CN117982538A - 人参皂苷Rg1碳纳米点在抑制人非小细胞肺癌细胞中的应用 - Google Patents

人参皂苷Rg1碳纳米点在抑制人非小细胞肺癌细胞中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了人参皂苷Rg1碳纳米点在制备抑制人非小细胞肺癌细胞的药物制剂中的应用。本发明提供的人参皂苷Rg1碳纳米点对非小细胞肺癌具有高抑制作用，表现出抑制肿瘤生长的高效力，而且稳定性高以及良好的水溶性，能更好的透过细胞膜，被肿瘤细胞摄取，解决了当CD大于100nm时，人类单核吞噬细胞系统识别和去除CD的高几率和分子状态草药的低细胞摄取问题。同时制备成本低、制备工艺简单、疗效好，具有成为新的治疗非小细胞肺癌的药物潜力，在临床治疗中具有良好的应用前景。

Description

人参皂苷Rg1碳纳米点在抑制人非小细胞肺癌细胞中的应用
技术领域
本发明属于人参皂苷Rg1碳纳米点技术领域，涉及人参皂苷Rg1碳纳米点在抑制人非小细胞肺癌细胞中的应用，尤其涉及人参皂苷Rg1碳纳米点在制备抑制人非小细胞肺癌细胞的药物制剂中的应用。
背景技术
人参作为一种植物源性中草药，自古以来享有“百草之王”的美誉。现代临床证明人参有多种治疗功效，主要归因于人参含有大量多种的生物活性物质，如人参皂苷，挥发油，多糖等。其中人参皂苷是人参中最主要生物活性物质，很多研究证明其在抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗衰老、抗心律失常、抑制细胞凋亡和免疫功能等方面均有很好的作用。目前研究人员已从各类人参制品中分离得到了60多种人参皂苷，根据化学结构可分为3种类型：原人参二醇型、原人参三醇型及齐墩果酸型。其中，人参总皂苷是人参根经提取加工制成的总皂苷，人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1的含量较高，约占人参总皂苷的70％。
中药可以被认为是抗癌剂的特殊来源。已经从中药中分离出紫杉醇、高三尖杉酯碱和喜树碱等几种抗癌剂，并且在不久的将来可能会发现更多的抗癌剂。使用中药化合物治疗癌症的优点是大多数天然存在的化合物没有毒性，并且可以特异性地杀死癌细胞。人参为五加科植物人参的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，被誉为“百草之王”，而人参皂苷作为人参的主要活性成分，具有增强免疫、抗血小板聚集及抑制肿瘤生长等多种药理学特性。各种研究表明，人参总皂苷可以抑制肿瘤，提高免疫力，调节神经系统。
肺癌是世界上最常见的癌症之一，约18.4％的癌症死亡归因于肺癌。其中，非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌类型，占肺癌总发病率的85％以上。近些年来，靶向治疗和免疫治疗的发展在治疗NSCLC方面取得了很大进展。但由于很多患者不适合这些治疗方法，仍然只能依靠放疗和化疗进行治疗。众所周知，化疗法伴随着强毒性作用，在杀死癌细胞的同时，会杀死机体正常细胞。化疗药物对人体伤害巨大，大多数患者会有疲劳、静脉炎、脱发、恶心、呕吐、甚至心脏功能障碍等症状的出现。并且，尽管采用了铂类化疗、新的分子靶向治疗和免疫治疗，NSCLC的总体生存率仍然不大，只有19％的患者存活超过5年。
因此，如何获得更好的肺癌治疗效果，特别是针对非小细胞肺癌细胞去找到治疗效果好，毒副作用低的药物或研究方向仍然至关重要，也是业内诸多一线研究人员广为关注的焦点之一。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供了人参皂苷Rg1碳纳米点在制备抑制人非小细胞肺癌细胞的药物制剂中的应用。本发明提供的人参皂苷Rg1碳纳米点(Rg1-CDs)，对非小细胞肺癌具有高抑制作用，表现出抑制肿瘤生长的高效力，而且制备成本低、制备工艺简单、疗效好，具有成为新的治疗非小细胞肺癌的药物潜力，在临床治疗中具有良好的应用前景。
本发明提供了人参皂苷Rg1碳纳米点在制备抑制人非小细胞肺癌细胞的药物制剂中的应用。
优选的，所述人参皂苷Rg1碳纳米点的表面含有羟基、羰基和羧基中的一种或多种；
所述人参皂苷Rg1碳纳米点在pH为1～9时，具有稳定性；
所述人参皂苷Rg1碳纳米点无pH依赖性。
优选的，所述人参皂苷Rg1碳纳米点在NaCl和/或KCl溶液中具有稳定性；
所述人非小细胞肺癌细胞为A549细胞；
所述人参皂苷Rg1碳点对A549细胞具有特异性抑制作用。
优选的，所述NaCl和/或KCl溶液的浓度为0.01～2mol/L；
所述稳定性包括荧光稳定性；
所述人参皂苷Rg1碳纳米点的直径为1～10nm。
优选的，所述抑制包括抑制细胞活性和/或细胞迁移能力；
所述人参皂苷Rg1碳纳米点的给药浓度为10～100μg/mL；
所述人参皂苷Rg1碳纳米点对293t细胞和/或LO2细胞没有增殖或者抑制作用。
优选的，所述人参皂苷Rg1碳纳米点的制备方法，包括以下步骤：
1)将人参皂苷Rg1和水混合后，得到混合液；
2)将上述步骤得到的混合液进行水热反应后，得到人参皂苷Rg1碳点水溶液。
优选的，所述混合液中人参皂苷Rg1的浓度为0.1～10mg/mL；
所述水热反应的温度为90～220℃；
所述水热反应的时间为0.5～12h；
所述水热反应后还包括过滤步骤；
所述人参皂苷Rg1碳点水溶液为具有中药味的透明液体。
优选的，所述人参皂苷Rg1碳纳米点还包括人参皂苷Rg1碳纳米点荧光探针；
所述荧光探针包括细胞荧光探针；
所述荧光探针为追踪细胞、标记细胞和细胞成像中的一种或多种的荧光探针。
优选的，所述药物制剂包括人参皂苷Rg1碳点和药学上可接受的辅料；
所述药物制剂对A549细胞具有特异性抑制作用。
优选的，所述药物制剂对293t细胞和/或LO2细胞没有增殖或者抑制作用；
所述药物制剂的剂型包括口服制剂、注射剂、栓剂、吸入剂或可直接应用于肿瘤的剂型；
所述药物制剂中，所述人参皂苷Rg1碳纳米点的浓度为10～200μg/mL。
本发明提供了人参皂苷Rg1碳纳米点在制备抑制人非小细胞肺癌细胞的药物制剂中的应用。与现有技术相比，本发明研究认为，Rg1属于原人参三醇型人参皂苷，其在心脏、神经系统等多种器官保护和多种疾病治疗中发挥有效作用，除了治疗疾病，还可减少机体正常机能的损伤，值得注意的是其抗肿瘤作用也不断被发现。本发明以人参皂苷Rg1为唯一碳源，建立了一种简单、低成本、绿色的水热法合成高荧光CD的方法，该方法成本低、无需添加任何化学试剂，避免了合成过程中其他化学物质的生物毒性，而且提高了人参皂苷Rg1细胞摄取和药用效果。本发明所制备人参皂苷Rg1碳纳米点(Rg1-CDs)稳定性高，Rg1-CDs的尺寸在3～4nm范围内具有良好的水溶性，能更好的透过细胞膜，被肿瘤细胞摄取，解决了当CD大于100nm时，人类单核吞噬细胞系统识别和去除CD的高几率和分子状态草药的低细胞摄取问题。
体外实验表明Rg1-CDs能显著促进A549细胞凋亡，显著降低A549细胞的高迁移特性并且能通过增加ROS和Ca2+的释放，降低线粒体膜电位调节线粒体功能，调节凋亡蛋白cas3/9、bax/bcl和MAPK信号通路中p38等蛋白的水平，发挥促进A549肿瘤凋亡能力，这与蛋白组学结果一致。体内动物实验结果进一步证实Rg1-CDs对非小细胞肺癌具有高抑制作用。通过体外尾静脉注射Rg1-CDs，发现Rg1-CDs在裸鼠皮下肿瘤模型中表现出抑制肿瘤生长的高效力。并且Rg1-CDs在对健康组织的毒性最小化和治疗肺癌的效力方面显著优于临床使用的化疗药顺铂(Scheme 1)。Rg1-CDs成本低、制备工艺简单、疗效好，本发明认为Rg1-CDs作为抗肺癌治疗剂具有很好的潜力，有可能成为一种新的治疗非小细胞肺癌的药物，为进一步拓宽CDs的生物学应用提供了依据，在临床治疗中也会具有良好的应用前景，同时也为纳米药物治疗疑难疾病提供了潜在的希望。
本发明采用了一步水热法合成人参皂苷Rg1碳纳米点(Rg1-CDs)，作为有希望治疗肺癌的药物。采用高分辨透射显微镜，分光光度计，红外光谱仪和X射线光电子能谱(XPS)等方法对以人参皂苷Rg1(Rg1)为单一前驱体制备的碳点进行了表征，采用CCK8，划痕和Transwell迁移实验，流式细胞仪检测，荧光检测，蛋白组学和Western blot实验对Rg1-CDs体外抑制A549增殖和促凋亡能力和途径进行研究，并通过CT，HE染色，TUNEL染色和免疫组织化学染色对Rg1-CDs体内抑制A549细胞增殖和促凋亡能力和途径进行验证。结果发现Rg1-CDs的荧光量子产率为2.1％，无毒性，亲水性化学基团丰富，具有良好的溶解性，平均粒径为(3.96±1.44)nm，这可能有利于增加其生物活性。
实验结果表明，Rg1-CDs对非小细胞肺癌A549细胞具有高抑制作用，能显著抑制其体外迁移能力，并通过调节活性氧(ROS)，Ca2+，线粒体膜电位水平(TMRE))以及凋亡蛋白Cas3/9，Cyto-c、Bax/Bcl-2和MAPK信号通路中Mkk3，p38，Msk1，hsp27等蛋白的水平，发挥促进A549肿瘤凋亡能力，体内实验通过建立皮下肿瘤模型，证明其体内抑制肿瘤生长的治疗效力高于化疗药顺铂(CDDP)，且具有低全身毒性，免疫组化实验证明Rg1-CDs能降低A549肿瘤中的肿瘤标志物(CD31、CDK4、Ki67、NSE)的表达并且其对Caspase和MAPK相关蛋白表达水平与体外实验一致。
附图说明
图1为本发明提供的Rg1-CDs的合成路线及其对人非小细胞肺癌的抑制作用示意图；
图2为本发明制备的Rg1-CDs的理化性质表征图；
图3为本发明制备的Rg1-CDs在不同浓度NaCl、KCl溶液中的荧光光谱图和归一化图；
图4为本发明制备的Rg1-CDs在不同PH和365nmUV灯下照射光谱图和归一化图；
图5为本发明制备的Rg1-CDs对A549细胞活力的影响图；其
图6为本发明制备的Rg1-CDs对A549细胞迁移能力的影响；
图7为本发明制备的Rg1-CDs对A549细胞凋亡和细胞周期的影响图；
图8为本发明制备Rg1-CDs的生物安全性验证图；
图9为本发明制备的Rg1-CDs对A549荷瘤小鼠的抑制作用；
图10为本发明制备的Rg1-CDs对裸鼠血清中细胞因子(IL-6、IL-10)水平的影响。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。在本发明中，所有原料均为离体原料。
本发明所有原料，对其纯度没有特别限制，本发明优选采用医用纯度标准或人参皂苷Rg1碳纳米点制备领域标准。
本发明所有原料，其牌号和简称均属于本领域常规牌号和简称，每个牌号和简称在其相关用途的领域内均是清楚明确的，本领域技术人员根据牌号、简称以及相应的用途，能够从市售中购买得到或常规方法制备得到。
本发明提供了人参皂苷Rg1碳纳米点在制备抑制人非小细胞肺癌细胞的药物制剂中的应用。
在本发明中，所述人参皂苷Rg1碳纳米点的表面优选含有羟基、羰基和羧基中的一种或多种，更优选为羟基、羰基或羧基。
在本发明中，所述人参皂苷Rg1碳纳米点在pH优选为1～9时，具有稳定性，更优选为2.5～7.5时，更优选为5～6时。
在本发明中，所述人参皂苷Rg1碳纳米点优选无pH依赖性。
在本发明中，所述人参皂苷Rg1碳纳米点在NaCl和/或KCl溶液中优选具有稳定性。
在本发明中，所述人非小细胞肺癌细胞(即非小细胞肺癌细胞)优选为A549细胞。
在本发明中，所述人参皂苷Rg1碳点对A549细胞优选具有特异性抑制作用。
在本发明中，所述NaCl和/或KCl溶液的浓度优选为0.01～2mol/L，更优选为0.1～1.5mol/L，更优选为0.5～1.0mol/L。
在本发明中，所述稳定性优选包括荧光稳定性。
在本发明中，所述人参皂苷Rg1碳纳米点的直径优选为1～10nm，更优选为1～10nm，更优选为3～8nm，更优选为5～6nm。
在本发明中，所述抑制优选包括抑制细胞活性和/或细胞迁移能力，更优选为抑制细胞活性或细胞迁移能力。
在本发明中，所述人参皂苷Rg1碳纳米点的给药浓度优选为10～100μg/mL，更优选为30～80μg/mL，更优选为50～60μg/mL。
在本发明中，所述人参皂苷Rg1碳纳米点优选对293t细胞和/或LO2细胞没有增殖或者抑制作用，更优选对293t细胞或LO2细胞没有增殖或者抑制作用。
在本发明中，所述人参皂苷Rg1对非小细胞肺癌细胞没有增殖或者抑制作用。
在本发明中，所述人参皂苷Rg1碳纳米点的制备方法，优选包括以下步骤：
1)将人参皂苷Rg1和水混合后，得到混合液；
2)将上述步骤得到的混合液进行水热反应后，得到人参皂苷Rg1碳点水溶液。
本发明首先将人参皂苷Rg1和水混合后，得到混合液。
在本发明中，所述混合液中人参皂苷Rg1的浓度优选为0.1～10mg/mL，更优选为1～8mg/mL，更优选为3～6mg/mL。
在本发明中，所述水热反应的温度优选为90～220℃，更优选为120～190℃，更优选为150～160℃。
在本发明中，所述水热反应的时间优选为0.5～12h，更优选为2～10h，更优选为4～8h。
在本发明中，所述水热反应后还优选包括过滤步骤。
在本发明中，所述人参皂苷Rg1碳点水溶液优选为具有中药味的透明液体。
在本发明中，所述人参皂苷Rg1碳纳米点还优选包括人参皂苷Rg1碳纳米点荧光探针。
在本发明中，所述荧光探针优选包括细胞荧光探针。
在本发明中，所述荧光探针优选为追踪细胞、标记细胞和细胞成像中的一种或多种的荧光探针，更优选为追踪细胞、标记细胞或细胞成像中的荧光探针。
在本发明中，所述药物制剂优选包括人参皂苷Rg1碳点和药学上可接受的辅料；
在本发明中，所述药物制剂对A549细胞优选具有特异性抑制作用。
在本发明中，所述药物制剂优选对293t细胞和/或LO2细胞没有增殖或者抑制作用，更优选对293t细胞或LO2细胞没有增殖或者抑制作用。
在本发明中，所述药物制剂的剂型优选包括口服制剂、注射剂、栓剂、吸入剂或可直接应用于肿瘤的剂型。
在本发明中，所述药物制剂中，所述人参皂苷Rg1碳纳米点的浓度优选为10～200μg/mL，更优选为50～160μg/mL，更优选为90～120μg/mL。
参见图1，图1为本发明提供的Rg1-CDs的合成路线及其对人非小细胞肺癌的抑制作用示意图。
本发明上述内容提供了人参皂苷Rg1碳纳米点在抑制人非小细胞肺癌细胞中的应用以及人参皂苷Rg1碳纳米点在制备抑制人非小细胞肺癌细胞的药物制剂中的应用。本发明以人参皂苷Rg1为唯一碳源，建立了一种简单、低成本、绿色的水热法合成高荧光CD的方法，该方法成本低、无需添加任何化学试剂，避免了合成过程中其他化学物质的生物毒性，而且提高了人参皂苷Rg1细胞摄取和药用效果。本发明所制备人参皂苷Rg1碳纳米点(Rg1-CDs)稳定性高，Rg1-CDs的尺寸在3～4nm范围内具有良好的水溶性，能更好的透过细胞膜，被肿瘤细胞摄取，解决了当CD大于100nm时，人类单核吞噬细胞系统识别和去除CD的高几率和分子状态草药的低细胞摄取问题。
体外实验表明Rg1-CDs能显著促进A549细胞凋亡，显著降低A549细胞的高迁移特性并且能通过增加ROS和Ca2+的释放，降低线粒体膜电位调节线粒体功能，调节凋亡蛋白cas3/9、bax/bcl和MAPK信号通路中p38等蛋白的水平，发挥促进A549肿瘤凋亡能力，这与蛋白组学结果一致。体内动物实验结果进一步证实Rg1-CDs对非小细胞肺癌具有高抑制作用。通过体外尾静脉注射Rg1-CDs，发现Rg1-CDs在裸鼠皮下肿瘤模型中表现出抑制肿瘤生长的高效力。并且Rg1-CDs在对健康组织的毒性最小化和治疗肺癌的效力方面显著优于临床使用的化疗药顺铂(Scheme 1)。Rg1-CDs成本低、制备工艺简单、疗效好，本发明认为Rg1-CDs作为抗肺癌治疗剂具有很好的潜力，有可能成为一种新的治疗非小细胞肺癌的药物，为进一步拓宽CDs的生物学应用提供了依据，在临床治疗中也会具有良好的应用前景，同时也为纳米药物治疗疑难疾病提供了潜在的希望。
本发明采用了一步水热法合成人参皂苷Rg1碳纳米点(Rg1-CDs)，作为有希望治疗肺癌的药物。采用高分辨透射显微镜，分光光度计，红外光谱仪和X射线光电子能谱(XPS)等方法对以人参皂苷Rg1(Rg1)为单一前驱体制备的碳点进行了表征，采用CCK8，划痕和Transwell迁移实验，流式细胞仪检测，荧光检测，蛋白组学和Western blot实验对Rg1-CDs体外抑制A549增殖和促凋亡能力和途径进行研究，并通过CT，HE染色，TUNEL染色和免疫组织化学染色对Rg1-CDs体内抑制A549细胞增殖和促凋亡能力和途径进行验证。结果发现Rg1-CDs的荧光量子产率为2.1％，无毒性，亲水性化学基团丰富，具有良好的溶解性，平均粒径为(3.96±1.44)nm，这可能有利于增加其生物活性。
实验结果表明，Rg1-CDs对非小细胞肺癌A549细胞具有高抑制作用，能显著抑制其体外迁移能力，并通过调节活性氧(ROS)，Ca2+，线粒体膜电位水平(TMRE))以及凋亡蛋白Cas3/9，Cyto-c、Bax/Bcl-2和MAPK信号通路中Mkk3，p38，Msk1，hsp27等蛋白的水平，发挥促进A549肿瘤凋亡能力，体内实验通过建立皮下肿瘤模型，证明其体内抑制肿瘤生长的治疗效力高于化疗药顺铂(CDDP)，且具有低全身毒性，免疫组化实验证明Rg1-CDs能降低A549肿瘤中的肿瘤标志物(CD31、CDK4、Ki67、NSE)的表达并且其对Caspase和MAPK相关蛋白表达水平与体外实验一致。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的人参皂苷Rg1碳纳米点在抑制人非小细胞肺癌细胞中的应用进行详细描述，但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
实施例1
人参皂苷Rg1碳纳米点的制备以及相关检测。
人参皂苷Rg1-CDs碳纳米点(Rg1-CDs)
Rg1-CDs的制备根据典型的水热方法合成。首先，将10mLRg1水溶液(2mg/mL)转移到15mL聚四氟乙烯衬里的高压釜中，并在烘箱中在170℃下加热8h。反应完成后，使用0.22μm聚醚砜膜过滤所得溶液以除去较大产物。然后，将过滤后的溶液添加到活化的超滤管(10000MWC)中，4℃离心纯化(5000rpm，5min)。最后将获得浅黄色Rg1-CDs溶液，并在4℃的冰箱中储存备用。
表征方法以及装置
在室温下在Persee TU 1810PC分光光度计上记录Rg1-CDs的吸收光谱和荧光光谱。用FEI TECNAIG 2F 20-S-TWIN电子显微镜获取透射电子显微镜(TEM)图像。在Nexus470(Thermo Fisher，USA)光谱仪上进行傅里叶变换红外光谱(FTIR)。X射线光电子能谱(XPS)测量使用Thermo Fisher ESCALAB 250Xi表面分析系统。
Rg1-CDs的稳定性
在室温下将在Rg1-CDs溶液(0.5mg/mL)中加入NaCl/KCl固体混合使各混合溶液的终浓度为0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0mol/L。在360nm的激发波长下测定各混合溶液的荧光光谱，将Rg1-CDs溶液(0.5mg/mL)在365nm的UV照射下暴0、1、2、3、4、5、6、7h后，在360nm激发波长下测定各时间点溶液的荧光光谱。将在Rg1-CDs溶液(0.5mg/mL)中加入HCL/NaOH溶液调节pH至0、1、2、3、5、7和9，在360nm激发波长下测定各时间点溶液的荧光光谱。将Rg1-CDs溶液(0.5mg/mL)置于37℃下0、0.5、1、2、3、4、5h，然后在360nm激发波长下测定各溶液的荧光光谱。将Rg1-CDs溶液(0.5mg/mL)置于4℃下0、1、2、3、4、5、6、7d，然后在360nm激发波长下测定各溶液的荧光光谱。
细胞培养和体外细胞毒性测定
细胞培养所有细胞均来自美国型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA，US)。在RPMI 1640培养基中培养人非小细胞肺癌细胞(A549)和人正常肝细胞(LO 2)。在DMEM-F12培养基中人胚肾293T细胞(HEK293T)。所有细胞均在含5％ CO2的加湿培养箱中于37℃培养。
将细胞接种到96孔板中(密度：4×103个/孔)，并孵育12h以使细胞附着。弃去96孔板的培养基，加入200μL含有不同浓度Rg1-CDs/Rg1(0、30、50、70和90μg/mL)的完全培养基，继续常规培养细胞48h，弃去上述细胞培养基，然后以100μL/孔添加含有10％细胞计数试剂盒-8(CCK-8测定)的完全培养基，继续在培养箱孵育1h后在450nm处读取。
细胞形态的观察
将A549细胞接种于六孔板中(密度：5×105个/孔)，并孵育12h以使细胞附着，加入2mL含有不同浓度Rg1-CDs(0、30、50、70和90μg/mL)的1640完全培养基，继续常规培养细胞48h，于显微镜下观察细胞形态的改变，并拍照记录
细胞克隆形成实验
将对数生长期的A549细胞接种于六孔板中(密度：5×105个/孔)，待次日加入2mL含有不同浓度Rg1-CDs(0、30、50、70和90μg/mL)的1640完全培养基，继续常规培养细胞48h，用无血清1640饥饿处理2h，制备细胞悬液，计数，接种于6孔板内(密度：1×103个/孔)，继续培养14d，每2d观察细胞的状态并更换新鲜的培养基，培养结束后，弃去上清，用4％多聚甲醛室温固定30min。每孔加入500μL0.1％结晶紫染液，染色15～20min。弃去液体，蒸馏水洗净，拍照。
细胞荧光成像
利用荧光倒置显微镜拍Rg1-CDs在细胞内摄取的细胞荧光成像图像。将圆形显微镜盖玻片置于6孔细胞培养板中,加入2mL细胞悬液(密度：5×105个/孔)，在培养箱中培养24h，吸去上清培养基，用含有90μg/mL的Rg1-CDs溶液的培养基替代。分别使Rg1-CDs与细胞共同孵育0、6h，12h，24h，48h后，吸去上清液，小心用PBS洗涤细胞3次，加入1mL4％多聚甲醛溶液，固定细胞形态15min，PBS洗涤细胞3次。加入少量DAPI染色液，覆盖在圆形盖玻片上，室温孵育3min，小心用PBS洗涤细胞3次，最后吸干PBS溶液。用10μL抗荧光衰减封片剂封片，制成细胞爬片，避光保存，使用荧光显微镜拍摄图像。
划痕实验
将A549细胞接种于六孔板中(密度：3×106个/孔)，待细胞生长至铺满六孔板后用10μl的枪头垂直进行划痕，动作轻柔。PBS侧壁吹洗3次，去除划痕下来的细胞。加入2mL含有不同浓度Rg1-CDs(0、30、50、70和90μg/mL)的2％血清的1640完全培养基，置于37℃含5％CO2的孵箱中培养，分别在0h、24h和48h在显微镜下进行拍照，记录拍照的位置，通过ImageJ软件分析。
Transwell小室迁移实验
将对数生长期的A549细胞接种于六孔板中(密度：2×105个/孔)，待次日加入2mL含有不同浓度Rg1-CDs(0、30、50、70和90μg/mL)的1640完全培养基，继续常规培养细胞48h。为了进行transwell测定，将各处理组A549细胞xi消化后种植在具有200μL无血清培养基的上室中(密度：5×104个/孔)。向下室添加分别含有20％ FBS的完全培养基。分别在24h、48h后，将下室中的细胞用4％多聚甲醇固定30min并用结晶紫(0.1％)染色。在显微镜下进行拍照并通过ImageJ软件分析。
流式细胞法和凋亡分析细胞周期
A549细胞在6孔细胞培养板中以1×105个/孔的细胞密度培养至对数生长期。然后在含5％ CO2的37℃培养箱中孵育24h。将培养板中的培养基替换为含有Rg1-CDs的1640，每孔中Rg1-CDs的终浓度分别为0、30、50、70、90μg/mL。孵育48h后，将细胞收获于离心管中，用500μL70％的冷冻乙醇在4℃下固定4h,PBS洗涤2次，用DNA含量定量检测试剂盒检测A549细胞的细胞周期。FITC联合annexinv细胞凋亡检测试剂盒I检测A549细胞的凋亡情况。流式细胞仪(BD FACSCalibur,BD Biosciences Pharmingen,USA)对染色细胞进行分析，每个样本共计数1×104个细胞。
ROS荧光测定
将对数生长期的A549细胞接种于六孔板中(密度：2×105个/孔)，待次日加入2mL含有不同浓度Rg1-CDs(30、50、70和90μg/mL)的1640完全培养基，继续常规培养细胞48h。弃去上述培养基用1ml PBS洗涤一次，加入1ml10μMDHE红色荧光染料，在37℃培养20min，吸出染色液，使用PBS洗涤两次，使用荧光显微镜拍照并用Image J定量。
Ca2+荧光检测
将对数生长期的A549细胞接种于六孔板中(密度：2×105个/孔)，待次日加入2mL含有不同浓度Rg1-CDs(30、50、70和90μg/mL)的1640完全培养基，继续常规培养细胞48h，弃去上述培养基用1mLPBS洗涤一次，加入1mLFluo-4 AM工作液，在37℃培养30min。用1mLPBS洗涤一次，使用荧光显微镜拍照并用Image J定量。
线粒体膜电位(TMRE)荧光检测
将对数生长期的A549细胞接种于六孔板中(密度：2×105个/孔)，待次日加入2mL含有不同浓度Rg1-CDs(30、50、70和90μg/mL)的1640完全培养基，继续常规培养细胞48h。弃去上述培养基用1mLPBS洗涤一次，加入100nM的1mLTMRE染色工作液，在细胞培养箱37℃孵育30min。使用荧光显微镜拍照并用Image J定量。
蛋白组学测定分析
LC-MS/MS蛋白质组学分析，Model和Rg1-CDs组细胞在100mm培养皿中培养。采用SDT(4％(w/v)SDS，100mMTris/HClpH 7.6，0.1M DTT)裂解法提取蛋白质，然后采用BCA法进行蛋白质定量。无标记定量和LC-MS/MS蛋白质组学分析由Personalbio TechnologyCompany(中国上海)进行。原始数据采用软件Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4进行查库鉴定及定量分析，随后进行生物信息学分析，分析内容主要包括鉴定分析、表达差异分析、功能分析等。
Western blotting.
收集经培养的A549细胞，并在蛋白酶和磷酸酶抑制剂存在下用RIPA裂解缓冲液(Transgen，China)裂解。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Solarbio，China)按照制造商的说明书计算蛋白质浓度。在12％ SDS-PAGE凝胶上分离后，将蛋白质转移至PVDF膜，随后用相应的一抗和二抗接种。ECL化学发光试剂盒染色，成像系统(Tianneng)用于检测，并通过ImageJ软件分析定量。
研究对A549肿瘤抑制作用的体内实验
使用昆明小鼠(雌性，6周龄)用于评估Rg1-CDs的生物相容性。分别用生理盐水和Rg1-CDs(200μL，140mg/kg)尾静脉注射，每组5只。每2d记录体重，8d后，从小鼠中切除主要器官(心、肝、脾、肺、肾)进行苏木精和伊红(H&E)染色。同时采集血样进行生化分析(ALT、AKP、AST、BUN、CRE)按试剂盒说明书进行，并在相应的波长下检测。(南京建成，中国)。
为评价Rg1-CDs的治疗效果，通过将A549细胞(每只小鼠3×107个细胞)接种到BALB/c-nu裸鼠(雄性，4-5周龄，购自辽宁长生实验动物技术有限公司)的右侧腋下来建立皮下肿瘤模型。当肿瘤体积达到50-100mm3时，将小鼠随机分组，每组5只，Control组和Control+Rg1-CDs组，不接种肿瘤细胞，Control组和Model组尾静脉内注射生理盐水，Control+Rg1-CDs组和Rg1-CDs组尾静脉内注射Rg1-CDs(2.5mg/kg)，5次/week，CDDP组腹腔注射顺铂(3mg/kg)，2次/week。每2d记录小鼠体重和肿瘤体积，通过数字卡尺测量肿瘤的长度和宽度，使用以下公式计算肿瘤体积：0.52*宽度*宽度*长度。给药最后一天，CT测量活体肿瘤体积，在实验结束时，处死小鼠并摘除脏器，肿瘤，称重肿瘤的重量并分离小鼠血清。
将组织固定在福尔马林中，包埋在石蜡中，然后切片。用HE染色对肾脏、肝脏、心脏、脾、肺和肿瘤组织进行组织学评价。使用TUNEL染色对肿瘤组织凋亡情况进行评价。用免疫组织化学染色对肿瘤组织中CD31，CDK4，Ki67，NSE，Cas 3，Cas 9，Cyto-c，BAX，Bcl-2，mkk3，p-mkk3，p38，p-p38，Msk1，hsp27，的表达情况进行评价，使用光学显微镜(Nikon，eclipse)观察图像。
随后使用小鼠血清根据IL-6ELISA试剂盒，IL-10ELISA试剂盒(博研生物有限公司，中国南京)的说明进行操作，并在相应的波长下检测。
统计方法
体外实验独立地进行至少三次。所有动物研究均在每组中用至少五只小鼠进行。使用GraphPadPrism7.0软件进行统计分析。两组之间的差异通过非配对学生t检验计算。所有数据均报告为平均值±s.d。统计学差异定义为*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
实施例2
Rg1-CDs的表征
本发明实施例1采用水热法从Rg1中成功制备了具有抑制肿瘤细胞生长功效的Rg1-CDs。通常CDs由于共轭π结构的量子尺寸效应，本征态和缺陷态，或是sp2局域化的电子空穴等结构原因，在反应过程中都会出现明显的紫外吸收。紫外吸收峰强或峰位的变化是推测判断这些超小尺寸CDs成核、生长和性质的重要依据。
参见图2，图2为本发明制备的Rg1-CDs的理化性质表征图。其中，A为Rg1和Rg1-CDs溶液的紫外可见吸收光谱图(插图分别为Rg1-CDs在日光(左)和365nm紫外光(右)照射下的照片)；B为Rg1-CDs的荧光光谱图(PL)；C为Rg1-CDs的TEM图像，标尺为20nm；D为TEM粒径分布统计图；E为Rg1-CDs荧光衰减曲线图；F为Rg1-CDs溶液的傅里叶红外光谱图；G为Rg1-CDs的XPS谱；H和I为Rg1-CDs的高分辨XPS谱，包括C1s(H)和O1s(I)。
紫外光谱如图2中所示，制备前的Rg1溶液几乎没有紫外吸收峰，没有共轭结构。制备的Rg1-CDs在日光下为淡黄的液体，在283nm处表现出明显的吸收带，说明Rg1-CDs合成过程中，Rg1分子之间出现了一些官能团上面的变化，Rg1-CDs体系的表面或内部产生了一些共轭结构，可能归因于sp2域的π–-π*跃迁。在Rg1-CDs的PL光谱检测发现Rg1-CDs具有碳点独有的荧光激发依赖性，在360nm激发的Rg1-CDs在230-500nm范围内产生强烈的PL发射，最大值约为440nm。透射电子显微镜(TEM)分析Rg1-CDs，表明它们具有均匀的尺寸和良好的分散性，平均粒径为3.96±1.44nm。这种小粒径使Rg1-CDs能够轻松突破某些生物屏障。
使用傅里叶变换红外(FTIR)和X射线光电子能谱(XPS)光谱分析Rg1-CDs表面的化学组成和官能团进行表征分析。红外谱图显示，Rg1-CDs在3370、2925、2853、1780-1550、1458、1386、1075、和1040cm-1处有吸收峰，这些归因于O-H、C-H、C＝O和C-O的振动和转动，由此推断，Rg1-CDs的表面富含一定的羟基和羰基结构。XPS结果发现Rg1-CDs中，C元素电子结合能位置为284.8eV对应C-C/C＝C键；电子结合能位置为286.3eV对应C-O键；电子结合能位置为287.5eV对应C＝O键。O元素电子结合能位置为531.4eV对应C-O键，电子结合能位置为532.8eV对应C＝O键。由此推断，Rg1-CDs优异的水溶性可能归因于其表面的亲水性官能团丰富的亲水基团，如羟基(-OH)、羧基(-COOH)等。总体而言，FTIR和XPS数据非常吻合，强烈表明本发明中合成的Rg1-CDs具有无需任何化学修饰即可促进水溶性的特征性官能团。
本发明还测定了合成的Rg1-CDs在不同条件下的稳定性。首先测试了Rg1-CDs在不同浓度的NaCl和KCL液体中的稳定性，发现Rg1-CDs在0-1.0mol/LNaCl和KCL溶液中保持稳定。
参见图3，图3为本发明制备的Rg1-CDs在不同浓度NaCl、KCl溶液中的荧光光谱图和归一化图。
参见图4，图4为本发明制备的Rg1-CDs在不同PH和365nm UV灯下照射光谱图和归一化图。
从图3中可以很明显的看到NaCl、KCl浓度的增加几乎不影响Rg1-CDs的荧光强度，表明该Rg1-CDs具有较好的抗盐能力，为其后期用于生物成像等领域奠定一定的基础(正常体液中的生理盐的浓度约为0.15M)。此外，在一系列pH值下研究了Rg1-CDs稳定性，即使在pH强酸强碱性条件下(pH1～9)，仍表现出优异的荧光特性，发射峰位置未发生偏移，即该Rg1-CDs无pH依赖性。
如图4所示，Rg1-CDs在360nm紫外线照射0到7小时，结果发现Rg1-CDs的荧光强度未发生明显变化，说明它具有很好的抗光干扰性能，可用于癌细胞内稳定成像。
另外，Rg1-CDs分别在4℃下保存0-7d和37℃下保存0-5h，Rg1-CDs的荧光强度基本保持稳定，具有较好的储存能力。结合Rg1-CDs的结构特性以及小粒径和稳定性证实了合成的Rg1-CDs可能具有重要的生物学价值。
实施例3
Rg1-CDs对A549细胞活性的影响
参见图5，图5为本发明制备的Rg1-CDs对A549细胞活力的影响图。其中，A为CCK-8检测Rg1-CDs对A549细胞增殖活力；B为CCK-8检测Rg1对A549细胞增殖活力(无增殖或抑制作用)；C为Rg1-CDs对293t细胞增殖活力；D为CCK-8检测Rg1-CD对LO2细胞增殖活力；E为Rg1-CD对A549细胞形态的影响，标尺200μm；F为A549细胞与Rg1-CDs(100μg/mL)共同孵育不同时间(0、6、12、24、48h)后的荧光显微镜图像，标尺400μm。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001compared to 0μg/mL。
本发明表明了Rg1-CDs具有抑制人非小细胞肺癌A549细胞增殖的作用。本发明用CCK-8比色法测定了不同浓度的Rg1-CDs(0、30、50、70和90μg/mL)对A549细胞的作用，CCK8实验结果显示，不同浓度Rg1-CDs(30、50、70和90μg/mL)处理细胞48h后，对A549细胞的增殖有明显抑制作用，且随着浓度的升高，抑制率逐渐升高，具有明显的剂量依赖性，当给药浓度达到90ug/mL时抑制率为66.96％(p<0.05)说明Rg1-CDs处理组对A549细胞的增殖有明显的抑制作用。相同浓度的人参皂苷Rg1(0、30、50、70和90μg/mL)对A549无抑制作用。推测分子状态的Rg1不能通过细胞转运被有效摄取并提供有效的药效。相反，由于Rg1-CDs的纳米尺寸和纳米结构，能更好的透过细胞膜，被肿瘤细胞摄取，因此，Rg1-CDs对A549细胞的抑制效率比Rg1分子高得多。此外，由于Rg1-CDs的物质是天然植物合成，此浓度(30、50、70和90μg/mL)条件下Rg1-CDs对肝肾正常(293t，LO2)细胞几乎无生物毒性。为Rg1-CDs抗非小细胞肺癌提供了良好理论基础。
通过显微镜镜下观察不同浓度Rg1-CDs(0、30、50、70和90μg/mL)处理组A549细胞形态，如0μg/mLRg1-CDs组细胞大小均一，细胞核清晰且体积较大，呈正圆形，并有完整的细胞膜包被。与0μg/mLRg1-CDs组细胞相比，Rg1-CDs(50、70、90μg/mL)处理组随着浓度的不断升高，细胞大小不均并伴随体积缩小的现象，细胞形态变为不规则状态，细胞膜皱缩，视野下细胞数明显减少，出现细胞碎片甚至破裂现象。
采用克隆形成实验观察Rg1-CDs对A549细胞增殖的影响。本发明发现与0μg/mLRg1-CDs组比较，不同浓度Rg1-CDs(30、50、70和90μg/mL)处理A549细胞后细胞群落变小，克隆数降低，说明细胞克隆形成能力和数量明显受到抑制，且具有剂量依赖性。
为了进一步探索Rg1-CDs对A549细胞的抑制作用，通过荧光倒置显微镜监测Rg1-CDs在不同孵育时间进入细胞的情况(图5F)，在荧光图像中可以看出Rg1-CDs能够被细胞摄取，随着孵育时间的延长，A549细胞逐渐缩小变圆，A549细胞逐渐凋亡。在荧光显微镜下，Rg1-CDs进入A549细胞中，主要集中在细胞质，在6h和12h之间，系统的荧光强度逐渐增加，表明Rg1-CDs的内化数量随时间增加。12h细胞摄取的碳点含量最高，在这种情况下，一些细胞萎缩，一些细胞膜破裂，一些细胞形状被破坏，细胞生长受到抑制，在12～48h之间，体系的荧光强度下降，这可能是由于Rg1-CDs在细胞内的反应和结构破坏所致，导致细胞逐渐萎缩死亡。到48小时，在系统中检测到很少的荧光。虽然Rg1-CDs在细胞中发挥药用作用，但它们也可以通过胞吐作用代谢出来。孵育体系中荧光强度的变化表明Rg1-CDs对A549细胞的抑制作用具有时间依赖性。
实施例4
Rg1-CDs对A549细胞迁移能力的影响
划痕实验也是对细胞迁移能力的常用检验手段之一，因此本发明也采用了这一实验方法观察了Rg1-CDs处理后，细胞划痕后的愈合能力。
参见图6，图6为本发明制备的Rg1-CDs对A549细胞迁移能力的影响。其中，A为划痕实验；B为侵袭实验；C为划痕实验迁移率统计柱形图；D为侵袭实验迁移细胞数量统计柱形图，标尺为400μm。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001compared to 0μg/mL。
通过划痕实验检测不同浓度Rg1-CDs对非小细胞肺癌细胞愈合能力的影响，结果显示，不同浓度Rg1-CDs(0、30、50、70和90μg/mL)处理24h后划痕面积分别为61％、50％,39％、36％、22％，处理48h后划痕面积分别为90％、64％、60％、56％、41％。与0μg/mLRg1-CDs组对比，Rg1-CDs(50、70、90μg/mL)处理组划痕24h后愈合能力下降，(p<0.05)，48h后Rg1-CDs(30、50、70、90μg/mL)处理组愈合能力明显下降，具有统计学意义(p<0.05；p<0.01)。表明Rg1-CDs处理后能明显抑制A549细胞的于愈合能力。
Transwell实验用于评估细胞的迁移能力，检测不同浓度Rg1-CDs对非小细胞肺癌细胞A549迁移能力的影响。如图6中B和D所示，纵轴表示穿过transwell半透膜的细胞数所占百分比，每种细胞的对照组细胞数标准化为100％。在A549细胞中，与0μg/mLRg1-CDs组对比，不同浓度Rg1-CDs(30、50、70、90μg/mL)处理的A549细胞迁移能力明显降低，并呈现明显剂量依赖性，Rg1-CDs(70、90μg/mL)处理组迁移率在24h分别达到17.81％，4.87％，在48h分别达到41.44％，19.63％，与0μg/mLRg1-CDs组相比，迁移能力明显下降，具有统计学意义(p<0.01)，表明说明Rg1-CDs处理后能明显抑制A549细胞的迁移能力。
实施例5
流式细胞仪检测Rg1-CDs对A549细胞周期和凋亡的影响
参见图7，图7为本发明制备的Rg1-CDs对A549细胞凋亡和细胞周期的影响图。其中，A为周期图，周期分布统计柱形图；B为细胞凋亡图，早凋和晚凋百分比柱形图。n＝3*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001compared to 0μg/mL。
采用PI单染法检测细胞周期。Rg1-CDs处理48h后，图7显示，与0μg/mL Rg1-CDs组相比，Rg1-CDs(30、50、70μg/mL)处理组对A549细胞的G1期，S期和G2期的变化不明显(P>0.05)，而Rg1-CDs浓度达到90μg/mL时对S期细胞无明显影响，能引起A549细胞显著停滞在G2期，G2期细胞比例为31.34％，G1期减少，细胞比例为45.26％，(p<0.01，p<0.001)，具有统计学意义。说明Rg1-CDs成功诱导A549细胞产生明显的G2期阻滞。
为检测Rg1-CDs是否通过促进细胞凋亡对A549细胞的产生抑制作用，本发明进行流式细胞仪检测。用不同浓度Rg1-CDs(0、30、50、70和90μg/mL)处理A549细胞48h后，结果如图7所示，与0μg/mLRg1-CD组对比，当Rg1-CDs浓度为30、50μg/mL时有诱导细胞凋亡的趋势，A549细胞的早凋率和晚凋率分别为3.23％，5.58％和7.45％，7.87％((p>0.05))。70μg/mL处理时晚凋比例升高，早凋率和晚凋率分别为13.73％和12.25％(p＜0.05)，90μg/mL处理时早凋和晚凋比例明显升高，早凋率和晚凋率分别为24.03％和20.4％(p<0.01，P<0.001)，以上结果提示Rg1-CDs能显著诱导A549细胞凋亡，且呈剂量依赖性。
实施例6
Rg1-CDs与A549共同孵育对A549细胞中ROS、TMRE、Ca2+含量的影响
通过荧光显微镜观察给药后A549细胞中活性氧(ROS)荧光强度的变化。用不同浓度(0、30、50、70和90μg/mL)的Rg1-CDs处理后的A549细胞，随着Rg1-CDs浓度的增加，细胞内红色荧光增强，细胞内ROS水平增加，且呈现浓度依赖性。与0μg/mL Rg1-CDs相比，当Rg1-CDs浓度达50μg/mL后细胞内平均荧光强度增强(p<0.05)，当Rg1-CDs浓度达70和90μg/mL后细胞内红色荧光加强，细胞凋亡数量减少。表明随着Rg1-CDs浓度增加细胞内ROS的积累增加。ROS是氧化能量代谢的一种副产物，在调节细胞功能，如增殖、分化、迁移和死亡方面至关重要。细胞内的ROS水平是细胞单位机体代谢正常的明显指标之一，同时ROS含量细胞的凋亡情况密切相关。ROS在癌变过程中的能量代谢、细胞凋亡调节和细胞信号传导中发挥重要作用，过多的ROS产生会杀死癌细胞。例如，walsuronoid B通过ROS/p53介导的线粒体去极化诱导细胞凋亡，并通过G2/M期阻滞抑制细胞增殖。Homobrassinin对人结直肠癌细胞(Caco2)具有ROS依赖性抗增殖作用，并通过ROS生成和线粒体功能障碍诱导细胞凋亡。细胞内ROS也被认为是各种癌症中细胞凋亡中p38-MAPK信号通路的重要调节剂。例如，在肺癌细胞中，百草枯引起的细胞内ROS积累激活p38-MAPK，从而调节线粒体凋亡途径。
Ca2+荧光探针检测实验结果表明，Rg1-CDs处理细胞48h后0μg/mL Rg1-CDs组细胞几乎为荧光识别，随着Rg1-CDs浓度的增加，浓度为30和50μg/mL时，部分细胞显示绿色荧光，而浓度达到70和90μg/mL时，细胞内绿色荧光逐渐增强(p<0.001)，且细胞形态皱缩凋亡明显。表明细胞内Ca2+浓度增加。此外质膜的透化是凋亡细胞的关键特征，可以通过测量细胞内酶LDH的释放在组织培养环境中对其进行量化。通过试剂盒检测A549细胞中LDH活力，结果发现A549细胞中LDH活力升高，呈剂量依赖性(p<0.05)。Rg1-CDs处理后细胞内Ca2+荧光强度明显增加(p<0.05)，表明Rg1-CDs可以促进LDH的释放并增加细胞内Ca2+水平。肿瘤的凋亡由多种因素调控，Ca2+作为细胞内重要的第二信使，主要储存在内质网中。当细胞受到外源性化合物的作用时，内质网内Ca2+代谢失衡，功能紊乱，诱导内质网应激。
内质网应激导致线粒体膜电位降低，从细胞荧光变化可判断线粒体膜电位的变化。TMRE检测线粒体膜电位结果表明，Rg1-CDs处理细胞48h后0μg/mL Rg1-CDs组细胞几乎所有细胞均识别到红色荧光，用不同浓度Rg1-CDs处理后的A549细胞，Rg1-CDs处理后红色荧光细胞比例减少，即随着Rg1-CDs浓度的增加，A549细胞数量凋亡减少，且细胞内红色荧光减弱，当浓度达到90μg/mL时，明场观察到的细胞，也检测不到红色荧光(p<0.05)，表明随着Rg1-CDs浓度的增加，细胞中线粒体膜电位随药物浓度增加而逐渐降低。
线粒体钙超载和线粒体膜电位去极化是细胞死亡的关键检查点。线粒体钙水平由线粒体钙单向转运蛋白复合物和线粒体通透性转换孔控制。在肝癌中，协调良好的线粒体稳态可促进肿瘤生长。然而，线粒体钙调节失衡会导致线粒体肿胀和线粒体外膜破裂。然后，细胞色素c从线粒体中释放并引发内在线粒体凋亡。线粒体膜电位的维持是线粒体生物能学的一个指标，因为它对于ATP合成至关重要，并深入参与ROS的生成。因此，多种癌症治疗都以线粒体完整性为目标。例如，米托坦影响线粒体生物能，并通过甲状腺癌中线粒体膜去极化诱导细胞凋亡。
综上所述，Rg1-CDs能够显著提高细胞内ROS浓度，促进Ca2+浓度增加以及诱导线粒体膜电位的下降，从而导致细胞的凋亡，且这种作用呈现浓度依赖性。
Rg1-CDs对caspase依赖的途径的影响
为了确定Rg1-CDs诱导细胞凋亡的相关途径，本发明研究了Rg1-CDs是否通过caspase依赖的途径诱导A549细胞凋亡。将Rg1-CDs作用于A549细胞48h，WB法检测细胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3(Cas-3)、Caspase-9(Cas-9)、细胞色素c(Cyto-c)的表达。与Model组相比Rg1-CDs处理后，与Bcl-2蛋白的表达水平受到显著抑制(p<0.05)，而促凋亡蛋白Bax和Cas-3、Cas-9、Cyto-c的表达则上调(p<0.05)。结果表明，Rg1-CDs促进粗凋亡蛋白Cas-3、Cas-9、Cyto-c的表达，并使Bcl2/Bax比值倒置。
Caspase依赖的途径是诱导细胞凋亡的重要机制之一，以Cyto-c的释放为特征，通过降低抗凋亡蛋白Bclxl的水平可以将Cyto-c释放到细胞质中，表明内在途径被激活。
实施例7
Rg1-CDs对体内小鼠肿瘤的抑制作用的影响
为了观察Rg1-CDs对体内肿瘤生长的影响，本发明通过裸鼠体内成瘤实验进一步研究，首先本发明研究了Rg1-CDs在小鼠体内的急性毒性安全性。
参见图8，图8为本发明制备Rg1-CDs的生物安全性验证图。其中，A为小鼠体重增长曲线；B-F为血清(ALT、AKP、AST、BUN、CRE)生化指标分析；G为急性毒性试验小鼠主要器官(心、肺、脾、肝和肾脏)的H&E染色切片，比例尺为400μm。
按规定剂量经尾静脉向小鼠注射生理盐水和Rg1-CDs(140mg/kg)共两次，分析了Rg1-CDs治疗对健康小鼠体重的影响。如图8所示，各组小鼠的体重没有显着差异，表明Rg1-CDs不会影响小鼠的健康。此外，本发明采用试剂盒检测了小鼠的血液理化参数，如图8所示，用Rg1-CDs给药的小鼠的血液生化参数丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、血尿素氮(BUN)和血清肌酐(CRE)。与对照组相近均在正常范围内，表明Rg1-CDs不会对小鼠的血液生化指标造成影响，最后，本发明在第8天对小鼠的主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾)进行苏木精-伊红(H&E)染色分析。图8显示接受治疗的小鼠的主要组织和器官没有明显的形态变化，表明Rg1-CDs具有良好的生物相容性。
参见图9，图9为本发明制备的Rg1-CDs对A549荷瘤小鼠的抑制作用。其中，A为小鼠肿瘤CT扫描图；B为小鼠肿瘤的解剖照片；C为小鼠的肿瘤体积的统计图(根据每两日游标卡尺跟踪测量所得)；D为小鼠的肿瘤重量的统计图；E为小鼠重量统计图；F为H&E染色、TUNEL染色图像、肿瘤标志蛋白(CD31、CDK4、Ki67、NSE)的免疫组化染色图像，比例尺为400μm，*p<0.05；**p<0.0；***p<0.001compared to Model。
为了观察Rg1-CDs对体内肿瘤生长的影响，本发明研究不同浓度Rg1-CDs对裸鼠体内移植瘤生长情况，以BALB/c裸鼠为研究对象，皮下注射A549细胞建立荷瘤模型，尾静脉注射Rg1-CDs同时以抗肿瘤药物顺铂(CDDP)为阳性对照，并于第21d通过CT活体观察荷瘤小鼠的肿瘤大小。
通过CT扫描观察，相较于Model组，CDDP和Rg1-CDs组小鼠瘤体积减小，与肉眼明场观察结果一致。通过游标卡尺每两天测量小鼠瘤实时体积作图发现，与对照组裸鼠瘤相比，Rg1-CDs组的移植瘤生长速度明显小于Model组(p<0.05)，CDDP组治疗后小鼠瘤体积下降没有Rg1 CDs组体积下降明显。给药21d后取出裸鼠皮下肿瘤称重，与Model组相比，CDDP组肿瘤重量减小(p<0.05)，Rg1-CDs组小鼠瘤重量明显减少(p<0.001)，以上结果说明Rg1-CDs对荷瘤裸鼠体内肿瘤有较好的抑制作用且抑制效果优于阳性对照药肿瘤。
随后记录Control组、Control+Rg1 CDs组、Model组、顺铂组和Rg1 CDs组中小鼠状态和体重变化，以评估Rg1 CDs的毒性。Control组、Control+Rg1CDs组、Model组和Rg1 CDs组组小鼠的状态良好，但其体重在稳定上升，而Rg1-CDs组荷瘤裸鼠的体重较Control组稍低，无显著性差异(p>0.05)，这也表明Rg1-CDs在发肺癌治疗过程中几乎没有产生毒副作用，不同的是CDDP组小鼠的体重减轻幅度较为显著(p<0.01)。在对CDDP组小鼠的生长情况持续观察发现，在注射完CDDP后，小鼠变得不活跃，这可能是由于CDDP的毒副作用较大，导致CDDP组小鼠体重显著减轻。通过将Control组、Control+Rg1 CDs组、Model组、CDDP组和Rg1-CDs组主要器官的切片照片相互对比发现CDDP组对肝组织有轻微损伤，而Rg1-CDs治疗组的主要器官均没有出现明显的损伤，进一步说明Rg1-CDs的生物安全性较好。
为了评估Rg1-CDS对肿瘤的病理损伤，将裸鼠皮下摘除的部分瘤体组织进行石蜡包埋，通过免疫组化染色观察Rg1-CDs处理后对凋亡相关蛋白影响。伊红染色(H&E)显示，Model组小鼠肿瘤瘤细胞异型性明显，大小不等，形状各异，染色质明显增多，细胞核深染，肿瘤细胞排列紧密。CDDP组可见肿瘤组织坏死区域有所增加，细胞异型性减轻，Rg1-CDs组肿瘤组织坏死区域增加显著，说明Rg1-CDs能通过促进肿瘤组织坏死，增强对肿瘤的清除作用
在本发明的研究中，TUNEL法显示模型组几乎不存在阳性细胞(凋亡细胞，即细胞核显棕黄色的细胞)，细胞排列紧密，呈蓝色；Rg1-CDs组细胞排列疏松，细胞呈棕色，细胞体积小，Rg1-CDs处理组小鼠肿瘤组织中的棕色染色比Control组和CDDP组更强，这表明Rg1-CDs处理组小鼠的凋亡率更高。综上所述，这些结果表明Rg1-CDs在体内抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡。
本发明进一步通过免疫组化染色观察Rg1-CDs处理后裸鼠肿瘤组织相关标志蛋白表达情况，结果发现模型组CD31、CDK4、Ki67、NSE高度表达，CDDP组CD31、CDK4、KI67、NSE表达弱阳性，中高度表达，Rg1-CDs组CD31、CDK4、KI67轻度表达，NSE中高度表达。因此，本发明认为Rg1-CDs处理后，可以抑制肺癌细胞凋亡和促进细胞增殖。这进一步验证了Rg1-CDs在参与体内调控肺癌细胞生长和转移机制研究方面发挥着重要作用。
同时，本发明通过免疫组化在Model组和Rg1-CDs组体内肿瘤层面上测定了caspase和MAPK通路相关蛋白的表达水平，发现其对Bcl-2、Bax、Cas-3、Cas-9、Cyto-c、p-mkk3、mkk3、p-p38、p38、hsp27和Msk1蛋白的表达水平与细胞实验一致，再一次证明了Rg1-CDs能通过调控Caspase和MAPK通路抑制肿瘤生长。
参见图10，图10为本发明制备的Rg1-CDs对裸鼠血清中细胞因子(IL-6、IL-10)水平的影响。其中，##p<0.01compared to Control；*p<0.05；**p<0.01；compared to Model。
本发明通过酶联免疫测定法测量典型促炎细胞因子(如TNF-α、IL-6)和抗炎细胞因子(如IL-10)的水平。结果发现(图10所示)，与对照组相比，模型组血清中促炎因子水平增加(p<0.01)和抗炎因子水平减少(p>0.05),与模型组相比，Rg1-CDs组血清中促炎因子水平减少(p<0.05)和抗炎因子水平有增加趋势(p<0.01)。说明Rg1-CDs能调节IL-6和IL-10作用之间的不平衡。
本发明以人参皂苷Rg1为唯一反应物合成了具有荧光激发依赖性的，水溶性官能团丰富，易于被细胞吸收的2-5nm范围的Rg1-CDs，Rg1-CDs在(0～1.0mol/L)的NaCL和KCL溶液里，在强酸强碱和365nm的UV灯照射下保持良好的稳定性，并能在37℃和4℃环境中长期保存。体外实验表明该Rg1-CDs对人非小细胞肺癌细胞A549细胞的生长具有明显的抑制作用且具有明显的剂量依赖性，并能抑制A549细胞的克隆活力和迁移能力。通过流式细胞仪检测发现高剂量Rg1-CDs(90μg/mL)能通过诱导G2期阻滞，细胞凋亡来抑制A549细胞的生长，还能通过提高ROS水平和Ca2+释放，降低线粒体膜电位水平，启动Caspase经典凋亡通路促进细胞凋亡。这表明细胞凋亡可能是抗肿瘤药物的一种治疗策略。
本发明通过蛋白组学筛选到338个差异表达蛋白，对这些差异蛋白进行KEGG信号通路预测，发现差异蛋白主要集中在MAPK信号通路上。接着通过WB检测发现Rg1-CDs能启动MAPK通路中的相关蛋白从而发挥抑制细胞增殖，促进细胞凋亡的作用，该碳点对A549的抑制效果在皮下荷瘤体内实验也被进一步证明，其抑制肿瘤生长效果优于化疗药物顺铂并具有较低的生物毒性，HE染色和Tunel染色发现Rg1-CDs治疗能明显促进A549细胞凋亡，免疫组化实验证明Rg1-CDs能降低A549肿瘤中的肿瘤标志物(CD31、CDK4、Ki67、NSE)的表达。同时免疫组化测定发现其对Caspase和MAPK通路相关蛋白的调控与体内实验一致。还能在炎症方面能调控促炎因子和抗炎因子之间的不平衡。弥补CDDP高促炎特性导致的副作用。
本发明发现了一种低毒性的天然药物构建的生物活性CDs，在不使用任何添加剂进行表面钝化的情况下表现出强荧光和高稳定性。在体内体外均能有效抑制A549细胞的生长，促进凋亡。本发明在技术上有希望推进纳米医学治疗癌症的进展。
以上对本发明提供的人参皂苷Rg1碳纳米点在抑制人非小细胞肺癌细胞中的应用进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，包括最佳方式，并且也使得本领域的任何技术人员都能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统，和实施任何结合的方法。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定，并可包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有不是不同于权利要求文字表述的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的文字表述无实质差异的等同结构要素，那么这些其他实施例也应包含在权利要求的范围内。

Claims (10)

1.人参皂苷Rg1碳纳米点在制备抑制人非小细胞肺癌细胞的药物制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷Rg1碳纳米点的表面含有羟基、羰基和羧基中的一种或多种；
所述人参皂苷Rg1碳纳米点在pH为1～9时，具有稳定性；
所述人参皂苷Rg1碳纳米点无pH依赖性。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷Rg1碳纳米点在NaCl和/或KCl溶液中具有稳定性；
所述人非小细胞肺癌细胞为A549细胞；
所述人参皂苷Rg1碳点对A549细胞具有特异性抑制作用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NaCl和/或KCl溶液的浓度为0.01～2mol/L；
所述稳定性包括荧光稳定性；
所述人参皂苷Rg1碳纳米点的直径为1～10nm。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制包括抑制细胞活性和/或细胞迁移能力；
所述人参皂苷Rg1碳纳米点的给药浓度为10～100μg/mL；
所述人参皂苷Rg1碳纳米点对293t细胞和/或LO2细胞没有增殖或者抑制作用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷Rg1碳纳米点的制备方法，包括以下步骤：
1)将人参皂苷Rg1和水混合后，得到混合液；
2)将上述步骤得到的混合液进行水热反应后，得到人参皂苷Rg1碳点水溶液。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述混合液中人参皂苷Rg1的浓度为0.1～10mg/mL；
所述水热反应的温度为90～220℃；
所述水热反应的时间为0.5～12h；
所述水热反应后还包括过滤步骤；
所述人参皂苷Rg1碳点水溶液为具有中药味的透明液体。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷Rg1碳纳米点还包括人参皂苷Rg1碳纳米点荧光探针；
所述荧光探针包括细胞荧光探针；
所述荧光探针为追踪细胞、标记细胞和细胞成像中的一种或多种的荧光探针。
9.根据权利要求1～7任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物制剂包括人参皂苷Rg1碳点和药学上可接受的辅料；
所述药物制剂对A549细胞具有特异性抑制作用。
10.根据权利要9所述的应用，其特征在于，所述药物制剂对293t细胞和/或LO2细胞没有增殖或者抑制作用；
所述药物制剂的剂型包括口服制剂、注射剂、栓剂、吸入剂或可直接应用于肿瘤的剂型；
所述药物制剂中，所述人参皂苷Rg1碳纳米点的浓度为10～200μg/mL。
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