CN114869869B - Eugenol在预防和/或治疗骨关节炎中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Eugenol在预防和/或治疗骨关节炎中的应用，并通过体内实验和体外实验证明了Eugenol对骨关节炎具有显著的治疗效果，可有效保护软骨和软骨下骨、有效抑制软骨细胞的凋亡、有效抑制软骨细胞外基质的降解，且具有毒副作用小、代谢残留少、安全性高等优点。本发明为骨关节炎治疗药物的研究和开发，提供了一种全新的思路和策略，应用前景广阔。

Description

Eugenol在预防和/或治疗骨关节炎中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及Eugenol在预防和/或治疗骨关节炎中的应用，更具体地，本发明涉及Eugenol在制备用于预防和/或治疗骨关节炎的药物中的应用。

背景技术

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)作为一种常见的慢性退行性关节疾病，病因复杂，病理多见关节软骨退变损伤，其影响关节周围的各种组织，例如关节软骨、软骨下骨、滑膜和韧带，以渐进性关节疼痛、肿胀、僵硬甚至关节畸形为主要症状，以软骨基质降解为主要特点，好发于人体全身所有大小关节，如常见的髋关节、膝关节、肩关节、脊椎关节以及手指和足趾关节等。骨关节炎的发病与年龄、肥胖、炎症、创伤、遗传等多种因素有关。该病多发生于中老年人，且患病率随年龄而增加，此外，女性发病率高于男性。由于极高的患病率和致残率，及疾病所致的工作能力和生活能力的丧失，骨关节炎已成为了危害人类健康、影响社会发展的主要疾病之一。虽然学者们已经对骨关节炎进行了大量的研究，但对其发病机制仍未得到统一，目前临床治疗也只是进行对症治疗，尚未找到有效的措施进行干预以减缓或阻止骨关节炎患者病情的发展。因此，开发一种新型有效的可用于骨关节炎治疗的药物具有重要意义。

丁香酚(Eugenol)，化学名为4-烯丙基-2-甲氧基苯酚。别名丁子香酚、2-甲氧基-4-(2-丙烯基)苯酚，是一种具备丁香花气味的一类液体，为丁香罗勒、丁香和众香子等精油的主要组成成分。现有技术中多以丁香叶制备的丁香叶油为原料，经过碱液处理，然后萃取，再经过酸化，最后分液得到丁香酚。丁香酚是丁香油中的有效抑菌活性成分，众多研究表明，丁香酚作为一种天然香料，其抑菌效果显著，对根尖周炎、干槽症有良好疗效，并可应用于根管消毒与根管填充；丁香酚有良好的抗真菌效果，且安全无毒无刺激，可应用于口腔念珠菌病及口腔溃疡的治疗；丁香酚具有较好的麻醉及镇痛功效，对于深龋和牙髓炎可有效镇痛，并能辅助牙髓失活；丁香酚可有效抑制致龋菌的细胞外葡聚糖合成，从而达到清除牙菌斑，清洁口腔，预防龋齿的目的。此外，近年来丁香酚已被证实可在人体的多个系统和器官发挥抗氧化、抗凋亡等作用，同时具有毒副作用小、代谢残留少、安全性高等优点。

迄今为止，尚未见丁香酚在预防和/或治疗骨关节炎中的相关报道。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供了Eugenol在预防和/或治疗骨关节炎中的应用，为本领域提供一种新型低毒高效的骨关节炎治疗药物，以克服目前本领域存在的上述技术问题。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

本发明的第一方面提供了丁香酚作为活性成分在制备用于治疗和/或预防骨关节炎的药物中的应用。

进一步，所述丁香酚通过Jak-STAT信号通路抑制软骨细胞的凋亡以及降低ADAMTS4的表达而抑制软骨细胞外基质的降解。

进一步，所述丁香酚降低ADAMTS4、CTX-II的表达，有效保护软骨和软骨下骨。

进一步，所述药物包含治疗有效量的丁香酚、药学上可接受的载体和/或辅料。

在本发明中的优选实施方案中，所述丁香酚的使用剂量为0.001mg/kg-100mg/kg。

在本发明中的另一优选实施方案中，所述丁香酚的使用剂量为5mg/kg-10mg/kg。

在本发明中的另一优选实施方案中，所述丁香酚的使用剂量为5mg/kg。

在本发明中的另一优选实施方案中，所述丁香酚的使用剂量为10mg/kg。

在本发明中，所述“丁香酚”，同“Eugenol”，分子式为C₁₀H₁₂O₂，分子量为164.21，为丁香罗勒、丁香和众香子等精油的主要组成成分，为无色至淡黄色稠性油状液体，在空气中和光线照射下容易发生氧化变暗发稠。丁香酚呈强烈丁香香气和特殊辛辣气味。相对密度d₄ ²⁰1.0664，折射率n_D ²⁰1.5410，旋光度-1°30'，沸点253.1-253.4℃，闪点约104℃，冻点10.3℃。易溶于乙醇、乙醚、氯仿和挥发性油，难溶于水。丁香酚具有较多的生物学活性，其已被证实可在人体的多个系统和器官发挥抗氧化、抗凋亡等作用。目前尚未见丁香酚用于治疗和/或预防骨关节炎的相关研究或报道，本发明为首次报道。

在本发明中，所述“治疗和/或预防”，是指以治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症为目的对患者进行的医学管理。该术语包括积极疗法，即专门以改善疾病、病理状态或病症为目的的治疗，并且还包括病因治疗，即以除去相关疾病、病理状态或病症的病因为目的的治疗。此外，该术语还包括姑息治疗，即设计用于缓解症状而非治愈疾病、病理状态或病症的治疗；该术语还包括预防性治疗，即以最大程度降低或者部分或完全抑制相关疾病、病理状态或病症的发展为目的的治疗；以及支持性治疗，即用于补充另一种以改善相关疾病、病理状态或病症为目的的特定疗法的治疗。具体而言，所述“治疗”是指为了阻止和降低疾病的发生或发展，使疾病病程的发展或加重得以抑制、遏制、减轻、改善、减缓、停止、延迟或反转，所描述的保持和/或用药时的疾病的、紊乱的或病理学状态的各种指标包括减轻或减少症状或并发症，或治愈或消除疾病、紊乱或状况；所述“预防”是指在未被临床标准认定的疾病前，各种用于防止疾病发生或发展的手段或措施，包括医学、物理或化学的方法，以阻止和降低疾病各种症状的发生或发展。

在本发明中，所述“治疗有效量的”，是指具有治疗效果的量或在治疗对象中产生治疗效果所需要的量。例如，药物治疗上或药学上有效量是指产生需要的治疗效果所需要的药物的量，治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物研究和/或体外研究的结果来反映。药学上有效量取决于几个因素，包括(但不限于)：治疗对象的特征因素(如治疗对象的身高、体重、性别、年龄和用药史)、罹患疾病的严重程度。

进一步，所述药学上可接受的载体和/或辅料在Remington's PharmaceuticalSciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或其生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，如此配制的药物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药。

进一步，所述药物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、受试者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗和/或预防有效的给药剂量。

进一步，所述药物中还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等，如需要，也可以向药物中添加其它材料，上述药物可以制成多种剂型，包括(但不限于)：溶液剂、混悬剂、乳剂、滴丸、喷雾剂、透皮剂、乳膏剂、胶冻剂、凝胶剂、片剂、皮下埋植剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、脂质体、口含片、栓剂、冻干粉针剂等，上述各种剂型的药物均可以按照药学领域中的常规制备方法进行制备，使用上述剂型可以经注射给药，所述注射给药包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腔内注射等；呼吸道给药，如经鼻腔给药；粘膜给药；透皮给药等。此外，本领域技术人员清楚药物的给药方式、给药剂型、给药剂量受受试者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、排泄速度及反应灵敏性等众多因素的影响，因此，本发明中所述的药物的给药方式、给药剂型、给药剂量并不局限于本发明中所列举出的给药方式、给药剂型、给药剂量。

进一步，所述ADAMTS4，是指带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素与金属蛋白酶4(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif 4，ADAMTS4)，带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶家族(Adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)是引起骨关节炎软骨细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)降解的主要蛋白酶类，其中，ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS15等ADAMTS类主要引起关节软骨ECM中蛋白聚糖的降解。蛋白聚糖可使关节软骨具有很好的弹性和抗压性，蛋白聚糖的丢失、降解引起ECM合成代谢与分解代谢的失衡被认为在骨关节炎早期病变中起着重要的起始作用。在众多的ADAMTS中，ADAMTS4和ADAMTS5是引起蛋白聚糖降解的主要蛋白聚糖酶，现已证明在骨关节炎患者的软骨中ADAMTS4的表达显著高于正常人，ADAMTS4是引起聚蛋白多糖酶降解的重要酶。

进一步，所述CTX-II，是指关节软骨标志物II型胶原羟基端交联肽(C-terminalcrosslinking telopeptide of typeⅡcollagen，CTX-Ⅱ)，CTX-II为共价键组成的三螺旋片段，可在组织蛋白酶作用下产生小分子多肽。CTX-II完全来自成熟的结构胶原，并以小肽形式全部进入尿液。EKGPDP小肽或Cartilaps来自CTX-II的中间区域，是蛋白降解产生的6个氨基酸序列的线性表位，只存在于II型胶原中，其它胶原或结构蛋白则无，因此，通过检测Cartilaps可以了解CTX-II的浓度，间接反映关节软骨损伤和退变及骨关节患者的病情。

本发明的第二方面提供了一种用于治疗和/或预防骨关节炎的药物组合物。

进一步，所述药物组合物包含治疗有效量的丁香酚。

进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料；

优选地，所述药学上可接受的载体和/或辅料包括稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

进一步，所述稀释剂包括(但不限于)：乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等。

进一步，所述粘合剂包括(但不限于)：淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸、海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等。

进一步，所述表面活性剂包括(但不限于)：聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等。

进一步，所述致湿剂包括(但不限于)：甘油、淀粉等。

进一步，所述吸附载体包括(但不限于)：淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土、皂粘土等。

进一步，所述润滑剂包括(但不限于)：硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等。

进一步，所述填充剂包括(但不限于)：甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙、碳酸氢钠等。

进一步，所述崩解剂包括(但不限于)：交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

进一步，所述药物组合物中的活性成分为丁香酚，所述丁香酚通过Jak-STAT信号通路抑制软骨细胞的凋亡以及降低ADAMTS4的表达而抑制软骨细胞外基质的降解，此外，所述丁香酚可降低ADAMTS4、CTX-II的表达，有效保护软骨和软骨下骨，对骨关节炎具有显著的治疗效果。

进一步，所述药物组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、受试者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗和/或预防有效的给药剂量。

在本发明中，所述“受试者”，是指任何动物，还指人类和非人类的动物。术语“非人类的动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。在本发明优选的实施方案中，所述受试者优选为人类。

本发明的第三方面提供了丁香酚作为活性成分在制备试剂中的应用。

进一步，所述试剂用于以下任一方面或多种方面：

(1)体外抑制软骨细胞的凋亡；

(2)体外抑制软骨细胞外基质的降解；

(3)体外降低ADAMTS4、CTX-II的表达。

在本发明的具体实施例中，本发明通过体内实验和体外实验均证明了丁香酚对骨关节炎具有显著的治疗效果，可有效保护软骨和软骨下骨、有效抑制软骨细胞凋亡、有效抑制软骨细胞外基质的降解。此外，可用于体外抑制软骨细胞的凋亡、体外抑制软骨细胞外基质的降解、体外降低ADAMTS4、CTX-II的表达中。

本发明的第四方面提供了一种治疗和/或预防骨关节炎的联合用药物。

进一步，所述联合用药物包含治疗有效量的丁香酚、非甾体类抗炎药、活血化瘀药物和/或改善纤维软骨的药物。

进一步，所述非甾体类抗炎药包括布洛芬、双氯芬酸、塞来昔布、阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、尼美舒利、罗非昔布；

优选地，所述活血化瘀药物包括三七、桃仁、红花、郁金、姜黄、乳香、没药、川芎、丹参、赤芍、三棱、莪术、伸筋草、透骨草、威灵仙、五灵脂、蒲黄；

优选地，所述改善纤维软骨的药物包括盐酸氨基葡萄糖片、玻璃酸钠、复合维生素、谷维素。

进一步，本发明所述的丁香酚还可与其他用于治疗和/或预防骨关节炎的药物联合应用，其他治疗性药物可以与主要的活性成分(本发明中所述的丁香酚)同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明所述的联合用药物的剂量。

进一步，本发明中所述与丁香酚联合使用的药物并不局限于本发明中所列举的非甾体类抗炎药、活血化瘀药物和/或改善纤维软骨的药物，只要具有治疗和/或预防骨关节炎的效果，其和丁香酚联合制备得到的联合用药物均在本发明的保护范围内。

本发明的第五方面提供了丁香酚在制备用于治疗和/或预防骨关节炎的联合用药物中的应用。

进一步，所述联合用药物为本发明的第四方面所述的联合用药物。

相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：

本发明首次发现并证实了丁香酚具有预防和/或治疗骨关节炎的新用途，并通过体内实验和体外实验证明了丁香酚对骨关节炎具有显著的治疗效果，可有效保护软骨和软骨下骨、有效抑制软骨细胞凋亡、有效抑制软骨细胞外基质的降解。此外，相对于目前临床上常用的治疗骨关节炎的药物而言，丁香酚具有毒副作用小、代谢残留少、安全性高等优点，因此，本发明为骨关节炎治疗药物的研究和开发，提供了一种全新的思路和策略，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明实验动物分组与实验步骤示意图；

图2为小鼠左侧胫骨平台软骨下骨的Micro-CT检查的结果图和结果统计图，其中，A图：左侧胫骨平台软骨下骨的矢状面Micro-CT影像，B图：Micro-CT参数结果统计图，所述Micro-CT参数分别为骨矿物质密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、结构模式指数(SMI)、骨小梁分离度(Tb.Sp)，##p<0.01，###p<0.001；

图3为Eugenol减缓ACLT诱发的软骨退变实验结果图，其中，A图：苏木精-伊红(HE)染色和番红O-固绿染色结果图，B图：OARSI软骨组织学评分结果统计图，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；

图4为在小鼠膝关节中Eugenol抑制软骨基质降解实验结果图，其中，ELISA检测软骨退变标志物CTX-II、COMP和PIINT的表达情况，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；

图5为在小鼠膝关节中Eugenol增加合成代谢，抑制软骨基质降解实验结果图，其中，A图：免疫组化(IHC)结果图，B图和C图：免疫组化(IHC)量化图，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；

图6为Eugenol显著减轻CCCP诱导的人软骨细胞损伤实验结果图，与CCCP处理组相比，#p<0.05，##<0.01，###p<0.001；

图7为Eugenol能够降低基质降解酶ADAMTS和MMP13的表达实验结果图；

图8为Eugenol抑制Jak/STAT通路磷酸化的实验结果图；

图9为Eugenol抑制软骨细胞凋亡的实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1Eugenol对膝盖前交叉韧带切除术(ACLT)的骨关节炎小鼠模型的治疗效果研究

1、实验材料

丁香酚(Eugenol)购自于上海陶素生化科技有限公司，小鼠购自于北京维通利华实验动物技术有限公司，为C57B6N小鼠，6周龄、雄性。

2、膝盖前交叉韧带切除术(Anterior cruciate ligament transection，ACLT)的骨关节炎小鼠模型的构建

小鼠用右美托咪啶(0.25mg/kg)和氯胺酮(25mg/kg)肌内注射麻醉，常规备皮消毒左侧膝关节，取髌旁内侧切口显露膝关节，显露髌骨后将髌骨向外侧脱位，尽量屈曲膝关节显露前交叉韧带(Anterior cruciate ligament transection，ACLT)，在直视下切断前交叉韧带，彻底止血，将髌骨复位，1号丝线逐层闭合关节腔。假手术组仅切开缝合左侧膝关节，未切断前十字韧带。

3、Eugenol对骨关节炎ACLT小鼠模型的治疗效果研究

6周龄雄性C57B6N小鼠(n＝25)购置于北京维通利华实验动物技术有限公司。经2周适应环境后，将小鼠随机分为5组，每组5只：①正常组，未腹腔注射；②假手术组，未腹腔注射；③ACLT模型组，腹腔注射溶剂；④小剂量ACLT模型组，ACLT后腹腔注射丁香酚(5mg/kg)；⑤大剂量ACLT模型组，ACLT后腹腔注射丁香酚(10mg/kg)(本发明实验动物分组与实验步骤示意图见图1)。

造模两周后，腹腔给与Eugenol，分为溶剂组、5mg/kg低剂量组和10mg/kg高剂量组。1次/周，给药6周。

4、micro-CT、HE和番红固绿染色并给予OARSI评分

给药6周后，取左侧膝关节标本，剔除周围组织，将标本经保湿处理后置于Micro-CT(SkyScan1172，Belgium)仪器中进行扫描，扫描方式为旋转180°，步长0.4°，扫描分辨率为21m，管电压70kV。扫描完毕后，采用设备自带重构软件NRecon(V1.6.9.4)获得1000余张标本的横断面图。将标本的完整膝关节骨组织作为感兴趣区域(Region of interest，ROI)，采用CTan(V1.14.4)软件完成图像二值化(阈值80-255)后并进行分析。采用CTVol(v.2.2)软件显示三维图像(见图2A和图2B)。

用生理盐水冲洗经4％多聚甲醛固定的膝关节标本3次，将其置于EDTA溶液中脱钙，完全脱钙后，用乙醇脱水，石蜡包埋。5μm切片，常规脱蜡至水后，行苏木精-伊红(HE)染色和番红O-固绿染色(见图3A)。

光镜下观察组织的病理学改变，并按照OARSI软骨组织学评分标准进行评分(见图3B)。

5、ELISA检测CTX-II等的表达

给药6周后，小鼠血清分别行软骨退变标志物CTX-II、COMP和PIINT的ELISA(维百奥(北京)生物科技有限公司)检测(见图4)。

6、免疫组织化学染色

常规切片脱蜡至水，微博抗原修复10分钟，3％H₂O₂室温孵育10分钟，山羊血清室温封闭15分钟后加入一抗(1:200)4℃过夜，HRP标记二抗(工作浓度1:200)室温15分钟，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片(见图5)。

7、实验结果

结果显示，一定浓度以内的Eugenol对小鼠体重无明显影响，ACLT可引发小鼠胫骨平台关节软骨和软骨下骨的破坏，而Eugenol可有效保护软骨和软骨下骨。同时Eugenol可降低ACLT导致的小鼠膝关节ADAMTS4以及血清中CTX-II、COMP和PIINT等分解代谢信号分子的表达增多(见图1-图5)，表明了Eugenol对骨关节炎ACLT小鼠模型具有显著的治疗效果。

实施例2Eugenol对IL-1β刺激下的人软骨细胞影响的研究

1、实验材料

人原代软骨细胞、FULL培养基购自于北京北纳创联生物技术研究院，CCK-8试剂盒、核糖核酸(RNA)提取液(TRIzol)购置Invitrogen公司，IL-1β购自于Sigma公司，TUNELassay试剂盒购自于北京索莱宝科技有限公司。

2、实验方法

(1)人原代软骨细胞以2×10⁵细胞/mL密度播种于6孔板(直径3.5cm)后培养12小时。于含有不同浓度的Eugenol(0、25、50μg/mL)的FULL培养基中继续培养2小时，使细胞吸收Eugenol。向FULL培养基中加入0或10ng/mL的IL-1β刺激细胞24小时。使用TRIzol RNA提取液进行RNA提取。RNA芯片检测步骤包括：①总RNA样品制备和质量控制，②文库构建和质量控制，③杂交清洗和染色扫描，④信息分析。基因芯片技术由北京中康博生物科技有限公司进行。

(2)利用CCK-8试剂检测细胞活性

将人原代软骨细胞以5×10³细胞/孔的密度播种于96孔板后培养12小时。于含有不同浓度的Eugenol(0、12.5、25、50、100和200μg/mL)的FULL培养基中继续培养0、24、48和72小时。设置实验组每组3个复孔，3个不含细胞的空白对照孔。加10μL/孔CCK-8液，37℃孵育2小时。用酶联免疫检测仪以450nm波长检测吸光度。对照组细胞活力计算为100％(见图6)。

(3)蛋白免疫印迹法检测MMP-13和ADAMTS4等信号分子的表达

将人原代软骨细胞以2×10⁵细胞/孔的密度播种于6孔板后培养12小时。于含有不同浓度的Eugenol(0、12.5、25、50、100和200μg/mL)的FULL培养基中继续培养2小时。向FULL培养基中加入0或10ng/mL的IL-1β刺激细胞24小时。经PBS轻洗2次后，按照总蛋白提取试剂盒(Thermo Fisher，美国)的操作顺序提取总蛋白，使用Bradford法检测蛋白质浓度。取20μg蛋白于4-12％丙烯酰胺凝胶中电泳后，将蛋白转移至PVDF膜(Bio-Rad，美国)，5％脱脂奶粉封闭40分钟。一抗使用单克隆抗体ADAMTS-4(abcam，USA)、MMP-13(abcam，USA)、Jak(abcam，USA)、p-Jak(CST，USA)、STAT4(abcam，USA)、p-STAT4(CST，USA)和β-actin(abcam，USA)，于4℃过夜。经TBST洗膜后二抗使用辣根过氧化物酶标记小鼠或兔IgG，室温下孵育4小时。使用ECL系统，暗室内胶片(Kodak，美国)成像(见图7和图8)。

(4)TUNEL试剂检测软骨细胞的凋亡情况

将人原代软骨细胞以2×10⁵细胞/孔的密度播种于6孔板后培养12小时。于含有不同浓度的Eugenol(0或50μg/mL)的FULL培养基中继续培养2小时。向FULL培养基中加入0或50mM的CCCP刺激细胞20分钟。收集处理后的细胞，采用4％多聚甲醛固定细胞，根据TUNEL凋亡试剂盒说明书进行TUNEL染色，才采用DAPI染色液复染细胞核。置于荧光显微镜下观察凋亡细胞，并通过计算TUNEL阳性细胞核数量占DAPI染色核数量的比例，计算凋亡细胞的百分率(见图9)。

3、实验结果

结果显示，Eugenol通过Jak-STAT信号通路抑制软骨细胞凋亡以及降低ADAMTS4的分泌而抑制软骨细胞外基质的降解(见图6-图9)，表明了Eugenol通过Jak-STAT信号通路抑制软骨细胞凋亡，进一步表明了Eugenol可有效预防和治疗骨关节炎。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (1)

1.丁香酚作为活性成分在制备体外降低ADAMTS4、CTX-II的表达的试剂中的应用。