CN113087723A - 一种西罗莫司的分离纯化方法 - Google Patents

一种西罗莫司的分离纯化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113087723A
CN113087723A CN202010020181.XA CN202010020181A CN113087723A CN 113087723 A CN113087723 A CN 113087723A CN 202010020181 A CN202010020181 A CN 202010020181A CN 113087723 A CN113087723 A CN 113087723A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sirolimus
collecting
solution
crystallization
yield
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010020181.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113087723B (zh
Inventor
张贵民
马印虎
朱兵峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lunan Pharmaceutical Group Corp
Original Assignee
Lunan Pharmaceutical Group Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lunan Pharmaceutical Group Corp filed Critical Lunan Pharmaceutical Group Corp
Priority to CN202010020181.XA priority Critical patent/CN113087723B/zh
Publication of CN113087723A publication Critical patent/CN113087723A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113087723B publication Critical patent/CN113087723B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/18—Bridged systems

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种西罗莫司的分离纯化方法，通过微生物发酵培养出含西罗莫司的发酵液，提取采用菌丝体收集、浸提、萃取、活性炭纤维脱色、粗结晶、树脂柱层析和结晶得到西罗莫司。本发明提供的西罗莫司的分离纯化方法工艺路线短、生产成本低、更加环保，获得的产品纯度可达99.9％以上、收率提高至78％，适合于工业规模上生产高纯度西罗莫司。

Description

一种西罗莫司的分离纯化方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种大环内酯抗生素类免疫抑制剂的分离纯化方法。
背景技术
西罗莫司(sirolimus)又称雷帕霉素(rapamycin)，是一种31元大环内酯类免疫抑制剂，由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus ACCC No.40417)、游动放线菌N902-109(Actinoplanes sp.N902-109)与伊氏链霉菌(Streptomyces iranensis)等放线菌菌株产生，具有广泛的生物活性，包括抗真菌、免疫抑制、抗肿瘤、神经保护和抗衰老等。同时以西罗莫司为前体，经化学修饰合成可得一些结构新颖衍生物，被发现在免疫抑制、抗癌、抗帕金森氏症与艾滋病等方面上，具有新的治疗作用，其中其合成物Temsirolimus、Everolimus、AP23573已作为抗肿瘤靶向新药物上市或进行临床研究，西罗莫司在医药应用领域具有广泛前景。
当前西罗莫司的生产主要通过发酵法生产，在西罗莫司的生产技术和应用上我国都远低于国外水平，存在发酵水平低、提取纯化路线复杂和产品纯度低等问题，导致生产成本高，此外固液废产生量也较大。因此如何打破瓶颈，简化工艺路线、提高西罗莫司纯度、和减少三废排放，同时降低生产成本，具有迫切的现实意义。
CN102443012A发明公布了一种高纯度提取纯化方法，通过浸提获取目标产物，进行萃取、大孔树脂富集纯化，用乙酸乙酯萃取后，使用正庚烷及丙酮对硅胶柱进行层析分离，洗脱料液溶于石油醚或乙醚中结晶，干燥得到西罗莫司粗品。再经乙醚重结晶，得到西罗莫司纯品，纯度为99.3％，收率提高至53～60％。
杨国新等在《海峡药学》(2007年，第19卷第17期，25-26页)文献中公开：浸提获取西罗莫司料液，萃取后进行200～300目硅胶柱层析(乙酯-石油醚洗脱系统)，洗脱料液浓缩后经乙醚结晶，再经二次硅胶柱层析(200～300目)，分步收集，洗脱液浓缩后乙醚结晶，重结晶得西罗莫司样品，纯度99.8％，但单杂高于0.1％。
美国惠氏专利公布说明书US20100029933A1公布了西罗莫司的纯化技术方案：乙酸乙酯浸提，树脂柱层析，浓缩，硅胶柱层析，结晶，反相色谱层析，重结晶得到的西罗莫司；该方案从发酵液中纯化得到纯品，纯度98.8％，总杂质含量小于1.2％，单杂低于0.15％，但利用该法纯化收率不高，在一个具体的实施例中可以得知11kg的雷帕霉素发酵液最后的纯品只有6g，称取3g纯品进一步纯化结晶得到2.5g。
CN102464668A和WO2008065887发明公开了通过制备色谱纯化得到高纯度雷帕霉素的方法，使用制备色谱，其设备、填料价格昂贵，生产成本高。CN105777777发明公开了一种西罗莫司的纯化方法，将西罗莫司粗品用硅胶富集，然后浓缩冻干成干粉；将干粉溶解为浓度30mg/mL～67mg/mL的溶液，再通过用半制备液相色谱制备出西罗莫司纯品，纯度98％。CN102070652A发明使用高速逆流色谱替代硅胶柱层析，得到纯度90％的产品。
CN102433364B发明公开了一种微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺，通过发酵得发酵液后，经过滤、浸提、萃取、浓缩、结晶、碱酸洗涤、浓缩、重结晶得粗品，再经硅胶柱层析、结晶获得终产品，纯度94％。
CN102372726A发明公开了一种通过将西罗莫司菌丝体的浸提液进行吸附、萃取、洗涤浓缩、洗涤、结晶、洗晶干燥等步骤，即可得到西罗莫司粗晶，该方法只能得到纯度为95％的雷帕霉素。
CN105585578A发明公开了一种高纯度雷帕霉素的制备方法，通过浸提、过滤、萃取、脱色、硅胶柱层析、大孔吸附树脂吸附、结晶得到纯化的雷帕霉素，虽纯度达99％，但采用两次柱层析，工艺路线复杂，且产生固废和液废较多。
CN104844620B发明公开了一种西罗莫司的纯化方法，通过微生物发酵、菌丝体收集、浸提、萃取、活性炭吸附、硅胶柱层析、结晶、重结晶技术得到西罗莫司，纯度达到99.8％，单杂小于0.10％，但工艺路线长且复杂。
CN107619413A发明公开了一种西罗莫司的纯化方法，通过分离收集发酵液和菌丝体；超声搅拌处理菌丝体，得菌丝体提取液；将发酵液和菌丝体提取液混合，萃取，脱色，过滤，然后再用90％～95％乙醇处理，蒸干，得雷帕霉素粗品；硅胶柱层析；重结晶2～3次，得西罗莫司纯品，但纯度最高为98.4％。
以上专利、文献资料报道的西罗莫司提取纯化工艺中，西罗莫司的粗制纯度提高至95％，精制纯度提高到99.8％，但其提取纯化过程工艺繁琐，生产周期长，需经一次或两次硅胶柱层析。因采用的不定型硅胶只能使用一次，无法重复利用，虽其价格便宜，但生产中产生大量的固体废弃物，无法及时处理，给环保带来巨大压力，因此不定型硅胶柱层析正逐步被高压制备液相取代。高压制备液相纯化中，设备投入高、填料成本高、周期长、上样量低、溶剂用量大，虽能够保证质量，但经济效益相对较差。
本发明通过筛选层析型色谱填料，构建树脂柱层析工艺，替代硅胶的使用，产品纯度可达99.9％以上，填料重复使用次数可达200余次，减少硅胶固废的排放，同时大大降低了正相硅胶柱层析中洗脱体系溶剂的使用量，经济效益与社会效益显著提高。
发明内容
鉴于现有技术中生产工艺复杂、生产周期长、一次性硅胶固废环保处理压力大及溶剂使用量大等不足，本申请提供一种工艺路线短、更加环保的西罗莫司纯化方法，主要通过微生物发酵培养出含西罗莫司的发酵液，提取采用菌丝体收集、浸提、萃取、活性炭纤维脱色、粗结晶、树脂柱层析、结晶得到西罗莫司。本发明的优点为工艺路线短，生产周期短，操作性更强，获得的产品纯度高、收率高，生产工艺较传统工艺更加环保，有利于降低有机废液及固废排放，适合于工业规模上生产高纯度西罗莫司。
本发明的技术方案为：过微生物发酵培养出含西罗莫司的发酵液，提取采用菌丝体收集、浸提、萃取、活性炭纤维脱色、粗结晶、树脂柱层析和结晶得到西罗莫司。
一种西罗莫司的分离纯化方法，具体包括如下步骤：
A.浸提：收集西罗莫司发酵液，过滤得菌丝体，将菌丝体浸入有机溶剂中，浸提后过滤，得到菌丝体浸提液；
B.萃取：将西罗莫司浸提液进行真空减压浓缩，向浓缩液中加入十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，使用乙酸乙酯进行一次萃取，收集萃取相；
C.活性炭纤维脱色：将萃取液通过含有活性炭纤维的过滤器，收集脱色滤液；
D.粗结晶：将步骤C所得的滤液减压浓缩，收集浓缩液，向浓缩液中添加析晶溶剂，析晶、抽滤，即可得到西罗莫司粗品；
E.树脂柱层析：使用流动相溶解西罗莫司粗品，加入树脂柱中，树脂柱填料为层析型树脂填料。洗脱前向洗脱溶剂中加入缓冲盐添加剂。出料后分段收集，同时使用HPLC在线检测，收集含西罗莫司的流出液并进行合并；
F.萃取：将步骤E所述流出液进行真空减压浓缩，使用乙酸乙酯进行萃取，收集萃取相；向萃取相中加入无水硫酸钠吸附水分，过滤，收集滤液待结晶；
G.结晶：将步骤F得到的滤液真空浓缩，然后降温析晶，抽滤，使用乙醚、甲基叔丁基醚或环丙醚进行漂洗，抽滤，真空干燥，即得西罗莫司成品，取样进行HPLC检测。
优选地，包括如下内容：
步骤A中所述的有机溶剂为乙醇-水或丙酮-水，加入的体积为菌丝体质量的5～9倍，mL/g，浸提2～4h，浸提2次；
步骤B中所述的乙酸乙酯的加入体积为浸提液浓缩后体积的1～4倍；
步骤C中所述的活性炭纤维的型号选自bjrxyw-01、bjrxyw-02、bjrxyw-03或bjrxyw-04中的一种，活性炭纤维模块的使用数量为120～200L待脱色液体/3支；
步骤D中所述的析晶溶剂选自甲基叔丁基醚、乙醚、环丙醚或环己烷中的一种，加入的体积为为浓缩液体积的1～3倍；
步骤E中所述的树脂柱填料为树脂柱填料选自聚苯乙烯型、聚丙烯酸型或聚苯乙烯/二乙烯基苯层析型树脂，优选HP20SS、色谱一号至五号、Unips40-300或PS40-300中的一种。
步骤E中所述的洗脱溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮或异丙醇的水溶液。
步骤E中所述的缓冲盐添加剂为pH为6.0～6.5的缓冲盐，优选磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、乙酸-乙酸铵缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液或三氟乙酸缓冲液中的一种；
步骤G中所述的真空浓缩的温度为30～50℃，并按5～10℃/h梯度降温析晶。
更为优选地，包括如下内容：
步骤A中所述的有机溶剂的体积浓度为80～95％；
步骤C中所述的活性炭纤维模块的使用数量为160～180L(待脱色液体)/3支；
步骤E中所述的树脂柱填料为色谱一号或四号；
步骤E中所述的洗脱溶剂为乙腈或乙醇-水溶液，洗脱溶剂的体积浓度为30～80％；
步骤E中所述的缓冲盐添加剂为乙酸-乙酸钠缓冲液或三氟乙酸缓冲液，缓冲盐添加剂的加入体积为洗脱溶剂体积的0.5～1.5％；
步骤G中所述的真空浓缩的温度为40～45℃，按5～7℃/h梯度降温析。
进一步优选地，包括如下内容：
步骤C中所述的活性炭纤维模块的型号为bjrxyw-04，脱色温度20～45℃，pH＝6.5～7.5；
步骤E中所述的树脂柱填料为色谱四号；
步骤E中所述的洗脱溶剂为乙腈-水溶液，洗脱溶剂的体积浓度为30～60％；
步骤E中所述的缓冲盐添加剂为三氟乙酸缓冲液，缓冲盐添加剂的加入体积为洗脱溶剂体积的为0.8～1.0％。
在一个实施方式中，包括如下内容：
A.浸提：收集西罗莫司发酵液，过滤得到菌丝体，将菌丝体浸入菌丝体质量的5～7倍体积(mL/g)的有机溶剂乙醇-水(体积浓度85～90％)中，浸提2～4h后再次通过板框压滤机压滤收集滤液，共浸提2次，得到浸提液；
B.萃取：将西罗莫司浸提液进行真空减压浓缩，添加十二烷基苯磺酸钠，使用浓缩液体积的1～2倍体积乙酸乙酯进行萃取，搅拌10～15min后，静置6～8h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相；
C.活性炭纤维脱色：将萃取液通过含有型号为bjrxyw-04、bjrxyw-03或bjrxyw-01的活性炭纤维模块的过滤器中，活性炭纤维模块的使用数量为160L(待脱色液体)/3支，脱色温度20～25℃，pH为7.0～7.5，收集脱色滤液；
D.粗结晶：将收集的脱色滤液减压浓缩，向浓缩液中添加浓缩液体积的2倍体积的甲基叔丁基醚、乙醚或环丙醚，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，抽滤，得到西罗莫司粗品；
E.树脂柱层析：层析型树脂填料为色谱四号或一号，粒径在100～150目，使用10％乙醇并按50～60％匀浆浓度将树脂装入层析柱中，用20％乙醇溶液平衡，上样量10～15g/L，使用乙腈或乙醇的水溶液进行梯度洗脱，洗脱浓度为30～60％，洗脱前向洗脱溶剂中加入pH为6.0～6.5的缓冲盐添加剂，添加剂为乙酸-乙酸钠缓冲液或三氟乙酸缓冲液，缓冲盐添加剂用量为0.8～1.0％(V/V)，出料后分段收集，同时使用HPLC在线检测，收集含西罗莫司料液并进行合并；
F.将收集的西罗莫司料液进行真空减压浓缩，温度40～45℃，并使用乙酸乙酯进行萃取(1:2，V/V)，收集萃取相；向乙酸乙酯相中加入无水硫酸钠除水分，过滤，收集滤液待结晶；
G.结晶：将步骤F得到的滤液，40～45℃下真空浓缩，梯度降温析晶(5～7℃/h)，降到温度4℃后，养晶4h，使用乙醚进行漂洗，抽滤完毕后真空干燥，得西罗莫司成品，取样进行HPLC检测。
本发明与现有技术相比具有如下突出优点：
1、本发明对含有西罗莫司的发酵液采用菌丝体抽提、萃取、活性炭纤维脱色、层析型树脂柱层析、结晶精制得到西罗莫司纯品。
2、本发明中使用活性炭纤维脱色效果明显，滤液颜色较之前明显变浅，纯度89.5～95.0％，收率在99.0％以上。通过活性炭纤维脱色代替目前广泛使用的粉末型活性炭脱色方法，活性炭纤维可重复利用，大大降低了粉末型活性炭的使用量，减少固体废弃物，缩短了生产周期，成本显著降低，收率提高。
3、相对于杨国新等所公开的文献资料，使用树脂柱层析性替代硅胶柱层析，并在缓冲盐添加剂的助分离条件下，纯化效果更佳，前后杂质控制上更好，尤其是去除氧乙基西罗莫司杂质(way-155618)，可以做到完全去除，合格洗脱液纯度到达99.3％以上；填料重复使用次数可达200余次，替换后可减少硅胶废弃物的排放；相比较硅胶柱层析普遍使用的正相流动相环己烷、庚烷、石油醚、正己烷和极性溶剂乙酸乙酯、丙酮的使用，树脂柱层析只使用一种溶剂，且用量大幅降低，减少了溶剂的排放，更加环保。此外，本发明相比专利US20100029933A1、CN104844620B所公开的数据取得了更好的效果，本发明提取得到的西罗莫司纯品不仅纯度达99.9％以上，单杂小于0.10％，而且总收率可提高到78％左右。
4、树脂柱层析后产品纯度提高，相比现有技术只需一步精制即可到达纯度99.8％以上，不需要重结晶，工艺路线进一步缩短。
5、本发明以活性炭纤维脱色替代广泛使用的粉末型活性炭，利于现场工作人员可吸入性粉尘的保护，同时降低活性炭固废的排放，工艺简单，操作方便，对工业化生产具有更重要意义。
6、提取工艺研究表明，采用该方法可简化西罗莫司提取工艺路线，减少了硅胶废弃物的排放，减少有机溶剂的使用量，缩短生产周期，提高收率和产品纯度，操作方便，成本低廉，更加环保。
具体实施方式
下面列举实施例予以进一步说明：利用但不限于游动放线菌N902-109(Actinoplanes sp.N902-109)，通过微生物发酵得含有西罗莫司的发酵液(可参照专利CN103740614B制备，或利用其他微生物吸水链霉菌或伊氏链霉菌等放线菌菌株产生的发酵液制备)，本发明所要保护的技术方案不仅仅限于以下实施例。
实施例1
A.通过500L发酵罐获得发酵液340L，效价为1.21g/L，板框过滤收集菌丝体，用菌丝体质量的6倍体积(mL/g)的88％乙醇-水浸提2次菌丝体，每次2h，得到浸提液，浸提液中含西罗莫司，收率约98.12％，浸提液后续进行减压浓缩。
B.将菌丝体浸提液进行真空减压浓缩，直到蒸出乙醇浓度低于20％为止，添加浓缩液质量0.002倍的十二烷基苯磺酸钠，使用2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，搅拌15min后，静置8h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，萃取收率约99.43％。
C.将乙酸乙酯萃取液通过压缩氮气通过含有型号为bjrxyw-04活性碳纤维模块的过滤器中，过滤器串联组成，每台过滤器内可装5支活性碳纤维模块，活性炭纤维模块的使用数量为160L(待脱色液体)/3支，脱色温度为25℃，pH为7.0，收集脱色滤液，取样通过HPLC测定含量及成分，脱色效果明显，滤液颜色较之前明显变浅，纯度95.01％，收率99.61％。D.将收集的活性炭纤维脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩物，向浓缩物中添加2倍体积甲基叔丁基醚，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，而后对析晶液进行抽滤，得到西罗莫司粗品，纯度98.63％，收率92.32％。
E.按照50％匀浆浓度使用10％乙醇将树脂(色谱四号、100～150目)装入层析柱中，用20％乙醇溶液平衡，按照上样量12g/L，使用乙腈的水溶液进行梯度洗脱，洗脱浓度为30％的3BV、40％的3BV和60％的4BV，洗脱前向洗脱液中添加(V/V＝1.0％)三氟乙酸，按照出料后分段收集，经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥99.00％的洗脱液合并收集。合并液中西罗莫司纯度为99.65％，收率87.86％。
F.将收集的合格料液进行真空减压浓缩，温度40～45℃，直到蒸出乙腈浓度低于2～5％为止，停止浓缩，使用乙酸乙酯进行萃取(1:2，V/V)，收集萃取相；向乙酸乙酯相中加入无水硫酸钠除水分(2g/L)1h，通过抽滤瓶过滤滤液，收率99.82％。
G.使用50L旋转蒸发仪在40℃下对滤液进行减压浓缩，待浓缩液开始出现浑浊时转移至20L结晶罐内，于冷却槽内按5℃/h开始梯度降温析晶，降到温度4℃后，养晶4h，使用乙醚进行漂洗，抽滤完毕后得西罗莫司湿品。经真空干燥后，得西罗莫司成品，HPLC检测纯度为99.91％，单杂0.05％，收率99.23％。
实施例2
A.通过500L发酵罐获得发酵液340L，效价为1.21g/L，板框过滤收集菌丝体，用菌丝体质量的5倍体积(mL/g)的85％乙醇-水浸提2次菌丝体，每次3h，得到浸提液，浸提液中含西罗莫司，收率约97.92％，浸提液后续进行减压浓缩。
B.将菌丝体浸提液进行真空减压浓缩，直到蒸出乙醇浓度低于20％为止，添加浓缩液质量0.002倍的十二烷基苯磺酸钠，使用1倍体积的乙酸乙酯进行萃取，搅拌10min后，静置6h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，萃取收率约98.33％。
C.将乙酸乙酯萃取液通过压缩氮气通过含有型号为bjrxyw-03活性碳纤维模块过滤器中，过滤器串联组成，每台过滤器内可装5支活性碳纤维模块，活性炭纤维模块的使用数量为160L(待脱色液体)/3支，脱色温度为20℃，pH为7.5，收集脱色滤液，取样通过HPLC测定含量及成分，脱色效果明显，滤液颜色较之前明显变浅，纯度94.61％，收率99.52％。
D.将收集的活性炭纤维脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩物，向浓缩物中添加2倍体积乙醚，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，而后对析晶液进行抽滤，得到西罗莫司粗品，纯度98.54％，收率91.91％。
E.按照55％匀浆浓度使用10％乙醇将树脂(色谱一号、100～150目)装入层析柱中，用20％乙醇溶液平衡，按照上样量10g/L，使用乙醇的水溶液进行梯度洗脱，洗脱浓度为30％的3BV、40％的3BV和60％的3BV，洗脱前向洗脱液中添加(V/V＝0.8％)乙酸-乙酸钠缓冲液，按照出料后分段收集，经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥99.00％的洗脱液合并收集。合并液中西罗莫司纯度为99.56％，收率86.65％。
F.将收集的合格料液进行真空减压浓缩，温度40～45℃，直到蒸出乙腈浓度低于2～5％为止，停止浓缩，使用乙酸乙酯进行萃取(1:2，V/V)，收集萃取相；向乙酸乙酯相中加入无水硫酸钠除水分(2g/L)1h，通过抽滤瓶过滤滤液，收率99.84％。
G.使用50L旋转蒸发仪在45℃下对滤液进行减压浓缩，待浓缩液开始出现浑浊时转移至20L结晶罐内，于冷却槽内按6℃/h开始梯度降温析晶，降到温度4℃后，养晶4h，使用乙醚进行漂洗，抽滤完毕后得西罗莫司湿品。经真空干燥后，得西罗莫司成品，HPLC检测纯度为99.90％，单杂0.07％，收率99.11％。
实施例3
A.通过500L发酵罐获得发酵液340L，效价为1.21g/L，板框过滤收集菌丝体，用菌丝体质量的7倍体积(mL/g)的90％乙醇-水浸提2次菌丝体，每次4h，得到浸提液，浸提液中含西罗莫司，收率约97.88％，浸提液后续进行减压浓缩。
B.将菌丝体浸提液进行真空减压浓缩，直到蒸出乙醇浓度低于20％为止，添加浓缩液质量0.002倍的十二烷基苯磺酸钠，使用2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，搅拌13min后，静置7h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，萃取收率约98.59％。
C.将乙酸乙酯萃取液通过压缩氮气通过含有型号为bjrxyw-01活性碳纤维模块过滤器中，过滤器串联组成，每台过滤器内可装5支活性碳纤维模块，活性炭纤维模块的使用数量为160L(待脱色液体)/3支，脱色温度为22℃，pH为7.3，收集脱色滤液，取样通过HPLC测定含量及成分，脱色效果明显，滤液颜色较之前明显变浅，纯度94.42％，收率99.46％。
D.将收集的活性炭纤维脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩物，向浓缩物中添加2倍体积环丙醚，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，而后对析晶液进行抽滤，得到西罗莫司粗品，纯度98.51％，收率91.43％。
E.按照60％匀浆浓度使用10％乙醇将树脂(色谱一号、100～150目)装入层析柱中，用20％乙醇溶液平衡，按照上样量15g/L，使用乙醇的水溶液进行梯度洗脱，洗脱浓度为30％的3BV、40％的2BV和60％的3BV，洗脱前向洗脱液中添加(V/V＝0.9％)三氟乙酸缓冲液，按照出料后分段收集，经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥99.00％的洗脱液合并收集。合并液中西罗莫司纯度为99.48％，收率85.74％。
F.将收集的合格料液进行真空减压浓缩，温度40～45℃，直到蒸出乙腈浓度低于2～5％为止，停止浓缩，使用乙酸乙酯进行萃取(1:2，V/V)，收集萃取相；向乙酸乙酯相中加入无水硫酸钠除水分(2g/L)1h，通过抽滤瓶过滤滤液，收率99.86％。
G.使用50L旋转蒸发仪在43℃下对滤液进行减压浓缩，待浓缩液开始出现浑浊时转移至20L结晶罐内，于冷却槽内按7℃/h开始梯度降温析晶，降到温度4℃后，养晶4h，使用乙醚进行漂洗，抽滤完毕后得西罗莫司湿品。经真空干燥后，得西罗莫司成品，HPLC检测纯度为99.88％，单杂0.07％，收率99.05％。
实施例4
A.通过500L发酵罐获得发酵液340L，效价为1.21g/L，板框过滤收集菌丝体，用菌丝体质量的9倍体积(mL/g)的80％乙醇-水浸提2次菌丝体，每次3h，得到浸提液，浸提液中含西罗莫司，收率约97.75％，浸提液后续进行减压浓缩。
B.将菌丝体浸提液进行真空减压浓缩，直到蒸出乙醇浓度低于20％为止，添加浓缩液质量0.002倍的十二烷基苯磺酸钠，使用2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，搅拌20min后，静置9h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，萃取收率约98.59％。
C.将乙酸乙酯萃取液通过压缩氮气通过含有型号为bjrxyw-02活性碳纤维模块过滤器中，过滤器串联组成，每台过滤器内可装5支活性碳纤维模块，活性炭纤维模块的使用数量为180L(待脱色液体)/3支，脱色温度为20℃，pH为6.5，收集脱色滤液，取样通过HPLC测定含量及成分，脱色效果明显，滤液颜色较之前明显变浅，纯度94.14％，收率99.12％。
D.将收集的活性炭纤维脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩物，向浓缩物中添加1倍体积环己烷，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，而后对析晶液进行抽滤，得到西罗莫司粗品，纯度98.50％，收率91.13％。
E.按照70％匀浆浓度使用10％乙醇将树脂(HP20SS、100～200目)装入层析柱中，用20％乙醇溶液平衡，按照上样量8g/L，使用甲醇的水溶液进行梯度洗脱，洗脱浓度为30％的2BV、40％的2BV和70％的3BV，洗脱前向洗脱液中添加(V/V＝0.5％)乙酸-乙酸铵缓冲液缓冲液，按照出料后分段收集，经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥99.00％的洗脱液合并收集。合并液中西罗莫司纯度为99.38％，收率84.63％。
F.将收集的合格料液进行真空减压浓缩，温度40～45℃，直到蒸出乙腈浓度低于2～5％为止，停止浓缩，使用乙酸乙酯进行萃取(1:1，V/V)，收集萃取相；向乙酸乙酯相中加入无水硫酸钠除水分(2g/L)1h，通过抽滤瓶过滤滤液，收率99.57％。
G.使用50L旋转蒸发仪在30℃下对滤液进行减压浓缩，待浓缩液开始出现浑浊时转移至20L结晶罐内，于冷却槽内按10℃/h开始梯度降温析晶，降到温度4℃后，养晶2h，使用甲基叔丁基醚进行漂洗，抽滤完毕后得西罗莫司湿品。经真空干燥后，得西罗莫司成品，HPLC检测纯度为99.82％，单杂0.08％，收率98.77％。
实施例5
A.通过500L发酵罐获得发酵液340L，效价为1.21g/L，板框过滤收集菌丝体，用菌丝体质量的8倍体积(mL/g)的95％乙醇-水浸提2次菌丝体，每次2h，得到浸提液，浸提液中含西罗莫司，收率约97.52％，浸提液后续进行减压浓缩。
B.将菌丝体浸提液进行真空减压浓缩，直到蒸出乙醇浓度低于20％为止，添加浓缩液质量0.002倍的十二烷基苯磺酸钠，使用4倍体积的乙酸乙酯进行萃取，搅拌30min后，静置10h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，萃取收率约98.65％。
C.将乙酸乙酯萃取液通过压缩氮气通过含有型号为型号为bjrxyw-02活性碳纤维模块过滤器中，过滤器串联组成，每台过滤器内可装5支活性碳纤维模块，活性炭纤维模块的使用数量为120L(待脱色液体)/3支，脱色温度为45℃，pH为7.3，收集脱色滤液，取样通过HPLC测定含量及成分，脱色效果明显，滤液颜色较之前明显变浅，纯度94.23％，收率99.13％。
D.将收集的活性炭纤维脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩物，向浓缩物中添加2倍体积环丙醚，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，而后对析晶液进行抽滤，得到西罗莫司粗品，纯度98.51％，收率91.43％。
E.按照40％匀浆浓度使用10％乙醇将树脂(Unips40-300、100～200目)装入层析柱中，用20％乙醇溶液平衡，按照上样量17g/L，使用异丙醇的水溶液进行梯度洗脱，洗脱浓度为30％的4BV、50％的3BV和80％的4BV，洗脱前向洗脱液中添加(V/V＝1.5％)磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液缓冲液，按照出料后分段收集，经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥99.00％的洗脱液合并收集。合并液中西罗莫司纯度为99.43％，收率81.12％。
F.将收集的合格料液进行真空减压浓缩，温度40～45℃，直到蒸出乙腈浓度低于2～5％为止，停止浓缩，使用乙酸乙酯进行萃取(1:5，V/V)，收集萃取相；向乙酸乙酯相中加入无水硫酸钠除水分(2g/L)1h，通过抽滤瓶过滤滤液，收率99.79％。
G.使用50L旋转蒸发仪在35℃下对滤液进行减压浓缩，待浓缩液开始出现浑浊时转移至20L结晶罐内，于冷却槽内按9℃/h开始梯度降温析晶，降到温度4℃后，养晶3h，使用环丙醚进行漂洗，抽滤完毕后得西罗莫司湿品。经真空干燥后，得西罗莫司成品，HPLC检测纯度为99.81％，单杂0.08％，收率98.63％。
实施例6
A.通过500L发酵罐获得发酵液340L，效价为1.21g/L，板框过滤收集菌丝体，用菌丝体质量的5倍体积(mL/g)的95％乙醇-水浸提2次菌丝体，每次2h，得到浸提液，浸提液中含西罗莫司，收率约97.24％，浸提液后续进行减压浓缩。
B.将菌丝体浸提液进行真空减压浓缩，直到蒸出乙醇浓度低于20％为止，添加浓缩液质量0.002倍的十二烷基苯磺酸钠，使用3倍体积的乙酸乙酯进行萃取，搅拌20min后，静置10h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，萃取收率约98.86％。
C.将乙酸乙酯萃取液通过压缩氮气通过含有型号为型号为bjrxyw-04活性碳纤维模块过滤器中，过滤器串联组成，每台过滤器内可装5支活性碳纤维模块，活性炭纤维模块的使用数量为200L(待脱色液体)/3支，脱色温度为35℃，pH为6.5，收集脱色滤液，取样通过HPLC测定含量及成分，脱色效果明显，滤液颜色较之前明显变浅，纯度94.16％，收率99.21％。
D.将收集的活性炭纤维脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩物，向浓缩物中添加3倍体积环丙醚，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，而后对析晶液进行抽滤，得到西罗莫司粗品，纯度98.55％，收率91.56％。
E.按照60％匀浆浓度使用10％乙醇将树脂(色谱二号、100～200目)装入层析柱中，用20％乙醇溶液平衡，按照上样量20g/L，使用丙酮的水溶液进行梯度洗脱，洗脱浓度为30％的3BV、50％的3BV和70％的3BV，洗脱前向洗脱液中添加(V/V＝1.5％)磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液缓冲液，按照出料后分段收集，经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥99.00％的洗脱液合并收集。合并液中西罗莫司纯度为99.39％，收率84.51％。
F.将收集的合格料液进行真空减压浓缩，温度40～45℃，直到蒸出乙腈浓度低于2～5％为止，停止浓缩，使用乙酸乙酯进行萃取(1:3，V/V)，收集萃取相；向乙酸乙酯相中加入无水硫酸钠除水分(2g/L)1h，通过抽滤瓶过滤滤液，收率99.76％。
G.使用50L旋转蒸发仪在50℃下对滤液进行减压浓缩，待浓缩液开始出现浑浊时转移至20L结晶罐内，于冷却槽内按8℃/h开始梯度降温析晶，降到温度4℃后，养晶6h，使用乙醚进行漂洗，抽滤完毕后得西罗莫司湿品。经真空干燥后，得西罗莫司成品，HPLC检测纯度为99.90％，单杂0.07％，收率99.01％。
实施例7
A.通过500L发酵罐获得发酵液340L，效价为1.21g/L，板框过滤收集菌丝体，用菌丝体质量的9倍体积(mL/g)的90％乙醇-水浸提2次菌丝体，每次3h，得到浸提液，浸提液中含西罗莫司，收率约97.95％，浸提液后续进行减压浓缩。
B.将菌丝体浸提液进行真空减压浓缩，直到蒸出乙醇浓度低于20％为止，添加浓缩液质量0.002倍的十二烷基苯磺酸钠，使用4倍体积的乙酸乙酯进行萃取，搅拌30min后，静置7h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，萃取收率约98.65％。
C.将乙酸乙酯萃取液通过压缩氮气通过含有型号为bjrxyw-02活性碳纤维模块过滤器中，过滤器串联组成，每台过滤器内可装5支活性碳纤维模块，活性炭纤维模块的使用数量为200L(待脱色液体)/3支，脱色温度为30℃，pH为6.5，收集脱色滤液，取样通过HPLC测定含量及成分，脱色效果明显，滤液颜色较之前明显变浅，纯度94.24％，收率99.24％。
D.将收集的活性炭纤维脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩物，向浓缩物中添加3倍体积乙醚，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，而后对析晶液进行抽滤，得到西罗莫司粗品，纯度98.51％，收率91.43％。
E.按照60％匀浆浓度使用10％乙醇将树脂(PS40-300、100～150目)装入层析柱中，用20％乙醇溶液平衡，按照上样量9g/L，使用丙酮的水溶液进行梯度洗脱，洗脱浓度为30％的3BV、50％的4BV和60％的4BV，洗脱前向洗脱液中添加(V/V＝1.2％)磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液缓冲液，按照出料后分段收集，经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥99.00％的洗脱液合并收集。合并液中西罗莫司纯度为99.37％，收率83.75％。
F.将收集的合格料液进行真空减压浓缩，温度40～45℃，直到蒸出乙腈浓度低于2～5％为止，停止浓缩，使用乙酸乙酯进行萃取(1:4，V/V)，收集萃取相；向乙酸乙酯相中加入无水硫酸钠除水分(2g/L)1h，通过抽滤瓶过滤滤液，收率99.73％。
G.使用50L旋转蒸发仪在35℃下对滤液进行减压浓缩，待浓缩液开始出现浑浊时转移至20L结晶罐内，于冷却槽内按6℃/h开始梯度降温析晶，降到温度4℃后，养晶6h，使用乙醚进行漂洗，抽滤完毕后得西罗莫司湿品。经真空干燥后，得西罗莫司成品，HPLC检测纯度为99.89％，单杂0.08％，收率99.14％。
实施例8
A.通过500L发酵罐获得发酵液340L，效价为1.21g/L，板框过滤收集菌丝体，用菌丝体质量的5倍体积(mL/g)的90％乙醇-水浸提2次菌丝体，每次2h，得到浸提液，浸提液中含西罗莫司，收率约96.89％，浸提液后续进行减压浓缩。
B.将菌丝体浸提液进行真空减压浓缩，直到蒸出乙醇浓度低于20％为止，添加浓缩液质量0.002倍的十二烷基苯磺酸钠，使用3倍体积的乙酸乙酯进行萃取，搅拌20min后，静置9h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，萃取收率约98.76％。
C.将乙酸乙酯萃取液通过压缩氮气通过含有型号为型号为bjrxyw-08活性碳纤维模块过滤器中，过滤器串联组成，每台过滤器内可装5支活性碳纤维模块，活性炭纤维模块的使用数量为240L(待脱色液体)/3支，脱色温度为25℃，pH为6.5，收集脱色滤液，取样通过HPLC测定含量及成分，脱色效果明显，滤液颜色较之前明显变浅，纯度92.06％，收率94.31％。
D.将收集的活性炭纤维脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩物，向浓缩物中添加3倍体积环丙醚，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，而后对析晶液进行抽滤，得到西罗莫司粗品，纯度98.15％，收率91.33％。
E.按照60％匀浆浓度使用10％乙醇将树脂(色谱七号、100～200目)装入层析柱中，用20％乙醇溶液平衡，按照上样量20g/L，使用丙酮的水溶液进行梯度洗脱，洗脱浓度为30％的3BV、50％的3BV和80％的3BV，洗脱前向洗脱液中添加(V/V＝1.8％)磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液缓冲液，按照出料后分段收集，经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥99.00％的洗脱液合并收集。合并液中西罗莫司纯度为96.29％，收率66.25％。
F.将收集的合格料液进行真空减压浓缩，温度40～45℃，直到蒸出乙腈浓度低于2～5％为止，停止浓缩，使用乙酸乙酯进行萃取(1:3，V/V)，收集萃取相；向乙酸乙酯相中加入无水硫酸钠除水分(2g/L)1h，通过抽滤瓶过滤滤液，收率99.55％。
G.使用50L旋转蒸发仪在25℃下对滤液进行减压浓缩，待浓缩液开始出现浑浊时转移至20L结晶罐内，于冷却槽内按7℃/h开始梯度降温析晶，降到温度4℃后，养晶6h，使用乙醚进行漂洗，抽滤完毕后得西罗莫司湿品。经真空干燥后，得西罗莫司成品，HPLC检测纯度为99.78％，单杂0.09％，收率98.67％。
实施例9
A.通过500L发酵罐获得发酵液340L，效价为1.21g/L，板框过滤收集菌丝体，用菌丝体质量的9倍体积(mL/g)的90％乙醇-水浸提2次菌丝体，每次3h，得到浸提液，浸提液中含西罗莫司，收率约97.86％，浸提液后续进行减压浓缩。
B.将菌丝体浸提液进行真空减压浓缩，直到蒸出乙醇浓度低于20％为止，添加浓缩液质量0.002倍的十二烷基苯磺酸钠，使用4倍体积的乙酸乙酯进行萃取，搅拌30min后，静置7h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，萃取收率约98.89％。
C.将乙酸乙酯萃取液通过压缩氮气通过含有型号为bjrxyw-09活性碳纤维模块过滤器中，过滤器串联组成，每台过滤器内可装5支活性碳纤维模块，活性炭纤维模块的使用数量为200L(待脱色液体)/3支，脱色温度为30℃，pH为6.5，收集脱色滤液，取样通过HPLC测定含量及成分，脱色效果明显，滤液颜色较之前明显变浅，纯度89.52％，收率75.31％。
D.将收集的活性炭纤维脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩物，向浓缩物中添加3倍体积乙醚，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，而后对析晶液进行抽滤，得到西罗莫司粗品，纯度95.32％，收率89.46％。
E.按照60％匀浆浓度使用10％乙醇将树脂(色谱六号、100～150目)装入层析柱中，用20％乙醇溶液平衡，按照上样量9g/L，使用丙酮的水溶液进行梯度洗脱，洗脱浓度为30％的3BV、50％的4BV和60％的4BV，按照出料后分段收集，经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥99.00％的洗脱液合并收集。合并液中西罗莫司纯度为93.14％，收率61.12％。
F.将收集的合格料液进行真空减压浓缩，温度40～45℃，直到蒸出乙腈浓度低于2～5％为止，停止浓缩，使用乙酸乙酯进行萃取(1:4，V/V)，收集萃取相；向乙酸乙酯相中加入无水硫酸钠除水分(2g/L)1h，通过抽滤瓶过滤滤液，收率99.16％。
G.使用50L旋转蒸发仪在25℃下对滤液进行减压浓缩，待浓缩液开始出现浑浊时转移至20L结晶罐内，于冷却槽内按6℃/h开始梯度降温析晶，降到温度4℃后，养晶5h，使用乙醚进行漂洗，抽滤完毕后得西罗莫司湿品。经真空干燥后，得西罗莫司成品，HPLC检测纯度为99.81％，单杂0.1％，收率94.19％。
实施例10
对比层析型树脂填料与硅胶柱层析的差异
层析型填料选择色谱填料三号，硅胶柱层析填料选用粒径为230～300目不定型硅胶。
树脂柱按照50％匀浆浓度使用10％乙醇将树脂装入层析柱中，用20％乙醇溶液平衡，上样西罗莫司粗晶体3g，使用乙腈-水溶液进行梯度洗脱，洗脱溶液缓冲盐体系为三氟乙酸，添加量为洗脱溶剂的1％，洗脱比例为30％900mL、40％900mL、60％1200mL。按照出料后分段收集，经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥99％的洗脱液合并收集。对比CN104844620专利方法，使用正己烷按照50％匀浆浓度将60g230～300目硅胶装入层析柱中，使用正己烷层析柱1倍柱体积，用10mL正己烷丙酮混合液(3:1)溶解粗品，加入硅胶层析柱中，用3倍柱体积的正己烷和丙酮混合溶液(体积比为5:1)进行洗涤，用3倍柱体积的正己烷和丙酮混合液(体积比为4:1)进行洗脱，用2倍柱体积的正己烷和丙酮混合溶液(体积比为3:1)进行洗脱，收集洗脱液并真空浓缩得浓缩液，经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥98％的洗脱液合，减压浓缩至无液体蒸出。
层析型树脂填料与硅胶填料柱层析效果对比表
色谱填料三号 硅胶
合并料液纯度 99.65％ 99.23％
合并料液收率 94.64％ 63.90％
填料量 300mL 60g(300mL)
洗脱溶剂使用量 乙腈1.35L 正己烷、丙酮共计6L
从检查结果可以看出，层析型树脂填料对西罗莫司粗品的分离效果(收率94.64％＞63.90％，纯度99.65％＞99.23％)明显优于硅胶柱层析；其中树脂填料可重复利用，而硅胶只能使用一次，无法回收利用，固废量大造成较大环保压力；其中洗脱液中有机剂使用量层析型色谱1.35L远低于硅胶的6L，总体更利于环境保护。
对比实施例1
a.用菌丝体质量的5倍体积(mL/g)的90％的乙醇-水溶液抽提发酵液(340L，效价为1.21g/L)过滤后得到的菌丝体，浸提2次得到抽提液，浸提过程中对浸提液超声处理20min，真空浓缩得浓缩抽提液，收率约95.13％。
b.加入步骤a所得抽提液体积的2倍体积的乙酸乙酯萃取浓缩抽提液，添加(1:0.02kg/kg)无水硫酸锌和(1:0.002kg/kg)十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，搅拌15min后，静置8h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，分离乙酸乙酯相得萃取液，收率98.45％。
c.收集萃取液，添加(1:0.001，L/kg)医用针形活性炭，搅拌30min进行吸附处理，而后通过0.45μm的钛棒过滤器进行压滤得到乙酸乙酯脱色液，HPLC检测得知纯度为89.57％，收率90.75％。
d.收集的脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩液，向浓缩液中添加浓缩液体积的2倍体积环己烷，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，而后对析晶液进行抽滤，得到雷帕霉素粗品，HPLC检测得知纯度为98.59％，收率90.61％。
e.采用湿法装柱，根据粗品结晶质量柱层析硅胶300目质量比1:30称取硅胶装入层析柱中，使用正己烷平衡层析柱1倍柱体积，用14L丙酮正己烷混合液(4:1，V/V)溶解粗品，加入硅胶层析柱中，加入硅胶层析柱中，使用正己烷丙酮混合液(5:1，4:1，3:1，V/V)梯度洗脱，收集洗脱液并真空浓缩得浓缩液；经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥98％的洗脱液，减压浓缩至无液体蒸出，HPLC检测得知纯度为98.79％，收率88.63％。
f.将步骤e得到的浓缩液溶于40℃(4:1，V/V)环己烷丙酮混合液中降温析晶，结晶过程控制温度为0℃、时间为4h，抽滤的粗品，干燥得到雷帕霉素粗品，HPLC检测得知纯度为98.79％，收率90.63％。
g.用乙酸乙酯乙醚混合液(4:1，V/V)溶解雷帕霉素粗品，梯度降温(5℃/h)，最终结晶过程控制温度为-20℃，时间为8h，抽滤，干燥得到雷帕霉素纯品，HPLC检测得知纯度为99.61％，单杂0.09％，收率71.07％。
对比实施例2
a.340L发酵液(效价为1.21g/L)压滤得到菌丝体后，加入菌丝体重量的4倍(V/W)丙酮，搅拌4小时，过滤得到滤液，经HPLC检测滤液中雷帕霉素的纯度为86.78％，收率93.16％。用旋转蒸发器在50℃下真空度-0.09MPa下浓缩至无丙酮流出，得到浓缩液。向浓缩液中加入浸提液体积的4倍体积的乙酸乙酯，搅拌，分液漏斗中静置分层，收集乙酸乙酯层，得到乙酸乙酯层。加入1倍体积的3％NaHCO3溶液搅拌洗涤，分液后弃去水层，重复洗涤三次。最终得到乙酸乙酯层。乙酸乙酯层中加入0.2％(V弱碱/V乙酸乙酯)活性碳，40℃下搅拌脱色30分钟，抽滤收集滤液。乙酸乙酯中加入0.3％(V无水硫酸钠/V乙酸乙酯)无水硫酸钠搅拌5小时，抽滤得到黄色澄清液体。经HPLC检测乙酸乙酯中雷帕霉素纯度为34.31％，收率97.12％。向乙酸乙酯中加入10倍雷帕霉素质量的空白硅胶，在50℃，真空度约-0.09MPa条件下，浓缩至干粉，此为上样硅胶。
b.取空白硅胶，用石醚装柱，径高比为1:9。将上述得到的上样硅胶以干法上样的方式装入硅胶柱中。依次用2倍柱体积石油醚:乙酸乙酯为2:8、3:7、4:6、5:5的预洗液预洗。预洗结束后用石油醚:乙酸乙酯为7:13的解吸液解吸。收集纯度较高组份。解吸混合液在50℃下，真空度-0.09MPa下浓缩至干粉。得到白色的粗品I，纯度：88.12％，收率88.18％。
c.将粗品I用50％乙腈-水溶解，每克粗品I约用50mL50％的乙腈水溶液。经9LUniPS40大孔树脂吸附，吸附完毕后用63％乙腈解吸，收集纯度较高组份，得到解吸混合液。解吸混合液在40℃下，真空度-0.095MPa下浓缩。浓缩液降温至4℃～8℃，向其中加入浓缩液等体积的温度为4℃～8℃的二氯甲烷，搅拌30min后，分液漏斗中静置分层，收集二氯甲烷层。向二氯甲烷中加入无水硫酸钠，4℃～8℃搅拌脱水5小时后，抽滤得二氯甲烷层，真空减压浓缩至干，得粗品II，收率84.45％，HPLC纯度99.56％。
d.粗品II用乙醚快速搅拌溶解，然后降温至4℃～8℃，搅拌1小时。过滤收集晶体。真空干燥得到高纯度的雷帕霉素，纯度99.8％，单杂0.12％，收率96.10％。
对比实施例3
a.将500L发酵罐内获得的发酵液(340L，效价为1.21g/L)中加入0.1％硅藻土，进入压滤机过滤，获得湿菌丝体滤饼，搅拌加入1倍体积的甲醇50℃水浴条件下提取两次，每次120min，合并提取液和滤饼溶液，用2倍体积的氯仿萃取，得到氯仿萃取液，经真空浓缩后，得浓缩液，经HPLC检测滤液中雷帕霉素的纯度为89.14％，收率78.16％。
b.雷帕霉素粗品的制备是在1kg浓缩液中加入4L甲基叔丁基醚萃取浓缩液，有少量结晶吸出，收集结晶并用2500ml甲基叔丁基醚洗涤干燥，得到雷帕霉素，纯度95.07％，收率13.78％。用20L冷却到0-5℃，0.1mol/L的NaOH溶液洗涤，再用2份5L冷却到0～5℃、0.1mol/L的HCl溶液洗涤，用水洗涤至呈中性，浓缩，浓缩液中加入1.5L二异丙基醚，浓缩液中有结晶析出，收集结晶固体，用二异丙基醚洗涤后干燥，获得雷帕霉素粗晶体，纯度85.32％，收率51.9％。
c.雷帕霉素的精制是收集获得的粗雷帕霉素晶体溶解后上硅胶柱进行层析纯化，洗脱溶液为丙酮的己烷溶液(丙酮30％)，收集含有雷帕霉素的洗脱液，浓缩后加入雷帕霉素晶体作为种子，将溶液冷却至0～5℃，搅拌1小时后静置结晶。重结晶获得的雷帕霉素产品过滤后干燥获得雷帕霉素终产品，纯度95.65％，单杂0.15％，重结晶收率84.89％。
对比实施例4
a.吸附：将西罗莫司菌丝体的浸提液340L(效价为1.21g/L)减压浓缩成浓缩物，接着浓缩物中加入固体吸附剂硅藻土0.34kg，并搅拌、静置，然后倾沥除去液体得到残余物，经HPLC检测，西罗莫司纯度75.45％，收率87.32％。
b.萃取：加入17L乙酸乙酯至经过吸附处理所得的残余物中，并搅拌，然后过滤或离心除去固体，再将所得溶液静置以使溶液分为水、有机溶液两层，并除去水层以获得有机溶液，纯度78.21％，收率85.47％。
c.洗涤浓缩：加入上述有机溶液体积的0.1倍的饱和食盐水至经过萃取处理所得有机溶液中，对有机溶液进行洗涤，并除去水层，得到剩余物；再加无水硫酸钠至上述剩余物中干燥3小时，然后过滤以获得滤液，最后将滤液减压浓缩，得黑褐色油状物，收率92.13％。
d.洗涤：加入上述油状物体积的0.5倍的非极性溶剂石油醚至经过洗涤浓缩处理所得的油状物中，并搅拌、静置，然后除去非极性溶剂以获得残留物，收率90.16％。
e.结晶：加入上述残留物体积的0.5倍的结晶溶剂乙醚至经过前一步洗涤处理所得的残留物中，并搅拌溶解，即获得西罗莫司溶液，接着将西罗莫司溶液在室温下放置2h，然后过滤除去液体，得到西罗莫司晶体，纯度80.41％，收率78.79％。
f.洗晶干燥：用结晶溶剂乙醚洗涤结晶中获得的西罗莫司晶体三次，然后将洗涤后的西罗莫司晶体置于45℃下减压干燥4h，即得产品西罗莫司粗晶，纯度82.47％，单杂0.13％，收率71.89％。
对比实施例5
a.收集含有雷帕霉素的发酵液((340L，效价为1.21g/L))，过滤，分离得到发酵液和菌丝体；
b.向菌丝体中加入为其3倍体积的丙酮，在28Hz、600r/min条件下搅拌2h，过滤，得菌丝体提取液；
c.将菌丝体提取液和发酵液胺体积比为1:1的比例混合，然后加入混合液3倍体积的乙酸乙酯-丙酮混合物，萃取2次，每次3h，合并萃取液，向合并后的萃取液中加入活性炭，搅拌40min，过滤，减压浓缩，然后溶解，再加入溶解液2倍体积的95％乙醇，搅拌均匀，静置40min，过滤，将滤液蒸干，得雷帕霉素粗品；其中，乙酸乙酯和丙酮的体积比为2.8:1.4；活性炭在萃取液中的浓度为0.08g/L，经HPLC检测纯度87.31％，收率67.87％；
d.用乙酸乙酯-丙酮混合物溶解雷帕霉素粗品，并将其加入硅胶层析柱中，用乙酸乙酯-丙酮混合物作为流动相进行梯度洗脱，每次洗脱3支柱体积，分段收集洗脱液，经薄层层析检测后，合并馏分；其中，梯度洗脱的具体过程为：将乙酸乙酯和丙酮分别按照体积比为1:0、2:1、1:2、1:6、1:20的比例依次进行梯度洗脱，每次洗脱3个柱体积，纯度96.34％，收率78.64％；
e.蒸干浓缩合并后的馏分，乙醇溶解，再用乙醚重结晶3次，分离纯化得到纯度98.27％、单杂0.11％、结晶收率为98.65％的雷帕霉素。

Claims (10)

1.一种西罗莫司的分离纯化方法，其特征在于，它包括如下内容：通过微生物发酵培养出含西罗莫司的发酵液，提取分离纯化采用菌丝体收集、浸提、萃取、活性炭纤维脱色、粗结晶、树脂柱层析和结晶得到西罗莫司。
2.根据权利要求1所述西罗莫司的分离纯化方法，其特征在于，它包括如下步骤：
A.浸提：
收集西罗莫司发酵液，过滤得菌丝体，将菌丝体浸入有机溶剂中，浸提后过滤，得到菌丝体浸提液；
B.萃取：
将西罗莫司浸提液进行真空减压浓缩，向浓缩液中加入十二烷基苯磺酸钠，使用乙酸乙酯进行一次萃取，收集萃取相；
C.活性炭纤维脱色：
将萃取液通过含有活性炭纤维的过滤器，收集脱色滤液；
D.粗结晶：
将步骤C所得的滤液减压浓缩，收集浓缩液，向浓缩液中添加析晶溶剂，析晶、抽滤，即可得到西罗莫司粗品；
E.树脂柱层析：
使用流动相溶解西罗莫司粗品，加入树脂柱中，树脂柱填料为层析型树脂填料，洗脱前向洗脱溶剂中加入缓冲盐添加剂，出料后分段收集，同时使用HPLC在线检测，收集含西罗莫司的流出液；
F.萃取：
将步骤E所述流出液进行真空减压浓缩，使用乙酸乙酯进行萃取，收集萃取相；向萃取相中加入无水硫酸钠吸附水分，过滤，收集滤液；
G.结晶：
将步骤F收集的滤液真空浓缩，然后降温析晶，抽滤，使用乙醚、甲基叔丁基醚或环丙醚进行漂洗，抽滤，真空干燥，即得西罗莫司成品，取样进行HPLC检测。
3.根据权利要求2所述西罗莫司的分离纯化方法，其特征在于，步骤C中所述的活性炭纤维的型号选自bjrxyw-01、bjrxyw-02、bjrxyw-03或bjrxyw-04中的一种，脱色温度20～45℃，pH＝6.5～7.5。
4.根据权利要求2所述西罗莫司的分离纯化方法，其特征在于，步骤D中所述的析晶溶剂选自甲基叔丁基醚、乙醚、环丙醚或环己烷中一种，加入体积为浓缩液体积的1～3倍。
5.根据权利要求2所述西罗莫司的分离纯化方法，其特征在于，步骤E中所述的树脂柱填料选自聚苯乙烯型、聚丙烯酸型或聚苯乙烯/二乙烯基苯层析型树脂中的一种。
6.根据权利要求2或5所述西罗莫司的分离纯化方法，其特征在于，步骤E中所述树脂柱填料选自HP20SS、色谱一号至五号、Unips40-300和PS40-300中的一种。
7.根据权利要求2所述西罗莫司的分离纯化方法，其特征在于，步骤E中所述的洗脱溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮或异丙醇的水溶液，洗脱溶剂中有机溶剂的体积浓度为30～80％。
8.根据权利要求2所述西罗莫司的分离纯化方法，其特征在于，步骤E中所述的缓冲盐添加剂为pH6.0～6.5的缓冲盐，选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、乙酸-乙酸铵缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液或三氟乙酸缓冲液中的一种，缓冲盐添加剂的加入体积为洗脱溶剂体积的0.5～1.5％。
9.根据权利要求2所述西罗莫司的分离纯化方法，其特征在于，步骤E中所述的树脂层析柱的上样量为8～20g/L。
10.根据权利要求2所述西罗莫司的分离纯化方法，其特征在于，步骤G中所述的真空浓缩的温度为30～50℃，并按5～10℃/h梯度降温析晶。
CN202010020181.XA 2020-01-09 2020-01-09 一种西罗莫司的分离纯化方法 Active CN113087723B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010020181.XA CN113087723B (zh) 2020-01-09 2020-01-09 一种西罗莫司的分离纯化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010020181.XA CN113087723B (zh) 2020-01-09 2020-01-09 一种西罗莫司的分离纯化方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113087723A true CN113087723A (zh) 2021-07-09
CN113087723B CN113087723B (zh) 2023-07-28

Family

ID=76663711

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010020181.XA Active CN113087723B (zh) 2020-01-09 2020-01-09 一种西罗莫司的分离纯化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113087723B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113970605A (zh) * 2021-10-13 2022-01-25 江苏协合转化医学研究院有限公司 一种筛选金花葵中活性物质的方法
CN114315860A (zh) * 2021-12-27 2022-04-12 无锡福祈制药有限公司 一种西罗莫司粗品的制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008059516A2 (en) * 2006-08-21 2008-05-22 Concord Biotech Limited Process for purification of macrolides
CN102443012A (zh) * 2010-10-13 2012-05-09 山东新时代药业有限公司 一种从发酵液中提纯雷帕霉素的方法
KR20120076840A (ko) * 2010-12-30 2012-07-10 (주)에이치앤에이치바이온 다단계 결정화 방법을 이용한 고순도 라파마이신의 제조방법
CN104262358A (zh) * 2014-09-29 2015-01-07 常州兰陵制药有限公司 提取雷帕霉素的方法
CN104844620A (zh) * 2015-04-10 2015-08-19 鲁南新时代生物技术有限公司 一种雷帕霉素的分离纯化方法
CN107573362A (zh) * 2017-10-31 2018-01-12 无锡福祈制药有限公司 一种从发酵液中分离提纯西罗莫司的方法
CN108250217A (zh) * 2016-12-29 2018-07-06 天津领世生物科技开发有限公司 一种制备免疫抑制剂西罗莫司的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008059516A2 (en) * 2006-08-21 2008-05-22 Concord Biotech Limited Process for purification of macrolides
CN102443012A (zh) * 2010-10-13 2012-05-09 山东新时代药业有限公司 一种从发酵液中提纯雷帕霉素的方法
KR20120076840A (ko) * 2010-12-30 2012-07-10 (주)에이치앤에이치바이온 다단계 결정화 방법을 이용한 고순도 라파마이신의 제조방법
CN104262358A (zh) * 2014-09-29 2015-01-07 常州兰陵制药有限公司 提取雷帕霉素的方法
CN104844620A (zh) * 2015-04-10 2015-08-19 鲁南新时代生物技术有限公司 一种雷帕霉素的分离纯化方法
CN108250217A (zh) * 2016-12-29 2018-07-06 天津领世生物科技开发有限公司 一种制备免疫抑制剂西罗莫司的方法
CN107573362A (zh) * 2017-10-31 2018-01-12 无锡福祈制药有限公司 一种从发酵液中分离提纯西罗莫司的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘玉荣: "《碳材料在超级电容器中的应用》", 北京：国防工业出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113970605A (zh) * 2021-10-13 2022-01-25 江苏协合转化医学研究院有限公司 一种筛选金花葵中活性物质的方法
CN114315860A (zh) * 2021-12-27 2022-04-12 无锡福祈制药有限公司 一种西罗莫司粗品的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113087723B (zh) 2023-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111807932A (zh) 一种从大麻中提取纯化大麻二酚的方法
CN113087723B (zh) 一种西罗莫司的分离纯化方法
CN104844620B (zh) 一种雷帕霉素的分离纯化方法
CN102443012B (zh) 一种从发酵液中提纯雷帕霉素的方法
US7473366B2 (en) Process for the purification of macrolides
CN113563361B (zh) 一种从伯克霍尔德菌发酵液提取fr901464的方法
CN105585578B (zh) 一种雷帕霉素的制备方法
CN106432276A (zh) 一种采用新型智能化结晶技术制备的头孢唑林钠化合物及其制剂
CN111171096B (zh) 一种多杀菌素的提取方法
KR101202379B1 (ko) 다단계 결정화 방법을 이용한 고순도 라파마이신의 제조방법
CN103554133A (zh) 一种制备高纯度他克莫司的工艺
CN111547718A (zh) 复合型活性炭及其在纯化他克莫司中的应用
CN109651391B (zh) 一种从青蒿素重结晶废料中回收青蒿素的方法
CN112480127A (zh) 一种生产丝裂霉素的新方法
CN107417750B (zh) 一种从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷的方法
CN112390817B (zh) 一种盐析萃取他克莫司发酵液的方法
KR100910165B1 (ko) 은 이온 용액 추출을 이용한 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제방법
CN110862427A (zh) 一种庆大霉素C1a的纯化方法
KR101033845B1 (ko) 은 이온 용액 결정화에 의한 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제방법
CN108250216A (zh) 一步精制他克莫司粗品中他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素的方法
CN116102577A (zh) 一种高纯度他克莫司及其制备方法
CN111995631A (zh) 一种雷帕霉素的纯化方法
CN101712686B (zh) 一种发酵液中他克莫司的分离纯化方法
CN116063254A (zh) 一种纯化奥利司他粗品的方法
CN117402129A (zh) 一种麦考酚酸类似物的提纯方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant