CN112941116A - 一种酶法制备α-酮戊二酸钙的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种酶法制备α‑酮戊二酸钙的方法。该方法以L‑谷氨酸(III)为原料，在L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的存在下，经氧化得到酮戊二酸中间体(II)溶液，中间体(II)溶液经过纯化后与氯化钙成盐，即可得到α‑酮戊二酸钙(I)。本发明起始原料便宜易得，生产方法简单高效、易于操作，而且安全环保，不含有毒有害物质，为食品级α‑酮戊二酸钙的生产提供了生产方法和产品质量安全保证。

Description

一种酶法制备α-酮戊二酸钙的方法
技术领域
本发明涉及α-酮戊二酸盐的制备技术领域，特别涉及α-酮戊二酸钙(I)的制备方法。
背景技术
α-酮戊二酸(α-ketoglutaricacid)在自然界中是一种重要的生物分子，是Krebs循环、氮转运及分子氧化中的重要中间体，参与机体内氨基酸、糖类、蛋白质和脂肪等多种物质代谢。而α-酮戊二酸钙是α-酮戊二酸的一种重要的盐，因为溶解性适中，易于形成固体而纯化，被广泛应用于饲料、保健食品、精细化工等领域。
Figure BDA0002881637460000011
目前，α-酮戊二酸钙的生产方法基本上都是以α-酮戊二酸为原料，通过控制合适的条件与氯化钙成钙盐而得到。而α-酮戊二酸的制备方法主要分为化学合成法，微生物发酵法和酶转化法。
中国专利CN102976927A报道了α-酮戊二酸及其钙盐的化学合成法。该方法以丙烯酸甲酯和二氯乙酸甲酯为原料，在甲醇钠的存在缩合得到α-酮戊二酸二甲酯，然后在碱性条件水解成α-酮戊二酸二盐，最后与氯化钙成盐得到α-酮戊二酸钙。
Figure BDA0002881637460000021
该方法是典型的化学合成法，虽然得到的产品收率和纯度相对较高，但是所使用的原料丙烯酸甲酯和二氯乙酸甲酯都是具有潜在基因毒性的物质，而α-酮戊二酸钙大量的用途是作为保健食品或者医药中间体，对基因毒性的物质的残留限度要求非常严格，达到ppm级，这样就限制了化学法的应用。
微生物发酵法生产周期长，杂酸种类多且含量高，分离提取工艺复杂，产品收率低，成本高。
酶转化法选择性好，杂质少，产品浓度高，并且能耗低，周期短，已经逐渐成为α-酮戊二酸生产工艺的主流。如CN 103911400 A、CN 106834366 A、CN 109988786 A分别报道了以L-谷氨酸或L-谷氨酸盐为原料，经酶催化制备α-酮戊二酸的工艺；WO2020068705A1报道了以α-酮戊二酸为原料、与氯化钙反应得到α-酮戊二酸钙一水合物的工艺方法。
Figure BDA0002881637460000022
上述酶转化法都是以α-酮戊二酸为生产目标的，由于α-酮戊二酸稳定性不是很好，特别是在碱性条件下，容易分解生成丁二酸和其它杂质，往往需要较为复杂的纯化过程才能得到合格的α-酮戊二酸产品。而另一方面，α-酮戊二酸为原料制备α-酮戊二酸钙，需要精确控制原料α-酮戊二酸的pH值，再与氯化钙成盐，才能得到纯度和含量较好的α-酮戊二酸钙；WO2020068705A1中主要以碳酸钠为碱来调节pH值，有可能使产品中带有一定量的碳酸钙，而且难于去除。
发明内容
为了克服了上述现有技术中的不足之处，结合各种方法的优势，本发明提供了一种酶法制备α-酮戊二酸钙的方法。该方法以L-谷氨酸(III)为原料，在氧化酶的存在下，经空气氧化得到酮戊二酸中间体(II)溶液，中间体(II)溶液与氯化钙成盐，即可得到α-酮戊二酸钙(I)。本发明起始原料便宜易得，生产方法简单高效、易于操作，而且安全环保，不含有毒有害物质，为食品级α-酮戊二酸钙的生产提供了生产方法和产品质量安全保证。
本发明的α-酮戊二酸钙的方法，该方法包含以下几个步骤：
a)以该方法以L-谷氨酸(III)为原料，在氧化酶的存在下，经空气氧化得到酮戊二酸中间体(II)溶液；
b)酮戊二酸中间体(II)溶液与氯化钙成盐，得到α-酮戊二酸钙(I)。
Figure BDA0002881637460000031
其中，L-谷氨酸(III)包括L-谷氨酸、L-谷氨酸单钠盐、二钠盐及其水合物；
较佳地，为L-谷氨酸单钠盐一水合物。
其中，α-酮戊二酸钙(I)包括其水合物；
较佳地，为α-酮戊二酸钙一水合物。
其中，氧化酶包含L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶或者其共表达菌体。
较佳地，酶转化反应合适的温度为20～40℃。
较佳地，氧化所用的气体为空气或氧气。
较佳地，氯化钙为氯化钙的水溶液，的当量数是1.0～1.2。
较佳地，反应温度为10～30℃，反应时间是4～24小时。
本发明的有益效果具体在于：
1、采用酶转化法以L-谷氨酸(III)为原料，氧化得到酮戊二酸中间体(II)溶液。从而避免了化学法中使用丙烯酸甲酯和二氯乙酸甲酯都等潜在基因毒性的物质，适合生产食品级的酮戊二酸盐系列，保证了产品质量和安全性。
2、有机结合了酶转化法和后续的成盐反应，减少了酶转化法中复杂的后处理过程，以有成盐反应时的调节pH过程，避免使用碳酸钠从而生成碳酸的过程；使工艺操作更加流畅，产品质量更有保证。
实施例：α-酮戊二酸钙一水合物(I)的制备
Figure BDA0002881637460000041
1.1酶转化反应
向3000mL可以通入气体的反应瓶中加入600mL水和540g谷氨酸钠一水合物(1-1)，测得pH 7.0，控制温度35℃，再加入18g的L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶共表达菌体，用定容到1800mL。底部通入纯氧气，搅拌反应22小时，补加水使反应体系为1800mL，取样，HPLC测得α-酮戊二酸为231.4g/L，丁二酸为0.22g/L，α-酮戊二酸转化率为99.8％。
改变不同的反应条件，反应22小时，得到反应的数据如下表所示：
Figure BDA0002881637460000042
1.2成盐反应
取上步溶液350克加入硅藻土搅拌半小时，抽滤除去酶渣，得溶液329g，标定α-酮戊二酸的含量7.51％，计算约含有α-酮戊二酸24.7g。将溶液在50℃以下浓缩，约蒸出100mL水，然后将18.8g氯化钙溶于90mL水中配成的溶液慢慢滴加到α-酮戊二酸体系中，室温搅拌半小时，有白色固体析出，继续搅拌反应15小时。将溶液升温到50℃搅拌1小时，然后趁热过滤，20mL纯水淋洗，所得的固体30.3g继续加入300mL纯水中，加热到60℃左右搅拌1小时，降温到50℃后，趁热过滤，纯水淋洗，50℃下烘干，得α-酮戊二酸钙一水合物23.7g，含量99.16％，纯度99.38％，总收率83.7％。
改变不同的反应条件，得到的数据如下表所示：
Figure BDA0002881637460000051
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (7)

1.一种α-酮戊二酸钙的方法，该方法包含以下几个步骤：
以L-谷氨酸(III)为原料，在氧化酶的存在下，经氧化得到酮戊二酸中间体(II)溶液；
酮戊二酸中间体(II)溶液与氯化钙成盐，得到α-酮戊二酸钙(I)
Figure 192333DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的L-谷氨酸(III)包括L-谷氨酸、L-谷氨酸单钠盐、二钠盐及其水合物；特别是L-谷氨酸单钠盐一水合物。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的α-酮戊二酸钙(I)包括其水合物，特别是一水合物。
4.根据权利要求1a所述的制备方法，其特征在于，所述的氧化酶包含L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶或者其共表达菌体。
5.根据权利要求1a所述的制备方法，其特征在于，氧化所用的气体为空气或氧气，酶转化反应合适的温度为20~40oC。
6.根据权利要求1b所述的制备方法，其特征在于，所述的氯化钙包括氯化钙的水溶液，的当量数是1.0~1.2。
7.根据权利要求1b所述的制备方法，其特征在于，反应合适的温度为10~30oC，合适的反应时间是4~24小时。
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