CN112956677A - 一种精酿酱油的制备方法与应用 - Google Patents

一种精酿酱油的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种精酿酱油的制备方法与应用，具体涉及食品生物技术领域，包括如下步骤：(1)将大豆或豆粕经蒸煮处理后与小麦粉混合均匀，得到混合物，冷却至常温，接种曲精，制曲，得到大曲；(2)将步骤(1)所述大曲与盐水混合均匀，在发酵容器内采用高盐稀态酱油酿造方法进行发酵，在发酵的过程中进行负压处理，发酵结束后杀菌灭酶，压榨，过滤取滤液，得到所述精酿酱油。本发明通过在发酵过程中形成负压可有效降低酱油中挥发性盐基氮含量，制备出的酱油的鲜味显著提高，咸味明显降低，整体风味明显提高。

Description

一种精酿酱油的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种精酿酱油的制备方法与应用。
背景技术
酿造酱油是以大豆或豆粕、小麦或麸皮、食盐经过固态制曲、液态发酵等程序酿制而成的一种色、香、味俱全的液体调味品。酱油中含有多种人体所必需的氨基酸及其衍生物、呈味肽及其衍生物、有机酸及其衍生物、糖分、矿物质、维生素等营养物质，具有营养丰富、色香味俱全等特点。由于发酵原料、原料配比、菌种、发酵工艺及条件的不同，酱油中的成分具有很大的差别，从而影响酱油的风味和品质。
酱油中的风味物质包括游离氨基酸、氨基酸衍生物、呈味肽和有机酸等，其中游离氨基酸、氨基酸衍生物和呈味肽是目前研究的重点。常见的呈味氨基酸如谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸等。常见的氨基酸衍生物如乳酸酰苯丙氨酸、琥珀酰氨基酸以及氨基酸与葡萄糖的美拉德反应产物等。酱油中的呈味肽主要集中在1000-5000Da之间，但最近分子量小于1000Da的寡肽也成为研究的热点，包括甜味肽、苦味肽、酸味肽、咸味肽、鲜味肽和厚味肽等。其中，鲜味肽是酱油中最重要的呈味肽之一，具有显著的增鲜、增香作用。如Kuroda等通过高效液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)和衍生化技术对市售6种深色酱油、2种浅色酱油和1种白色酱油中γ-Glu-Val-Gly的含量进行了研究，结果表明γ-Glu-Val-Gly广泛存在于酱油中，含量在0.15～0.61mg/dL范围内。目前提高酱油风味的方法主要集中在添加外源性酶制剂、接种新的微生物，如乳酸菌等、改变酱油发酵工艺等方面。如山东食圣酿造食品有限公司公开了一种利用混合酶制剂再发酵酱油的生产方法(申请(专利)号：CN202010315992.2),包括以下步骤：原料处理、蒸料、混合制曲、制酱醪、入罐发酵、压榨、再发酵、灭菌；所述肽酶、谷氨酰胺酶、纤维素酶、果胶酶的重量比为5:3:1:1,淡盐水的浓度为8～12g/100ml,混合酶制剂中混合酶与淡盐水的重量比为1:4～6,混合酶制剂的添加重量为生酱油的1‰。本发明通过在酱油发酵完成压榨后的生酱油中添加混合酶制剂,进行酱油再发酵,实现增加酱油鲜度,有效减少酱油一次沉淀。
挥发性盐基氮(TVB-N)指酱油发酵过程中游离氨基酸由于固态发酵中杂菌污染或液态发酵过程中耐盐微生物污染产氨基酸脱羧酶或氨基酸脱氨酶的作用下产生的铵盐或胺。此类物质具有挥发性，其含量越高，表明氨基酸被破坏的越多。此外，酱油中生物胺也是国内外酱油生产企业的关注点。生物胺是一类具有生物活性的低分子生物碱，广泛存在于自然界中，主要有脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等)、芳香族(酪胺、苯乙胺等)和杂环族(组胺、色胺等)三大类。据刘晓艳等人报道(中国酿造.2020年09期第37-41页)，酱油在发酵过程中很容易产生生物胺，导致酱油潜在的不安全性。生物胺含量往往与原料中蛋白含量有关，蛋白含量越高，发酵制品中检测到的各生物胺含量也会越高。发酵类食品中的生物胺主要有酪胺、β-苯乙胺、亚精胺、精胺、腐胺、尸胺、组胺、色胺、等，由前体物质酪氨酸、β-苯乙氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、色氨酸脱羧而来。通常人类摄入微量生物胺不会对人体产生毒副作用，但在体内积累到一定程度时就会产生毒害作用。因此，降低天然发酵酱油原油中生物胺含量对提高酱油的安全性具有重要意义。江南大学方芳等人公开了一种可降解生物胺的多铜氧化酶重组酶(授权公布号：CN108165515B)。该方法是在酱油加入适量多铜氧化酶重组酶,该酶由副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)中的多铜氧化酶基因在大肠杆菌中异源表达产生,多铜氧化酶重组酶分解生物胺为醛和氨,从而达到降低生物胺的目的。该酶具有较强的降解生物胺的性能,在24h内能够降解色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺,精胺、亚精胺,降解效率最高可达75％。但多铜氧化酶重组酶并非食品工业允许的食品添加加，因此这一方法存在法律违规的风险。
夏小乐公开了一种复合菌种降低酱油中氮代谢危害物含量的方法(申请(专利)号：CN201910238580.0)。利用木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌联合发酵,使其分别从降低生物胺和氨基甲酸乙酯的积累两个方面共同控制酱油中氮代谢危害物。在酱油发酵过程中,以1：1的数量比例于成曲与盐水混合时同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌进行发酵时,可将酱油成品中总生物胺含量降低64.2％,氨基甲酸乙酯含量降低77.2％,同时氨基态氮提升61.1％。这一工艺较为复杂，且可能对酱油风味产生不良影响。
中国计量大学公开了一种采用山梨酸钾控制酱油中生物胺含量的方法(申请(专利)号：CN201910058780.8)。脱脂大豆和小麦在密闭制曲机中制曲,成曲与NaCl溶液混匀后发酵,酱醅发酵过程中,添加山梨酸钾。山梨酸钾是食品常用防腐剂，可抑制微生物生长，但山梨酸钾本省价格较贵，仅部分企业用山梨酸钾防腐。
然而，迄今为止，尚未见从利用物理方法提高酱油风味、降低酱油中挥发性盐基氮和生物含量的方法。
发明内容
为此，本发明提供一种精酿酱油的制备方法与应用，通过在发酵过程中形成负压可有效降低酱油中挥发性盐基氮含量，制备出的酱油的鲜味显著提高，咸味明显降低，整体风味明显提高。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：一种精酿酱油的制备方法与应用，包括如下步骤：
(1)将大豆或豆粕经蒸煮处理后与小麦粉混合均匀，得到混合物，冷却至常温，接种曲精，制曲，得到大曲(成曲)；
(2)将步骤(1)所述大曲与盐水混合均匀，在发酵容器内采用高盐稀态酱油酿造方法(参照GB18186-2000)进行发酵，在发酵的过程中进行负压处理，发酵结束后杀菌灭酶，压榨，过滤取滤液，得到所述精酿酱油。
进一步地，步骤(1)所述蒸煮处理的温度为120℃-130℃，蒸煮处理的时间为15min-30min。
进一步地，当步骤(1)选用大豆时，所述大豆与小麦粉的质量比为5:1-1:1；当步骤(1)选用豆粕时，所述豆粕与小麦粉的质量比为5:1-1:1。
进一步地，步骤(1)所述曲精的质量为混合物质量的0.02wt％-0.2wt％；所述曲精为米曲霉曲精、酱油曲霉曲精中的一种以上。
进一步地，步骤(1)所述制曲的温度为28℃-35℃，制曲的湿度为70％-90％，制曲的时间为24h-72h。
进一步地，步骤(2)所述盐水为NaCl溶液；所述盐水的质量百分比浓度为20％-24％；所述盐水的体积为大曲体积的2-3倍。
进一步地，步骤(2)所述负压处理是在发酵过程中第30天至180天期间内进行的。
优选地，所述负压处理的次数为5-15次；所述负压处理为每月对发酵容器顶部进行1-3次抽真空处理；每次负压处理为使发酵容器的顶部空气压力降低至400-700毫米汞柱，每次负压处理的时间为1h-6h。
优选地，步骤(2)所述杀菌灭酶的方法为热处理。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的精酿酱油。
本发明提供的精酿酱油在制备卤肉中的应用。
本发明提供的制备方法可明显抑制腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺、色胺、苯乙胺、5-羟色胺和胍基丁胺的产生,同时对酱油中的可溶性无盐固形物、总氮、氨基酸态氮等特征性指标的产生影响较小。该方法在不影响酿造酱油品质的基础上可显著降低酱油酿造过程中多种生物胺的产生。
本发明实施例具有如下优点：
(1)本发明在发酵过程中形成负压可有效降低酱油中挥发性盐基氮含量，制备出的酱油挥发性盐基氮含量低于20mg/100ml，显著低于市面上普通工艺生产的酱油产品。
(2)本发明制备出的酱油的鲜味显著提高，咸味明显降低，整体风味明显提高。
(3)本发明制备出来的酱油用于卤肉时，肉制品有较为色泽偏红，长时间卤制肉制品的色泽也会不会变暗。
(4)本发明制备出来的酱油含有呈味肽γ-Glu-Val。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例制备的酱油通过如下方法进行检测。
氨态氮含量测定：甲醛滴定法；
总氮含量测定：凯氏定氮法，GB 5009.5-2010食品安全国家标准食品中蛋白质的测定；
总酸含量测定：GB/T 12456-2008；
总糖含量测定：GBT10782-2006食品中总糖含量的测定；
挥发性盐基氮含量测定：GB5009.228-2016食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定；
酱油感官评价方法：酱油的感官评价实验由28-42岁有感官评价经验的评价人员进行。感官评价人员由12位男性和13位女性组成。感官评价人员分别对两款酱油原油的咸味强弱、鲜味强弱以及风味嗜好性进行排序。
生物胺测定方法：高效液相色谱法，参考李志军的方法(食品中生物胺及其产生菌株检测方法研究[D].青岛:中国海洋大学,2007)并稍加修改，采用C18色谱柱(4.6×250mm×5μm)，紫外检测波长254nm，柱温为30℃，进样量20μL。流动相A为甲醇，流动相B为水，梯度洗脱，流速为1.0mL/min。
呈味肽γ-Glu-Val的测定方法参考杨娟.γ-谷氨酰肽的酶法合成及其应用[D].华南理工大学，2018。
实施例1
(1)大豆经蒸煮处理后与同等重量小麦粉混合后，得到混合物，所述蒸煮处理的温度为120℃，蒸煮处理的时间为30min，冷却后接种米曲霉曲精，所述米曲霉曲精的质量为混合物质量的0.02％(w/w)，制曲，制曲的温度为28℃，制曲的湿度为90％，制曲的时间为72h，得到大曲；
(2)将大曲和盐水(NaCl溶液，浓度为20％)混合，盐水的体积为大曲体积的2.2倍，在发酵罐内采用高盐稀态酱油酿造方法(GB18186-2000)进行发酵，在发酵30天-180天期间进行在酱油发酵罐顶端进行抽真空处理(每月进行抽真空处理3次)，每次抽真空处理均使酱油发酵罐顶端空气压力降低为700毫米汞柱，每次抽真空处理的时间为6h，发酵结束后热处理杀菌灭酶、压榨、过滤，得到所述精酿酱油(酱油原液)。
对照实施例1
(1)大豆经蒸煮处理后与同等重量小麦粉混合后，得到混合物，所述蒸煮处理的温度为120℃，蒸煮处理的时间为30min，冷却后接种米曲霉曲精，所述米曲霉曲精的质量为混合物质量的0.02％(w/w)，制曲，制曲的温度为28℃，制曲的湿度为90％，制曲的时间为72h，得到大曲；
(2)将大曲和盐水(NaCl溶液，浓度为20％)混合，盐水的体积为大曲体积的2.2倍，在发酵罐内采用高盐稀态酱油酿造方法(GB18186-2000)进行发酵，发酵180天后热处理杀菌灭酶、压榨、过滤，得到酱油原液。
将实施例1和对照实施例1所得酱油原油测定氨态氮、总氮、还原糖、总酸、挥发性盐基氮、总糖、食盐、pH值和生物胺含量，测定结果见表1和表2。
表1
Figure BDA0002980102830000061
Figure BDA0002980102830000071
由表1可见，实施例1和对照实施例1在氨态氮、总氮、还原糖、总酸、总糖等指标上无显著差异，但挥发性盐基氮含量显著降低。此外，实施例1中呈味肽γ-Glu-Val的含量为0.05g/100mL，但对照实施例1中未检测出这一呈味肽。
挥发性盐基氮在碱性条件下具有挥发性，在酸性条件下几乎无挥发性。本发明实施例1通过在发酵过程中形成负压可有效降低酱油中挥发性盐基氮含量。
表2酱油原油样品中生物胺含量(μg/mL)
Figure BDA0002980102830000072
由表2可见，酪胺、组胺、腐胺是酱油原油中的主要生物胺，在对照实施例1中这三种生物胺占总胺的83.7％，在实施例1中这三种生物胺占总胺的82.8％。酱油发酵过程中经过负压处理后总胺含量从421.77μg/mL降低到155.90μg/mL，其中酪胺含量在实施例1中仅98.46μg/mL，而对照实施例1中含量为268.65μg/mL；组胺含量在实施例1中仅14.23μg/mL，而对照实施例1中含量为49.71μg/mL；腐胺含量在实施例1中仅16.42μg/mL，而对照实施例1中含量为34.65μg/mL。
将实施例1和对照实施例1所得酱油原油进行进行感官评价，结果见表3。
表3
Figure BDA0002980102830000073
Figure BDA0002980102830000081
由表3可见，25个感官评价人员中有16人认为实施例1所制备的酱油原油咸味弱，有20人认为实施例1所制备的酱油原油的鲜味更强，有17人更加喜欢实施例1所制备的酱油原油。
将洗净的750g五花肉切块焯水去浮末，加入八角5颗，桂皮2小片，香叶5片，酱油原油300ml放入锅中，煮沸后分别炖30min、1个小时和2个小时，捞出，放入白色瓷碗中，评价其色泽和风味，结果见表4。
表4
Figure BDA0002980102830000082
由表4可见，采用实施例1制备的酱油原油应用在卤肉过程中卤肉的色泽一直是红色，有光泽，色泽诱人，且同时具有肉香和酱香。但采用对照实施例1制备的酱油原油应用在卤肉过程中卤肉在炖1小时卤肉为淡褐色，无光泽，在炖2小时后卤肉为深褐色，无光泽，且有焦味。
实施例2
(1)大豆经蒸煮处理后与同等重量小麦粉混合后，得到混合物，所述蒸煮处理的温度为130℃，蒸煮处理的时间为15min，冷却后接种米曲霉曲精，所述米曲霉曲精的质量为混合物质量的0.05％(w/w)，制曲，制曲的温度为30℃，制曲的湿度为90％，制曲的时间为42h，得到大曲；
(2)将大曲和盐水(NaCl溶液，浓度为24％)混合，盐水的体积为大曲体积的2.5倍，在发酵罐内采用高盐稀态酱油酿造方法(GB18186-2000)进行发酵，在发酵30天-150天期间进行在酱油发酵罐顶端进行抽真空处理(每月进行抽真空处理1次)，每次抽真空处理均使酱油发酵罐顶端空气压力降低为500毫米汞柱，每次抽真空处理的时间为3h，发酵结束后热处理杀菌灭酶、压榨、过滤，得到所述精酿酱油(酱油原液)。
对照实施例2
(1)大豆经蒸煮处理后与同等重量小麦粉混合后，得到混合物，所述蒸煮处理的温度为130℃，蒸煮处理的时间为15min，冷却后接种米曲霉曲精，所述米曲霉曲精的质量为混合物质量的0.05％(w/w)，制曲，制曲的温度为30℃，制曲的湿度为90％，制曲的时间为42h，得到大曲；
(2)将大曲和盐水(NaCl溶液，浓度为24％)混合，盐水的体积为大曲体积的2.5倍，在发酵罐内采用高盐稀态酱油酿造方法(GB18186-2000)进行发酵，发酵150天后热处理杀菌灭酶、压榨、过滤，得到酱油原液。
将实施例2和对照实施例2所得酱油原油进行生物胺含量测定和感官评价，结果见表5和表6。
表5酱油原油样品中生物胺含量(μg/mL)
Figure BDA0002980102830000091
表6酱油原油的感官评价
实施例2 对照实施例2
咸味弱 22 3
鲜味强 24 1
嗜好性 19 6
由表5可见，酪胺、组胺和腐胺是酱油原油中的主要生物胺，在对照实施例1中这三种生物胺占总胺的76.0％，在实施例1中这三种生物胺占总胺的82.7％。酱油发酵过程中经过负压处理后总胺含量从275.93μg/mL降低到100.92μg/mL，其中酪胺含量在实施例1中仅49.72μg/mL，而对照实施例1中含量为168.76μg/mL；组胺含量在实施例1中仅15.23μg/mL，而对照实施例1中含量为33.93μg/mL；腐胺含量在实施例1中仅10.71μg/mL，而对照实施例1中含量为25.56μg/mL。
由表6可见，25个感官评价人员中有22人认为实施例2所制备的酱油原油咸味弱，有24人认为实施例2所制备的酱油原油的鲜味更强，有19人更加喜欢实施例2所制备的酱油原油。
将洗净的750g五花肉切块焯水去浮末，加入八角5颗，桂皮2小片，香叶5片，酱油原油300ml放入锅中，煮沸后分别炖30min、1个小时和2个小时，捞出，放入白色瓷碗中，评价其色泽和风味，结果见表7。
表7
Figure BDA0002980102830000101
由表7可见，采用实施例3制备的酱油原油应用在卤肉过程中卤肉的色泽一直是红色，有光泽，色泽诱人，且同时具有肉香和酱香。但采用对照实施例3制备的酱油原油应用在卤肉过程中卤肉在炖1小时卤肉为淡褐色，无光泽，在炖2小时后卤肉为深褐色，无光泽，且有焦味。
此外，实施例2所制备的酱油中含有0.03g/100ml的呈味肽γ-Glu-Val，但在对照实施例2所制备的酱油中未检测出这一组分。
实施例3
(1)大豆经蒸煮处理后与同等重量小麦粉混合后，得到混合物，所述蒸煮处理的温度为125℃，蒸煮处理的时间为20min，冷却后接种米曲霉曲精，所述米曲霉曲精的质量为混合物质量的0.1％(w/w)，制曲，制曲的温度为35℃，制曲的湿度为90％，制曲的时间为24h，得到大曲；
(2)将大曲和盐水(NaCl溶液，浓度为22％)混合，盐水的体积为大曲体积的2.4倍，在发酵罐内采用高盐稀态酱油酿造方法(GB18186-2000)进行发酵，在发酵30天-180天期间进行在酱油发酵罐顶端进行抽真空处理(每月进行抽真空处理3次)，每次抽真空处理均使酱油发酵罐顶端空气压力降低为400毫米汞柱，每次抽真空处理的时间为6h，发酵结束后热处理杀菌灭酶、压榨、过滤，得到所述精酿酱油(酱油原液)。
对照实施例3
(1)豆经蒸煮处理后与同等重量小麦粉混合后，得到混合物，所述蒸煮处理的温度为125℃，蒸煮处理的时间为20min，冷却后接种米曲霉曲精，所述米曲霉曲精的质量为混合物质量的0.1％(w/w)，制曲，制曲的温度为35℃，制曲的湿度为90％，制曲的时间为24h，得到大曲；
(2)将大曲和盐水(NaCl溶液，浓度为22％)混合，盐水的体积为大曲体积的2.4倍，在发酵罐内采用高盐稀态酱油酿造方法(GB18186-2000)进行发酵，发酵180天后热处理杀菌灭酶、压榨、过滤，得到酱油原液。
将实施例3和对照实施例3所得酱油原油进行生物胺含量测定和感官评价，结果见表8和表9。
表8酱油原油样品中生物胺含量(μg/mL)
Figure BDA0002980102830000111
表9酱油原油的感官评价
Figure BDA0002980102830000112
Figure BDA0002980102830000121
由表8可见，酪胺、组胺和腐胺是酱油原油中的主要生物胺，在对照实施例1中这三种生物胺占总胺的63.13.0％，在实施例1中这三种生物胺占总胺的69.37％。酱油发酵过程中经过负压处理后总胺含量从329.03μg/mL降低到119.85μg/mL，其中酪胺含量在实施例1中仅57.33μg/mL，而对照实施例1中含量为201.77μg/mL；组胺含量在实施例1中仅17.51μg/mL，而对照实施例1中含量为39.46μg/mL；腐胺含量在实施例1中仅13.55μg/mL，而对照实施例1中含量为31.21μg/mL。
由表10可见，25个感官评价人员中有18人认为实施例3所制备的酱油原油咸味弱，有22人认为实施例2所制备的酱油原油的鲜味更强，有18人更加喜欢实施例3所制备的酱油原油。
将洗净的750g五花肉切块焯水去浮末，加入八角5颗，桂皮2小片，香叶5片，酱油原油300ml放入锅中，煮沸后分别炖30min、1个小时和2个小时，捞出，放入白色瓷碗中，评价其色泽和风味，结果见表10。
表10
Figure BDA0002980102830000122
由表10可见，采用实施例3制备的酱油原油应用在卤肉过程中卤肉的色泽一直是红色，有光泽，色泽诱人，且同时具有肉香和酱香。但采用对照实施例3制备的酱油原油应用在卤肉过程中卤肉在炖1小时卤肉为淡褐色，无光泽，在炖2小时后卤肉为深褐色，无光泽，且有焦味。
此外，实施例3所制备的酱油中含有0.04g/100ml的呈味肽γ-Glu-Val，但在对照实施例3所制备的酱油中未检测出这一组分。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种精酿酱油的制备方法与应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将大豆或豆粕经蒸煮处理后与小麦粉混合均匀，得到混合物，冷却至常温，接种曲精，制曲，得到大曲；
(2)将步骤(1)所述大曲与盐水混合均匀，在发酵容器内采用高盐稀态酱油酿造方法进行发酵，在发酵的过程中进行负压处理，发酵结束后杀菌灭酶，压榨，过滤取滤液，得到所述精酿酱油。
2.根据权利要求1所述的精酿酱油的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述蒸煮处理的温度为120℃-130℃，蒸煮处理的时间为15min-30min。
3.根据权利要求1所述的精酿酱油的制备方法，其特征在于，当步骤(1)选用大豆时，所述大豆与小麦粉的质量比为5:1-1:1；当步骤(1)选用豆粕时，所述豆粕与小麦粉的质量比为5:1-1:1。
4.根据权利要求1所述的精酿酱油的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述曲精的质量为混合物质量的0.02wt％-0.2wt％；所述曲精为米曲霉曲精、酱油曲霉曲精中的一种以上。
5.根据权利要求1所述的精酿酱油的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述制曲的温度为28℃-35℃，制曲的湿度为70％-90％，制曲的时间为24h-72h。
6.据权利要求1所述的精酿酱油的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述盐水为NaCl溶液；所述盐水的质量百分比浓度为20％-24％；所述盐水的体积为大曲体积的2-3倍；步骤(2)所述杀菌灭酶的方法为热处理。
7.根据权利要求1所述的精酿酱油的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述负压处理是在发酵过程中第30天至180天期间内进行的。
8.根据权利要求7所述的精酿酱油的制备方法，其特征在于，所述负压处理的次数为5-15次；所述负压处理为每月对发酵容器顶部进行1-3次抽真空处理；每次负压处理为使发酵容器的顶部空气压力降低至400-700毫米汞柱，每次负压处理的时间为1h-6h。
9.一种由权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的精酿酱油，其特征在于，挥发性盐基氮含量低于20mg/100ml。
10.权利要求9所述的精酿酱油在制备卤肉中的应用。
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