CN113009012A - 4-氯丁酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种4‑氯丁酸的检测方法，尤其涉及原料药中4‑氯丁酸物质的检测方法。采用气相色谱‑质谱联用法进行检测，包括将待测样品中的4‑氯丁酸衍生为4‑氯丁酸酯；其中，气相色谱检测的条件包括：色谱柱，选用5％苯基‑95％‑二甲基聚硅氧烷共聚物固定液色谱柱。本发明提供的4‑氯丁酸的检测方法简单稳定可靠，可用于原料药中4‑氯丁酸残留检测。
Description
技术领域
本发明涉及4-氯丁酸的检测方法，尤其涉及原料药中4-氯丁酸的检测方法。
背景技术
4-氯丁酸是一种无色透明液体，在原料药合成过程中，它是最为常用的医药方面的中间体之一。近年来，原料药中基因毒杂质研究要求的提高，使得如4-氯丁酸等物质被确定为基因毒杂质，成为原料药检测中必需研究内容。基因毒性杂质来源于原料药合成过程中的起始物料、中间体、试剂和反应副产物，也可能是由药物在合成、储存或者制剂过程中降解产生的。其特点是在低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，进而导致基因突变并可能促使肿瘤发生，对人体用药安全性产生威胁。在现有的药品质量控制标准中，需进行严格控制。
目前，针对4-氯丁酸的检测无成熟可靠稳定的方法，无法实现原料药中的4-氯丁酸残留的限度控制和制定相应的质量检测标准。
发明内容
本发明提供一种4-氯丁酸的检测方法，该方法简单稳定可靠，可以用于原料药中4-氯丁酸残留检测。
一种4-氯丁酸的检测方法，采用气相色谱-质谱联用法进行检测，包括：
将待测样品中的4-氯丁酸衍生为4-氯丁酸酯；
其中，气相色谱检测的条件包括：
色谱柱，选用5％苯基-95％-二甲基聚硅氧烷共聚物固定液色谱柱。
根据本发明实施例，将待测样品中的4-氯丁酸衍生为4-氯丁酸甲酯或4-氯丁酸乙酯，具体可使用甲醇或乙醇进行衍生。发明人发现，使用甲醇进行衍生，能够兼顾衍生反应和样品的溶解性。
根据本发明实施例，将待测样品中的4-氯丁酸衍生为4-氯丁酸甲酯的反应历程如下：
以上衍生反应在硫酸的催化作用下进行。该衍生反应可在室温下即可进行，无需加热等特殊反应条件。
类似地，4-氯丁酸与乙醇反应可衍生为4-氯丁酸乙酯。
采用通常的气相检测方法，4-氯丁酸在进样口处不稳定，通常较难进行检测，无法实现直接检测。本发明人研究发现，将待测样品中的4-氯丁酸衍生为4-氯丁酸酯后，衍生后产物化学性质相对稳定，且在色谱柱中有良好的保留性质，可以采用气相色谱-质谱联用仪器进行定量检测。
根据本发明实施例，以上衍生反应在顶空瓶内衍生，衍生后直接进样检测。
根据本发明实施例，以上衍生反应(例如在顶空瓶内衍生)的温度为80-90℃，反应时间为30-40min，这样可以保证4-氯丁酸与衍生剂完全反应并且生成稳定的衍生产物，检测时信号响应良好，峰型良好具有较高的检测灵敏度。本发明所述的衍生剂是指能够与4-氯丁酸反应生成4-氯丁酸酯的醇，例如甲醇或乙醇。
根据本发明实施例，载气为氮气，流速范围为0.9～1.1ml/min，具体流速值需进行方法开发时，结合对照品的出峰时间，进行调整，使对照品出峰时间在10min内。在该时间段内，为升温程序初始升温阶段，仪器基线平稳，利于检测方法中灵敏度的提高，同时也有利于对照品在低浓度检出，具有较低的检测限和定量限。
根据本发明实施例，进样体积，采用顶空进样模式，进样体积固定为1ml，结合对照品仪器信号响应，可适当调整分流比，保证色谱峰的峰型、灵敏度和信号响应强度。
根据本发明实施例，进样口温度，依据4-氯丁酸甲酯沸点，将温度设定为250-280℃，以保证检测时，实现样品的完全气化。
分流比，设定在10:1～20:1范围内，分流比设定同样结合对照品的仪器信号响应，作适当调整，同时需保证色谱峰的峰型，拖尾因子等要求。此外，还需考虑溶剂效应对进样产生的干扰，需通过分流比进行调整后消除。
根据本发明实施例，升温程序，参照具体的供试品种类进行调整，依据衍生后4-氯丁酸甲酯的出峰时间设定初始柱温，后续适当增加升温速率，使供试品内杂质峰尽快流出色谱柱，减少对后续样品进样检测的干扰。
根据本发明实施例，升温程序为初始柱温：80℃，维持8min；以20-30℃/min速率升温至285℃，保持2min。
根据本发明实施例，离子源，选择仪器配置离子源种类，电子能量采用固定值，温度采用固定数值。
根据本发明实施例，监测模式，优先选用选择离子扫描监测模式，离子选择需参照对照品的质谱图，选择响应强度高，电离稳定的离子，依据具体的检测要求做相应调整。如仪器性能良好，状态稳定，可以考虑采用多反应监测模式，选择合适的离子对，进行检测，此时需优化碰撞能参数，调节碰撞能量值。
上述参数，优先调整气相部分参数，使对照品有合适的出峰时间和峰型，再调整质谱部分参数，使信号响应达到检测灵敏度和限度要求。
根据本发明实施例，气相色谱的检测条件如下：
色谱柱：HP-5MS UI(30m*250μm*0.25μm)；
流速：1ml/min；
升温程序：初始柱温：80℃，维持8min；
以20℃/min速率升温至285℃，保持2min；
载气：氮气；
进样口温度：250℃；
进样体积：1ml；
分流比：10:1。
根据本发明实施例，顶空温度90℃，顶空平衡时间40min。
根据本发明实施例，质谱的检测条件如下：
离子源温度：230℃；
MS1四极杆温度：150℃；
电子能量：70ev；
扫描方式：SIM；
扫描离子：m/z 74。
根据本发明实施例，样品检测及分析可采用标准曲线法和外标法对原料药中4-氯丁酸进行定量检测。标准曲线法，对照品溶液配制浓度范围需涵盖原料药中4-氯丁酸的限度。外标法，对照品溶液浓度为原料药中4-氯丁酸的限度浓度。
根据本发明实施例，所述待测样品包括左乙拉西坦、维拉佐酮、卡普氯铵、利奈唑胺、盐酸考尼伐坦等。
本发明检测方法可采用气相色谱-质谱联用仪进行检测。
本发明采用气相色谱-质谱联用仪，通过具体的4-氯丁酸衍生条件，仪器检测条件和操作细节设计，以使4-氯丁酸高效转化为化学性质相对稳定的4-氯丁酸甲酯，该物质在色谱柱内具有良好的保留，可以实现快速检测，同时还可保证仪器检测灵敏度满足限度检测要求。
本发明方法采用气相色谱-质谱联用技术，充分考虑4-氯丁酸物质的理化性质，实现4-氯丁酸的简单衍生、快速检测，为原料药中的基因毒杂质控制提供准确的检测数据，实现原料药中4-氯丁酸的精准质量控制。
附图说明
图1为本发明实施例1中4-氯丁酸衍生后总离子流图。
图2为本发明实施例1中保留时间4.506min处质谱图。
图3为本发明实施例1中仪器自带标准谱库比对质谱图。
图4为本发明实施例2中4-氯丁酸检测方法专属性色谱图。
图5为本发明实施例2中4-氯丁酸线性标准曲线(浓度范围60～6000ng/ml)。
图6为本发明对比例1中4-氯丁酸未经衍生直接进样检测总离子流图。
图7为本发明对比例1中保留时间8.285min处质谱图。
图8为本发明对比例1中调整后4-氯丁酸检测方法(SIM m/z60)色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下所用气相色谱-质谱联用仪为Agilent公司7890B+7000D型GC-MS。
以下色谱柱HP-5MS UI(30m*250μm*0.25μm)购自Agilent公司。
实施例1
以甲醇衍生检测4-氯丁酸为例，进行具体试验。
(1)4-氯丁酸衍生条件和初步检测仪器条件
溶剂：甲醇
4-氯丁酸贮备液：取4-氯丁酸约24mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得0.24mg/ml贮备液。
6μg/ml 4-氯丁酸溶液：精密量取0.24mg/ml 4-氯丁酸贮备液5ml置200ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀即得。取5ml置20ml顶空瓶中，滴加50μl硫酸，压盖密封，进样分析。
检测方法如下：依次在样品盘中排列甲醇，6μg/ml 4-氯丁酸溶液，参照表1中仪器条件，衍生后进样检测。
初始检测仪器参数条件如下表1：
表1 4-氯丁酸检测仪器参数设置
图1为4-氯丁酸衍生后总离子流图，结果表明在该衍生条件和仪器条件下，4-氯丁酸经甲醇衍生后，可以检测到衍生产物，信号响应和峰型良好。
图2为保留时间4.506min处质谱图，结果表明在该处可能为4-氯丁酸衍生产物4-氯丁酸甲酯。
图3为仪器自带标准谱库比对质谱图，结果表明在该处为4-氯丁酸甲酯。
实施例2 4-氯丁酸衍生检测仪器条件确定和方法学验证
在实施例1基础上，将定量离子确定为74，调整后仪器参数如下表2：
表2 4-氯丁酸检测仪器参数设置
线性溶液配制：依次精密量取浓度为6μg/ml的4-氯丁酸贮备液3ml、1.0ml、0.5ml、0.1ml分别置10ml容量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀即得线性标准曲线用溶液。分别精密量取各线性标准曲线用溶液5ml，置20ml顶空瓶中，滴加50μl硫酸，压盖密封，进样分析，记录色谱图和峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作图，即得线性标准曲线。
供试品溶液配制：取成品左乙拉西坦约208mg，精密称定，置20ml顶空瓶中，加5ml甲醇溶解，滴加50μl硫酸，压盖密封，进样分析。
空白溶剂：取5ml甲醇置20ml顶空瓶中，滴加50μl硫酸，压盖密封，进样分析。
加标供试品溶液配制：精密量取浓度为6μg/ml的4-氯丁酸溶液2.5ml置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得50％对照品溶液。取成品约208mg，精密称定，置20ml顶空瓶中，加5ml 50％对照品溶液溶解，滴加50μl硫酸，压盖密封，进样分析，平行配制3份；精密量取6μg/ml的4-氯丁酸溶液5ml置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得100％对照品溶液。取成品约208mg，精密称定，置20ml顶空瓶中，加5ml 100％对照品溶液溶解，滴加50μl硫酸，压盖密封，进样分析，平行配制3份；精密量取0.24mg/ml的4-氯丁酸溶液1ml置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得800％对照品溶液。取成品约208mg，精密称定，置20ml顶空瓶中，加5ml 800％对照品溶液溶解，滴加50μl硫酸，压盖密封，进样分析。平行配制3份。
图4为4-氯丁酸检测方法专属性色谱图，结果表明空白溶剂甲醇和样品左乙拉西坦均对4-氯丁酸的检测不产生干扰，并且4-氯丁酸回收率满足检测要求，该方法专属性良好满足分析检测要求。
图5为4-氯丁酸线性标准曲线(浓度范围60～6000ng/ml)。
表3 4-氯丁酸加标回收率数据
以上结果表明，本发明检测方法的检测灵敏度和专属性满足检测要求，可以实现药品中4-氯丁酸的精确含量检测。
对比例1未经衍生采用直接进样检测4-氯丁酸
溶剂：乙腈
4-氯丁酸贮备液：取4-氯丁酸约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀即得2mg/ml贮备液。
100μg/ml 4-氯丁酸溶液：精密量取2mg/ml 4-氯丁酸贮备液0.5ml置10ml量瓶，用乙腈稀释至刻度，摇匀即得。
检测方法如下：取100μg/ml 4-氯丁酸溶液1ml置进样小瓶中，进样分析。
4-氯丁酸初步检测仪器设定条件见表4。
表4 4-氯丁酸直接进样检测仪器参数设置
图6为4-氯丁酸未经衍生直接进样检测总离子流图，结果表明在该仪器条件下，4-氯丁酸直接进样，信号响应低，峰型较差。
图7为保留时间8.285min处质谱图，结果表明在该处为4-氯丁酸。
在对比例1基础上，为提高检测的灵敏度，将4-氯丁酸检测的定量离子确定为60，调整后仪器参数如下表5：
表5 4-氯丁酸直接进样检测仪器参数设置
检测方法如下：取100μg/ml 4-氯丁酸溶液1ml置进样小瓶中，采用表5中仪器参数进样分析。
图8为调整后4-氯丁酸检测方法(SIM m/z60)色谱图，结果表明在该条件下，色谱图保留时间8.285min处，4-氯丁酸未出峰，采用直接进样检测的方法不能用于样品检测。
综上可知，采用本发明优化后气相色谱-质谱仪器检测参数，将4-氯丁酸衍生后直接进样进行检测，具有短时间内快速高灵敏度检测的优势，可以实现原料药中4-氯丁酸的准确定量检测。本发明检测方案适用性广，对于原料药中使用的4-氯丁酸均适用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种4-氯丁酸的检测方法，采用气相色谱-质谱联用法进行检测，包括：
将待测样品中的4-氯丁酸衍生为4-氯丁酸酯；
其中，气相色谱检测的条件包括：
色谱柱，选用5％苯基-95％-二甲基聚硅氧烷共聚物固定液色谱柱。
2.根据权利要求1所述的4-氯丁酸的检测方法，其中，将待测样品中的4-氯丁酸衍生为4-氯丁酸甲酯或4-氯丁酸乙酯。
3.根据权利要求1或2所述的4-氯丁酸的检测方法，其中，所述衍生反应在顶空瓶内衍生，衍生后直接进样检测。
4.根据权利要求1-3任一项所述的4-氯丁酸的检测方法，其中，所述衍生反应的温度为80-90℃，反应时间为30-40min。
5.根据权利要求1-4任一项所述的4-氯丁酸的检测方法，其中，所用载气为氮气，流速范围为0.9～1.1ml/min。
6.根据权利要求1-5任一项所述的4-氯丁酸的检测方法，其中，采用顶空进样模式，进样体积固定为1ml。
7.根据权利要求1-6任一项所述的4-氯丁酸的检测方法，其中，进样口温度为250-280℃。
8.根据权利要求1-7任一项所述的4-氯丁酸的检测方法，其中，分流比设定在10:1～20:1范围内。
9.根据权利要求1-8任一项所述的4-氯丁酸的检测方法，其中，升温程序为初始柱温：80℃，维持8min；以20-30℃/min速率升温至285℃，保持2min。
10.根据权利要求1-9任一项所述的4-氯丁酸的检测方法，其中，所述待测样品包括左乙拉西坦、维拉佐酮、卡普氯铵、利奈唑胺、盐酸考尼伐坦。
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