspase-9蛋白的切割，增加caspase-1的表达，抑制bcl-2蛋白的活性，促进肿瘤细胞凋亡，在切割caspase蛋白的同时，导致Gasdermin蛋白家族(GSDMD和GSDME)的切割，释放N端结构域蛋白聚集在胞膜处打孔，释放IL-1β和IL-18细胞因子，促进肿瘤细胞焦亡溶解，同时AFFL抑制肿瘤标志物EGFR和AKT蛋白的表达和激活。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供了一种无花果乳浆提取物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。研究发现，无花果乳浆醇沉部位通过作用于Caspase/Gasdermin/AKT蛋白信号通路促进肿瘤细胞凋亡和焦亡，抑制NSCLC的体内外生长，表明了无花果乳浆可开发为治疗NSCLC的功能性食品/药品。
本发明无花果乳浆提取物的制备方法如下：
S1、收集新鲜的无花果乳浆，在无花果乳浆中加入无水乙醇至体系醇浓度为55-65wt％，4℃静置24h，过滤，收集上清液和沉淀；
S2、在上清液中无水乙醇，至体系醇浓度为85-95wt％，4℃静置24h，过滤，收集沉淀；
S3、将步骤S2和步骤S1收集的沉淀合并，然后加水后进行加热搅拌复溶，冷却后过滤，收集上清液；
S4、在步骤S4收集的上清液中加入Sevage试剂，震荡处理以除去上清液中的蛋白；
S5、离心过滤，收集滤液，并蒸发浓缩；
S6、将浓缩液进行冷冻干燥得到无花果乳浆提取物固体AFFL。
优选的，步骤S3所述的加热温度为40-60℃。更优选的加热温度为50℃。
优选的，所述Sevage试剂中氯仿与正丁醇的体积比为4:1。
本发明采用UPLC-TOF-MS/MS对AFFL进行分析，选择正、负离子模式分别对AFFL溶液(20％甲醇)进行扫描，总离子流图(total ions current，TIC)见图6。使用安捷伦masshunter B7.00版本在传统中药数据库中草药(Traditional Chinese Medical)进行比对，获得候选化合物，然后通过二级碎片离子及母离子可能的断裂规律来确定其结构。结果显示，最终从AFFL中鉴定出11个具有生物活性的化学成分，各化学成分的保留时间、质谱信息和结构式见表1所示。
表1 AFFL中天然产物成分的信息
Figure BDA0003768388770000031
Figure BDA0003768388770000041
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明从无花果的乳浆中提取了AFFL，通过大量的研究发现该AFFL具有抗NSCLC的药效作用，在体外可抑制NSCLC细胞系增殖和转移。在作用机制方面，AFFL通过激活裂解肿瘤细胞中caspase-3、caspase-9蛋白，抑制Bcl-2蛋白表达促进细胞凋亡。在切割caspase家族的同时，激活GSDMD、GSDME蛋白的切割，促使GSDME-N等蛋白在质膜打孔诱导细胞溶解，激活caspase-1，释放IL-1β、IL-18等细胞因子，降低癌蛋白EGFR的表达，抑制肿瘤细胞AKT的激活，促使肿瘤发生细胞焦亡和凋亡，并抑制肿瘤的体内外增长。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的AFFL对NSCLC细胞的抑制情况；
图2为本发明实施例1制备的AFFL诱导A549和H460细胞凋亡情况；
图3为本发明实施例1制备的AFFL对小鼠A549移植瘤的生长抑制情况；
图4为本发明实施例1制备AFFL对小鼠中血清细胞因子的影响以及肿瘤、肝脏和肾脏的病理组织切片；
图5为AFFL对H460和A549细胞相关蛋白的表达影响
图6为利用UPLC-TOF-MS/MS对实施例1制备的AFFL进行分析的谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
实施例1
一种无花果乳浆提取物，具体制备方法如下：
S1、收集新鲜的无花果乳浆，在无花果乳浆中加入无水乙醇至体系醇浓度为60wt％，4℃静置24h，过滤，收集上清液和沉淀；
S2、在上清液中无水乙醇，至体系醇浓度为90wt％，4℃静置24h，过滤，收集沉淀；
S3、将步骤S2和步骤S1收集的沉淀合并，然后加水后进行加热搅拌复溶(其中加热温度为50℃)，冷却后过滤，收集上清液；
S4、在步骤S4收集的上清液中加入Sevage试剂(氯仿与正丁醇的体积比为4:1)，震荡处理以除去上清液中的蛋白；
S5、离心过滤，收集滤液，并蒸发浓缩；
S6、将浓缩液进行冷冻干燥得到无花果乳浆提取物固体，即AFFL。
1、利用所制备的AFFL进行以下实验：
一、动物实验
动物实验遵循国家卫健委和山东中医药大学《实验动物护理和使用指南》中的指导方针进行，批准号CICATCMABSL-161。将35只6周龄雌性BALB/c裸鼠随机分为6组(正常对照组、模型对照组、顺铂组和AFFL给药3个剂量组)，每组5～6只。除正常对照组(Normal)外，将A549细胞(8×106个/只)接种于雌性裸鼠左腋下，当肿瘤体积达到约50～75mm3时，将NSCLC异种移植小鼠随机分为模型组(Model)和4个给药组。顺铂以5mg/kg/周的剂量腹腔注射，AFFL以300、150、75mg/kg/天的剂量灌胃给药，正常对照组和模型组给予蒸馏水。每2天用数字游标卡尺测量肿瘤大小，用公式V＝(长×宽2)/2计算肿瘤体积，每2天称量一次体重。体重变化率的计算公式如下：(当日体重-原始体重)/原始体重。
二、细胞毒性实验
用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖情况[2]。简而言之，所有NSCLC细胞株(A549、H226、H446、H460、H1299)分别以每孔1×105细胞的数量接种到96孔板中，经不同浓度的AFFL处理48h后，计算AFFL细胞存活率的百分比，即处理细胞的吸光度变化除以未处理细胞的吸光度。
三、细胞迁移和侵袭实验
使用24孔8.0μm Transwell小室(Corning)评估细胞体外迁移和侵袭能力。对于侵袭实验，每个Transwell小室加入80μL Matrigel基质胶(356234，Corning)。取1×106个A549或H460细胞，接种于上室无血清培养基(分别含有40、30、20μg/mL的AFFL)中，下室加入750μL完全培养基，孵育48h后，用棉签轻轻擦拭掉上表面未转移的细胞，将膜下表面的侵袭细胞用甲醇固定30min，结晶紫(Solarbio)染色后，显微镜下观察，ImageJ软件定量分析。对于迁移实验，无需加入Matrigel基质胶，其余操作均如上所述。
四、克隆形成实验
每孔接种A549或H460细胞300个，加入含或不含AFFL(40、30、20μg/mL)的培养基作用2周。去除培养基，将克隆细胞固定在4％多聚甲醛(Solarbio)中，结晶紫(Solarbio)染色，在显微镜(奥林巴斯)下计数克隆的细胞，并用ImageJ软件进行定量分析。
五、细胞凋亡分析
用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(BD)检测AFFL对A549和H460细胞的凋亡影响。在含或不含AFFL(浓度分别为40、30、20μg/mL)的培养基处理细胞48h后，重悬于缓冲液中，调整细胞浓度为1.5×106个/mL，在室温下用Annexin V-FITC和PI避光染色10min。使用美国Beckman公司的CytoFLEX流式细胞仪检测细胞凋亡率，FlowJo V10(BD)软件进行分析。
六、AO/EB染色实验
每孔接种4×106个A549或H460细胞，在含或不含AFFL(浓度为40、30和20μg/mL)的培养基作用48h，再重悬于缓冲液中，细胞浓度为2×106个/mL。将2μL AO/EB工作液(源叶)加入50μL细胞悬液中，混合后室温孵育10min。在载玻片上接种8μL细胞悬液，盖上盖玻片，使用倒置荧光显微镜(奥林巴斯)在530nm(绿色荧光)和640nm(橙色荧光)处观察。
七、酶联免疫吸附实验(ELISA)
根据商品化小鼠ELISA试剂盒(酶联)按说明书方法检测小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18水平。
八、苏木精-伊红(H&E)染色和免疫组织化学(IHC)染色
取小鼠肝、肾和肿瘤组织切片，用4％多聚甲醛固定48h后，石蜡包埋切片后，对切片进行脱蜡和水化处理。对于H&E染色，洗涤后苏木精染色3～5min，分化变为蓝色后用清水洗净。切片脱水5min，伊红染色5min，然后加入无水乙醇，二甲苯透明，中性树胶封片。对于免疫组织化学染色，封闭30min后，将切片与一抗(ServiceBio)在4℃下孵育过夜。载玻片在培养箱中孵育1h，在室温下与HRP标记的二抗(ServiceBio)孵育10min。用过氧化物酶标记的链霉亲和素-络合二氨基联苯胺(DAB)显示信号，切片用苏木素反染，黄褐色染色呈阳性结果。切片在显微镜下观察，并通过ImageJ软件进行量化。
十、蛋白提取与免疫印迹实验
使用含或不含AFFL(40、30和20μg/mL)的培养基作用于H460或A549细胞48h后，收集细胞并使用含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液(Beyotime)进行裂解。使用BCA蛋白含量测定试剂盒(Beyotime)对每个样品的蛋白质浓度进行定量测定。实验采用了6-12％的SDS-PAGE凝胶(Beyotime)分离等量的蛋白质，转移到PVDF(Beyotime)膜上。封闭膜后，在4℃下与特定的一抗(Abclone)孵育过夜。二抗(Abclone)以1：5000浓度稀释后加入到膜上，在室温下孵育1h，然后使用ECL发光试剂盒(Sparkjade)在GeneGenome XRQ扫描仪(Synoptics)上显影，使用ImageJ软件对条带印迹强度进行量化，并使用GAPDH作为内参进行归一化。
2、结果与分析
使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析。所有数据均以均数±标准差(SEM)表示。组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)和Fisher‘s-LSD检验。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001表示具有统计学意义。
2.1 AFFL体外抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成
通过建立5种非小细胞肺癌细胞体外模型来验证药效。MTT结果显示，AFFL在作用肿瘤细胞48h后，显著降低了细胞活力(图1A)，具有较强的细胞毒性，对A549、H226、H446、H460和H1299细胞的IC50值分别为22.98μg/mL、14.79μg/mL、15.49μg/mL、22.95μg/mL和22.40μg/mL，而对正常细胞，如Vero细胞的IC50值为723.8μg/mL。基于NSCLC较强的转移能力，我们选取A549和H460两株具有较强转移能力的细胞系进行研究，采用Transwell小室评价了AFFL对肿瘤细胞的迁移和侵袭影响，并采用克隆形成试验考察对单个细胞形成集落簇的能力。相比于未使用AFFL处理的空白对照组，在作用48h后，AFFL可在体外抑制H460和A549细胞的迁移、侵袭和克隆形成作用，且呈浓度依赖性作用(图1B—D)。20、30、40μg/mL的AFFL均可显著性抑制H460细胞的迁移、侵袭和克隆形成及A549细胞的侵袭和克隆形成(P<0.001)，但20μg/mL的AFFL对A549细胞的迁移无明显抑制作用(P>0.05)(图1E—G)。总之，多种方法都证明了AFFL具有较强的抑制肺癌增殖和转移的活性。
图1(A)是采用MTT测定AFFL处理A549、H226、H446、H460、H1299细胞48h后的细胞活力，并计算抑制率。图1(B、C)通过Transwell考察AFFL作用于A549和H460细胞48h后对迁移和侵袭能力影响。(D)克隆形成实验考察AFFL作用于A549和H460细胞48h后细胞集落形成能力。图1(E、F、G)使用ImageJ软件对迁移、侵袭和克隆细胞进行定量分析。所有数据至少以三个独立实验的平均值±标准差(SEM)表示，与对照组(未使用AFFL处理组)相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
2.2 AFFL促进非小细胞肺癌细胞的凋亡死亡
AFFL对多种癌细胞系具有抗增殖作用，为了了解AFFL是否会影响肿瘤细胞凋亡，本研究采用了PI-FITC流式细胞术和AO/EB荧光染料来考察AFFL对H460和A549的促细胞凋亡作用。流式细胞术分析结果显示，40、30、20μg/mL AFFL作用48h后，H460和A549的凋亡细胞比例相比于空白对照组均显著上升(P<0.001)，且具有浓度依赖性(图2A、B)。除此之外，AFFL作用48h后，AO/EB染色后，荧光显微镜测定发现，细胞代谢活性和形态学发生变化，AO所染的绿色荧光信号随着AFFL的浓度增加而减弱，而EB所染的红色荧光信号随之增强，证实AFFL以浓度依赖的方式促进了H460和A549细胞的凋亡死亡(图2C)。
2.3 AFFL抑制小鼠A549异种移植瘤生长
研究采用A549异种皮下移植瘤模型，设置空白组(Normal)、模型组(Model)、顺铂阳性对照组(Cispltain，剂量为5mg/kg/week)、AFFL高中低剂量组(AFFL，剂量为300、150、75mg/kg/day)，顺铂为腹腔注射，AFFL为灌胃口服给药。我们每隔两天称量一次体重，并计算与初始体重值的变化率，来反应小鼠的健康情况和不良反应。在21天的给药周期中，由于顺铂和AFFL的细胞毒性，顺铂、300和150mg/kg/day剂量AFFL治疗的小鼠在前7天体重变化率均呈现负数，而后恢复正增长，各组均未出现死亡，表明AFFL具有合适的细胞毒性(图3A)。相比于模型组，顺铂、300和150mg/kg/day剂量的AFFL均可以显著降低肿瘤在体内的生长，表现为肿瘤体积缩小，质量减少等(图3B—D)。抗肿瘤化疗药物，例如顺铂，由于其非特异性，易造成正常器官和组织(如肝、肾等)的损伤，相比于空白对照组，顺铂导致小鼠肝指数显著上升(P<0.001)，而AFFL对正常组织的毒性较小，各剂量的肝指数无显著性差异(图3E)。由于肿瘤细胞的增殖，对脾脏免疫系统的起到负调节作用，创造更有利于肿瘤生存的微环境，所以相比于空白对照组，模型组脾指数显著上升(P<0.05)，而顺铂(P<0.01)和300mg/kg/day的AFFL(P<0.05)可显著性降低脾指数，恢复至正常水平(图3F)。
2.4 AFFL抑制促炎细胞因子、促进焦亡细胞因子的释放
TNF-α和IL-6是肿瘤促炎关键因子，在肿瘤的发生和进展中起到关键作用。相比于空白对照组，模型组小鼠血清中TNF-α(P<0.001)和IL-6(P<0.05)含量显著提高，相比于模型组，300mg/kg/day的AFFL治疗后可显著降低TNF-α的含量(P<0.05)(图4A)，300和150mg/kg/day的AFFL治疗后可显著降低IL-6的含量(P<0.05)(图4B)，表明AFFL可抑制由于肿瘤的进展而显著增高的炎症因子。IL-1β和IL-18是细胞焦亡过程中产生的代表性细胞因子，可从焦亡细胞的膜孔中泄露释放，反映体内细胞焦亡反应的变化[12,13]。相比于空白对照组，模型组中IL-1β(P<0.05)和IL-18(P<0.001)含量均显著性下降，300(P<0.05)、150(P<0.01)和75(P<0.001)mg/kg/day的AFFL治疗后均可以显著性提高IL-1β和IL-18含量(图4C、D)，可能是小鼠体内发生了细胞焦亡反应，导致这两种细胞因子大量释放，于是对小鼠的肿瘤、肝脏和肾脏进行了病理分析。
2.5 AFFL促进肿瘤组织坏死，对肝肾组织具有较高安全性
肝脏的病理组织切片表明，空白对照组、模型组及各剂量的AFFL给药后肝细胞胞质疏松(黑色箭头)，肝板排列规则、整齐，肝窦无明显扩张或挤压，未见明显的炎性细胞浸润。而顺铂治疗后可见大量的肝细胞气球样变，细胞肿胀，胞质呈空泡状(黑色箭头)，肝板排列不规则，肝血窦挤压，结构不清晰，血管内可见淤血(黄色箭头)(图4E)。同样地，肾脏的病理组织切片表明，空白对照组、模型组及各剂量的AFFL给药后可见肾小球中细胞数量以及基质均匀，肾小管上皮细胞圆润、饱满，刷状缘排列整齐规则，间质无明显增生且未见明显的炎性细胞浸润。而顺铂治疗后肾脏组织可见少量的肾小管萎缩，结构不清晰，肾小管上皮细胞胞质嗜酸性减弱(黑色箭头)，少量的肾小管扩张，肾小管上皮细胞扁平(黄色箭头)(图4E)。
小鼠肿瘤的病理组织切片分析可得，模型组肿瘤细胞大小不一，形态各异，胞核异型，体积较大，核质比高，细胞排列紊乱无序，可见少量的核分裂象(黑色箭头)，肿瘤间质未见明显的增生，未见明显的炎性细胞浸润。AFFL治疗后可见少量的肿瘤细胞呈腺管状排列(黑色箭头)，少见核分裂象(黄色箭头)，肿瘤间质内可见散在的炎性细胞浸润(红色箭头)(图4F)，说明肿瘤组织发生了坏死，可能发生了细胞凋亡与焦亡反应。对肿瘤组织Ki67的免疫组化分析结果表明，相较于模型组，顺铂、300和150mg/kg/day的AFFL治疗后，肿瘤组织中Ki67表达显著降低(P<0.001)，提示AFFL可以降低肿瘤组织中癌细胞的增殖分裂能力，抑制肿瘤的体内生长(图4G、H)。以上结果表明，AFFL仅在肿瘤组织发生细胞凋亡与焦亡反应，抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤组织坏死，而对肝肾组织等正常组织无损伤，具有较高的安全性。
2.6 AFFL可能作用于Caspase/Gasdermin/AKT蛋白信号通路促进肿瘤细胞死亡
相比于空白对照组，AFFL在体外可降低H460和A549细胞中caspase-3、caspase-9的表达，使之切割成可促进细胞凋亡的蛋白形式，降低抗凋亡基因bcl-2的表达，促进细胞凋亡。此外，AFFL可通过增加caspase-1的表达，促进切割细胞焦亡的关键靶基因GSDMD和GSDME，降低其表达，从而增加GSDME-N的表达，聚集在肿瘤细胞膜上打孔，使细胞发生焦亡。此外，AFFL可降低NSCLC高表达的标志癌蛋白EGFR，并抑制AKT蛋白的表达(图5A、B)。
3、结论
本发明通过纯化了AFFL极性部位，通过体内外研究表明，AFFL具有显著的抗肿瘤效果，可以抑制A549、H460等NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成，抑制A549异种移植肺癌小鼠的肿瘤生长，降低由肿瘤增殖导致的TNF-α和IL-6炎症因子的异常分泌，并增加IL-1β和IL-18的含量，促进肿瘤细胞凋亡和焦亡蛋白的形成，降低肿瘤组织中Ki67因子的表达，且对正常组织(如肝、肾)无明显的药物毒性。体外作用机制表明，AFFL可显著降低NSCLC生物标志物EGFR的表达，并可激活肿瘤细胞内caspase-1表达，降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达，促进caspase-3、caspase-9蛋白的裂解，同时切割GSDMD和GSDME蛋白，形成N-GSDME，在细胞膜表面打孔，可能使肿瘤细胞同时发生细胞焦亡和凋亡过程，并降低AKT蛋白的表达。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种无花果乳浆提取物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述无花果乳浆提取物的制备方法如下：
S1、收集新鲜的无花果乳浆，在无花果乳浆中加入无水乙醇至体系醇浓度为55-65wt％，4℃静置24h，过滤，收集上清液和沉淀；
S2、在上清液中无水乙醇，至体系醇浓度为85-95wt％，4℃静置24h，过滤，收集沉淀；
S3、将步骤S2和步骤S1收集的沉淀合并，然后加水后进行加热搅拌复溶，冷却后过滤，收集上清液；
S4、在步骤S4收集的上清液中加入Sevage试剂，震荡处理以除去上清液中的蛋白；
S5、离心过滤，收集滤液，并蒸发浓缩；
S6、将浓缩液进行冷冻干燥得到无花果乳浆提取物固体。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤S3所述的加热温度为40-60℃。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Sevage试剂中氯仿与正丁醇的体积比为4:1。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，无花果乳浆提取物固体中含有以下结构的活性物质：
Figure FDA0003768388760000011
Figure FDA0003768388760000021
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