CN112798713A - 一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定和含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定和含量测定方法。一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定方法，采用薄层色谱法鉴别没食子药渣和阿尔泰金莲花，本发明还公开了一种中药复方抑菌凝胶剂的含量测定方法。本发明所述的一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定和含量测定方法，包括HPTLC鉴别和HPLC含量测定，采用HPLC波长切换法测定中药复方抑菌凝胶剂中没食子酸、没食子酸甲酯、荭草素‑2″‑O‑β‑L半乳糖苷和荭草苷的含量；该方法具有简便可行、准确快捷、稳定性好的优势。

Description

一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定和含量测定方法
技术领域
本发明属于中药药物质量检测的技术领域，具体涉及一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定及含量测定方法。
背景技术
中药复方抑菌凝胶剂由阿尔泰金莲花提取物、没食子药渣提取物、卡波姆、丙三醇、薄荷脑、乙醇、三乙醇胺、蒸馏水组成。由于药材来源、质量不稳定等因素，目前该中药凝胶剂没有明确的质量控制方法，难以在生产中达到真正控制质量的目的。因此，如何有效的控制该中药复方抑菌凝胶剂的质量是一个亟待解决的问题。
其中，没食子药渣提取物来源于国家中药保护品种、国家专利产品及新疆维吾尔自治区高新技术产品“西帕依固龈液”提取后的药物残渣，研究表明，没食子经提取后，剩余的药渣经乙醇提取仍含有多酚类成分。阿尔泰金莲花(Trollius altaicus)为毛茛科、金莲花属多年生草本植物，具有清热解毒、抗菌消炎等功效。研究表明，金莲花属植物的主要化学成分为荭草苷、牡荆苷及以其衍生物为主的黄酮类化合物，该类物质也是金莲花属植物发挥药效的物质基础。
变异链球菌是一种主要的致龋菌，没食子药渣提取物与阿尔泰金莲花提取物均可有效抑制变异链球菌生长，具体机制为通过抑制乳酸脱氢酶的活性，从而抑制变异链球菌产酸及其生长。
目前，该中药复方抑菌凝胶剂还没有明确的鉴定方法和含量测定方法，这为该种制剂的生产与使用带来了诸多不便。有鉴于此，为了能够更好地控制与评价该中药复方抑菌凝胶剂的质量，本发明提出一种可以同时鉴别和测定该种制剂种四种成分含量的测定方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定方法，可有效鉴定中药复方抑菌凝胶剂中的有效成分。
为了实现上述目的，所采用的技术方案为：
一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定方法，用薄层色谱法鉴别没食子药渣和阿尔泰金莲花；
其中，使用高效硅胶G板对没食子药渣进行鉴别，聚酰胺薄膜板对阿尔泰金莲花进行鉴定。
进一步地，所述的没食子药渣的鉴别包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：
向中药复方抑菌凝胶剂中加入10％的NaCl溶液混匀后，加入甲醇并混匀，过滤，得滤液；将所述的滤液蒸干后加入甲醇复溶，用0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液；
所述的中药复方抑菌凝胶剂与NaCl溶液、甲醇、复溶后的溶液的质量体积比为1g:0.9-1.1ml:0.9-1.1ml:0.25ml；
(2)制备阴性对照品溶液：
以不含没食子药渣提取物的阴性对照凝胶剂作为阴性对照品，采用步骤(1)的方法，制备阴性对照品溶液；
(3)制备对照药材溶液：
向没食子药渣中加入甲醇，混匀后，用0.22μm微孔滤膜过滤，得对照药材溶液；所述的没食子药渣与甲醇的质量体积比为0.10-0.11g：25mL；
(4)制备对照品溶液：
向没食子酸中加入甲醇，混匀后，得0.220-0.228mg/mL的对照品溶液a；
向没食子酸甲酯加入甲醇，混匀后，得0.215-0.223mg/mL的对照品溶液b；
(5)鉴别：
吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液和对照品溶液a、b各3μL，分别点样于同一硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，喷显色剂，加热至斑点清晰后，在白光下检识；
所述的阿尔泰金莲花的鉴别包括以下步骤：
1)制备供试品溶液：
采用步骤(1)的方法，制备供试品溶液：
2)制备阴性对照品溶液：
以不含阿尔泰金莲花提取物的阴性对照凝胶剂作为阴性对照品，采用步骤1)的方法，制备阴性对照品溶液；
3)制备对照药材溶液：
向阿尔泰金莲花中加入甲醇，混匀后，用0.22μm微孔滤膜过滤，得对照药材溶液；所述的阿尔泰金莲花与甲醇的质量体积比为0.10-0.105g：25mL；
4)制备对照品溶液：
向荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷中加入甲醇，混匀后，得0.160-0.168mg/mL的对照品溶液c；
向荭草苷加入甲醇，混匀后，得0.04-0.06mg/mL的对照品溶液d；
5)鉴别：
吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液和对照品溶液c、d各3μL，分别点样于同一聚酰胺薄膜板上，展开，取出，晾干，喷显色剂，加热至斑点清晰后，在紫外灯下检识。
再进一步地，所述的步骤(1)中，中药复方抑菌凝胶剂与NaCl溶液、甲醇、复溶后的溶液的质量体积比为1g：1ml：1ml：0.25ml；
所述的步骤(3)中，所述的没食子药渣与甲醇的质量体积比为0.105g：25mL；
所述的步骤(4)中，对照品溶液a的浓度为0.224mg/mL，对照品溶液b的浓度为0.219mg/mL；
所述的步骤(5)中，所述的展开剂为二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸，显色剂为2％FeCl3，加热温度为105℃；
所述的步骤3)中，阿尔泰金莲花与甲醇的质量体积比为0.101g：25mL；
所述的步骤4)中，对照品溶液c的浓度为0.164mg/mL，对照品溶液d的浓度为0.05mg/mL；
所述的步骤5)中，所述的展开剂为二氯甲烷-丁酮-甲醇-甲酸，显色剂为2％AlCl3，加热温度为105℃。
再进一步地，所述的步骤(1)中，向中药复方抑菌凝胶剂中依次加入10％的NaCl溶液、甲醇后，超声20min；
所述的步骤(5)中，二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸的体积比为5:2:1；
所述的步骤5)中，二氯甲烷-丁酮-甲醇-甲酸的体积比为6:0.5:2:0.6。
再进一步地，所述步骤5)中，所述紫外灯紫外线波长为366nm。
本发明的另一个目的在于提供一种中药复方抑菌凝胶剂的含量测定方法，操作简便，精密度、重现性、稳定性及加样回收率均良好。
为了实现上述目的，所采用的技术方案为：
一种中药复方抑菌凝胶剂的含量测定方法，所述的含量测定方法采用HPLC波长切换法测定中药复方抑菌凝胶剂中没食子酸、没食子酸甲酯、荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷和荭草苷的含量。
进一步地，所述的含量测定方法包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：
向中药复方抑菌凝胶剂中加入10％的NaCl溶液混匀后，加入甲醇并混匀，过滤，得滤液；将所述的滤液蒸干后，得到固体物质；向所述的固体物质中加入甲醇复溶，用0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液；
所述的中药复方抑菌凝胶剂与NaCl溶液、甲醇、复溶后的溶液的质量体积比为1g:0.9-1.1ml:0.9-1.1ml:0.25ml；
(2)制备对照品溶液：
向没食子酸中加入甲醇，混匀后，得2.132mg/mL的对照品溶液A；
向没食子酸甲酯加入甲醇，混匀后，得1.097mg/mL的对照品溶液B；
向荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷加入甲醇，混匀后，得1.644mg/mL的对照品溶液C；
向荭草苷加入甲醇，混匀后，得0.522mg/mL的对照品溶液D；
将对照品溶液A、B、C、D混合后，用0.22μm微孔滤膜过滤，再用甲醇定容，得混合对照品溶液；
所述的对照品溶液A、B、C、D和混合对照品溶液的体积比为1.2:1:1：1:5；
(3)含量测定：
分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，色谱柱为Wondasil C18 Herb column，记录20分钟内的色谱图；其中，所述所述流动相A为磷酸溶液，流动相B为乙腈。
再进一步地，所述的步骤(1)中，中药复方抑菌凝胶剂与NaCl溶液、甲醇、复溶后的溶液的质量体积比为1g:1ml:1ml:0.25ml；
所述的步骤(3)中，磷酸溶液的质量分数为0.1％。所述的步骤(3)中，流速1.0ml·min-1，柱温为35℃，进样量12μL。
再进一步地，所述的步骤(3)中，流动相B的体积分数变化为：0-12min,16％→19％；12-12.5min，19％→18％；12.5-20min，18％。
再进一步地，所述的步骤(3)中，0-10.5min时，检测波长为273nm；10.5-20min时，检测波长为350nm。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明所述的中药复方抑菌凝胶剂的鉴定方法和含量测定方法，分别采用高效薄层色谱(HPTLC)对其进行定性鉴别，高效液相色谱(HPLC)对其进行含量测定。进行高效薄层色谱鉴定时，践行绿色分析理念，避免使用三氯甲烷等毒性较大的试剂，而是选择使用毒性较低的，极性相似的二氯甲烷代替。
在鉴定阿尔泰金莲花的过程中采用聚酰胺薄层色谱的原因为：与硅胶G板相比，聚酰胺薄层色谱更适用于分析黄酮类成分，其原理是黄酮类成分含有酚羟基，而聚酰胺分子中含有酰胺基，彼此可形成氢键。并且聚酰胺薄层色谱具有点量少、分离效率高等优点，所以选用聚酰胺薄膜板对阿尔泰金莲花中的两种成分进行分离鉴定。
2、色谱条件的优化：采用DAD检测器在190-400nm进行全波长扫描，结果显示没食子酸和没食子酸甲酯在273nm处有最大吸收，荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷和荭草苷在350nm处有最大吸收，故最终确定采用273nm(0-10.5min)、350nm(10.5-20min)2种波长作为4种成分含量测定的采集波长，色谱图基线平稳、有效成分色谱峰信号较强，分离效果好。
3、本发明所述的一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定和含量测定方法，供试品的处理方法、色谱条件、检测步骤等，都是经过长期复杂的实验得到的，通过上述众多因素的协同后，使得待测组分之间的分离度和保留时间均在合理范围内。
4、本发明所述的一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定和含量测定方法，用于评价中药复方抑菌凝胶剂的质量，具有操作简便，精密度、重现性、稳定性及加样回收率均良好的优点，符合含量测定的技术要求，为中药复方抑菌凝胶剂的质量评价提供了科学依据。
附图说明
图1为实施例1中没食子药渣的高效薄层色谱图(图中，1为没食子酸，2为没食子酸甲酯，3为没食子药渣提取物，4为中药复方抑菌凝胶剂，5为阴性对照)；
图2阿尔泰金莲花的高效薄层色谱图(图中，1为荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷，2为荭草苷，3为阿尔泰金莲花提取物，4为中药复方抑菌凝胶剂，5为阴性对照)；
图3混合对照品的液相色谱图(1为没食子酸，2为没食子酸甲酯，3为荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷，4为荭草苷)；
图4本发明中药复方抑菌凝胶剂的液相色谱图(1为没食子酸，2为没食子酸甲酯，3为荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷，4为荭草苷)。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定和含量测定方法，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定和含量测定方法，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。
下面将结合具体的实施例，对本发明一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定和含量测定方法做进一步的详细介绍：
本发明的技术方案为：
一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定方法，用薄层色谱法鉴别没食子药渣和阿尔泰金莲花；
其中，使用高效硅胶G板对没食子药渣进行鉴别，聚酰胺薄膜板对阿尔泰金莲花进行鉴定。
优选的，所述的没食子药渣的鉴别包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：
向中药复方抑菌凝胶剂中加入10％的NaCl溶液混匀后，加入甲醇并混匀，过滤，得滤液；将所述的滤液蒸干后，得到固体物质；向所述的固体物质中加入甲醇复溶，用0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液；
所述的中药复方抑菌凝胶剂与NaCl溶液、甲醇、复溶后的溶液的质量体积比为1g：0.9-1.1ml：0.9-1.1ml：0.25ml。
由于凝胶基质卡波姆的粘度较大，难以过滤，所以选择先加入高浓度电解质溶液(10％氯化钠溶液)破坏卡波姆的大分子结构，再加入甲醇对凝胶剂进行提取，以保证各成分的充分溶出。
(2)制备阴性对照品溶液：
以不含没食子药渣提取物的阴性对照凝胶剂作为阴性对照品，采用步骤(1)的方法，制备阴性对照品溶液。
(3)制备对照药材溶液：
向没食子药渣中加入甲醇，混匀后，用0.22μm微孔滤膜过滤，得对照药材溶液；所述的没食子药渣与甲醇的质量体积比为0.10-0.11g：25mL。
(4)制备对照品溶液：
向没食子酸中加入甲醇，混匀后，得0.220-0.228mg/mL的对照品溶液a；
向没食子酸甲酯加入甲醇，混匀后，得0.215-0.223mg/mL的对照品溶液b。
(5)鉴别：
吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液和对照品溶液a、b各3μL，分别点样于同一硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，喷显色剂，加热至斑点清晰后，在白光下检识。
所述的阿尔泰金莲花的鉴别包括以下步骤：
1)制备供试品溶液：
采用步骤(1)的方法，制备供试品溶液。
2)制备阴性对照品溶液：
以不含阿尔泰金莲花提取物的阴性对照凝胶剂作为阴性对照品，采用步骤1)的方法，制备阴性对照品溶液。
3)制备对照药材溶液：
向阿尔泰金莲花中加入甲醇，混匀后，用0.22μm微孔滤膜过滤，得对照药材溶液；所述的阿尔泰金莲花与甲醇的质量体积比为0.10-0.105g：25mL。
4)制备对照品溶液：
向荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷中加入甲醇，混匀后，得0.160-0.168mg/mL的对照品溶液c；
向荭草苷加入甲醇，混匀后，得0.04-0.06mg/mL的对照品溶液d。
5)鉴别：
吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液和对照品溶液c、d各3μL，分别点样于同一聚酰胺薄膜板上，展开，取出，晾干，喷显色剂，加热至斑点清晰后，在紫外灯下检识。
优选的，所述的步骤(1)中，中药复方抑菌凝胶剂与NaCl溶液、甲醇、复溶后的溶液的质量体积比为1g：1ml：1ml：0.25ml；
所述的步骤(3)中，所述的没食子药渣与甲醇的质量体积比为0.105g：25mL；
所述的步骤(4)中，对照品溶液a的浓度为0.224mg/mL，对照品溶液b的浓度为0.219mg/mL；
所述的步骤(5)中，所述的展开剂为二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸，显色剂为2％FeCl3，加热温度为105℃；
所述的步骤3)中，阿尔泰金莲花与甲醇的质量体积比为0.101g：25mL；
所述的步骤4)中，对照品溶液c的浓度为0.164mg/mL，对照品溶液d的浓度为0.05mg/mL；
所述的步骤5)中，所述的展开剂为二氯甲烷-丁酮-甲醇-甲酸，显色剂为2％AlCl3，加热温度为105℃。
进一步优选的，所述的步骤(1)中，向中药复方抑菌凝胶剂中依次加入10％的NaCl溶液、甲醇后，超声20min；
所述的步骤(5)中，二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸的体积比为5：2：1；
所述的步骤5)中，二氯甲烷-丁酮-甲醇-甲酸的体积比为6：0.5：2：0.6。
进一步优选的，所述步骤5)中，所述紫外灯紫外线波长为366nm。
一种中药复方抑菌凝胶剂的含量测定方法，采用HPLC波长切换法测定中药复方抑菌凝胶剂中没食子酸、没食子酸甲酯、荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷和荭草苷的含量。
优选的，所述的含量测定方法包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：
向中药复方抑菌凝胶剂中加入10％的NaCl溶液混匀后，加入甲醇并混匀，过滤，得滤液；将所述的滤液蒸干后，得到固体物质；向所述的固体物质中加入甲醇复溶，用0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液；
所述的中药复方抑菌凝胶剂与NaCl溶液、甲醇、复溶后的溶液的质量体积比为1g：0.9-1.1ml：0.9-1.1ml：0.25ml。
(2)制备对照品溶液：
向没食子酸中加入甲醇，混匀后，得2.132mg/mL的对照品溶液A；
向没食子酸甲酯加入甲醇，混匀后，得1.097mg/mL的对照品溶液B；
向荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷加入甲醇，混匀后，得1.644mg/mL的对照品溶液C；
向荭草苷加入甲醇，混匀后，得0.522mg/mL的对照品溶液D；
将对照品溶液A、B、C、D混合后，用0.22μm微孔滤膜过滤，再用甲醇定容，得混合对照品溶液；
所述的对照品溶液A、B、C、D和混合对照品溶液的体积比为1.2：1：1：1：5。
(3)含量测定：
分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，色谱柱为Wondasil C18 Herb column，记录20分钟内的色谱图；其中，所述所述流动相A为磷酸溶液，流动相B为乙腈。
优选的，所述的步骤(1)中，中药复方抑菌凝胶剂与NaCl溶液、甲醇、复溶后的溶液的质量体积比为1g：1ml：1ml：0.25ml；
所述的步骤(3)中，磷酸溶液的质量分数为0.1％，所述的步骤(3)中，流速1.0ml·min-1，柱温为35℃，进样量12μL。
优选的，所述的步骤(3)中，流动相B的体积分数变化为：0-12min,16％→19％；12-12.5min，19％→18％；12.5-20min，18％。
优选的，所述的步骤(3)中，0-10.5min时，检测波长为273nm；10.5-20min时，检测波长为350nm。
实施例1.
(一)仪器、试药
(1)仪器
瑞士卡玛公司CamagLinomat 5半自动点样仪、REPROSTAR3薄层色谱照相仪、美国安捷伦RRLC1200高效液相色谱仪、配置二元梯度泵、在线脱气机、DAD检测器、上海梅特勒电子天平ME204E、数控超声波清洗仪(昆山KQ-5200DE)薄层色谱展开缸、安徽良辰高效硅胶薄层G板、聚酰胺薄膜、色谱柱Wondasil C18 Herb column(250×4.6mm,5μm)
(2)试药
所用试剂均为分析纯，没食子酸(批号：110831-201605，纯度≥90.8％，中国食品药品检定研究所)，没食子酸甲酯(批号：92366A，纯度≥98.0％，瑞士阿达姆斯试剂有限公司)，荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷(批号：PRF9121943，纯度≥98％，成都普瑞法科技开发有限公司)，荭草苷(批号：PRF9070641，纯度≥98％，成都普瑞法科技开发有限公司)。
(二)方法与结果
Ⅰ高效薄层色谱法鉴别
A没食子药渣的鉴别：
(1)制备供试品溶液：
取中药复方抑菌凝胶剂20.0g，置于烧杯中，加入20mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入20mL甲醇，搅拌后，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
(2)制备阴性对照品溶液：
以不含没食子药渣提取物的阴性对照凝胶剂作为阴性对照品，取阴性对照品20.0g，加入20mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入20mL甲醇搅拌后，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后用0.22μm微孔滤膜过滤，作为不含没食子药渣提取物的阴性对照品溶液。
(3)制备对照药材溶液：
取没食子药渣0.105g，用甲醇超声溶解后定容至25mL，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为对照药材溶液。
(4)制备对照品溶液：
向没食子酸中加入甲醇，混匀后，得0.224mg/mL的对照品溶液a；
向没食子酸甲酯加入甲醇，混匀后，得0.219mg/mL的对照品溶液b。
(5)鉴别：
色谱条件：采用CamagLinomat 5半自动点样仪点样，条带点样，点样量为3μL，条带宽为6mm，点样距底8mm，左右边距50mm，样品溶剂为甲醇，载气气体为氮气，速率为150nL/s。
测定：吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液和对照品溶液a、b各3μL，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(体积比为5：2：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷2％FeCl3显色剂，105℃加热至斑点清晰，白光检识，供试品色谱中与对照药材和对照品在薄层板相应位置上，显相同形状和颜色的斑点。
B阿尔泰金莲花的鉴别：
1)制备供试品溶液：
取中药复方抑菌凝胶剂20.0g，置于烧杯中，加入20mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入20mL甲醇，搅拌后，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
2)制备阴性对照品溶液：
以不含阿尔泰金莲花提取物的阴性对照凝胶剂作为阴性对照品，取阴性对照品20.0g，加入20mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入20mL甲醇搅拌后，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后用0.22μm微孔滤膜过滤，作为不含没食子药渣提取物的阴性对照品溶液。
3)制备对照药材溶液：
取阿尔泰金莲花0.101g，用甲醇超声溶解后定容至25mL，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为对照药材溶液。
4)制备对照品溶液：
取荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷对照品适量，加甲醇制成0.164mg/mL的溶液，作为对照品溶液c；
取荭草苷对照品适量，加甲醇制成0.05mg/mL的溶液，作为对照品溶液d。
5)鉴别：
色谱条件：采用CamagLinomat 5半自动点样仪点样，条带点样，点样量为3μL，条带宽为6mm，点样距底8mm，左右边距50mm，样品溶剂为甲醇，载气气体为氮气，速率为150nL/s。
测定：吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液和对照品溶液c、d各3μL，分别点样于同一聚酰胺薄膜板上，以二氯甲烷—丁酮—甲醇—甲酸(体积比为6：0.5：2：0.6)为展开剂，展开取出，晾干，喷2％AlCl3显色剂，105℃加热至斑点清晰，波长为366nm的紫外灯下检识，供试品色谱中与对照药材和对照品在薄层板相应位置上，显相同形状和颜色的斑点。
结果见图1、2。图1为没食子药渣的鉴别(图中，1为没食子酸，2为没食子酸甲酯，3为没食子药渣提取物，4为中药复方抑菌凝胶剂，5为阴性对照)，图2阿尔泰金莲花的鉴别(图中，1为荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷，2为荭草苷，3为阿尔泰金莲花提取物，4为中药复方抑菌凝胶剂，5为阴性对照)。由图1和图2可知，供试品色谱图中各点与混合对照品的点一一对应。
Ⅱ高效液相含量测定
a具体方法为：
(1)制备供试品溶液：
取中药复方抑菌凝胶剂20.0g，置于烧杯中，加入20mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入20mL甲醇，搅拌后，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
(2)制备对照品溶液：
取没食子酸对照品适量，加甲醇，制成2.132mg/mL的溶液，作为对照品溶液A；
取没食子酸甲酯对照品适量，加甲醇，制成1.097mg/mL的溶液，作为对照品溶液B；
取荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷对照品适量，加甲醇，制成1.644mg/mL的溶液，作为对照品溶液C；
取荭草苷对照品适量，加甲醇，制成0.522mg/mL的溶液，作为对照品溶液D；
用移液管分别吸取对照品A、B、C、D溶液1.2mL、1mL、1mL、1mL至5mL容量瓶中后，用甲醇定容，定容至5mL，作为混合对照品溶液；
(3)含量测定：
色谱条件：色谱柱为Wondasil C18 Herb column(250×4.6mm,5μm)，0.1％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱(0-12min,16％B→19％B；12-12.5min，19％B→18％B；12.5-20min,18％B),流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为273nm(0-10.5min)和350nm(10.5-20min)，理论塔板数均不小于8000。进样量12μL。
将供试品溶液与混合对照品溶液分别过0.22μm的微孔滤膜，分别装入液相小瓶，设置色谱程序，建立一种波长切换法，记录20分钟内的色谱图。测定后，记录峰面积后计算即得。
图3为混合对照品的液相色谱图(1为没食子酸，2为没食子酸甲酯，3为荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷，4为荭草苷)，图4为本发明中药复方抑菌凝胶剂的液相色谱图(1为没食子酸，2为没食子酸甲酯，3为荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷，4为荭草苷)。
由图3-4可知，混合对照品溶液的HPLC谱图和中药复方抑菌凝胶剂的HPLC谱图中均出现没食子酸、没食子酸甲酯、荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷和荭草苷的峰，且峰独立，其分离度好，峰形对称，峰面积满足测定的基本要求。
b含量测定方法的线性关系、精密度等方面的考察
(1)线性关系考察
吸取混合标准品溶液，按照色谱条件进行自动进样，以进样量X(μg)为横坐标，对应的峰面积Y(mAU)为纵坐标绘制相应的标准曲线，计算回归方程及R2，结果见表1。
表1线性关系考察表
(Table 1 Results of linear relation)
Figure BDA0002919746300000141
(2)精密度实验
取同一混合对照品溶液，按照上述的色谱条件连续进样6次，分别计算没食子酸、没食子酸甲酯、荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷与荭草苷峰面积的RSD值，计算出其RSD值分别为1.79％、0.67％、0.66％、0.66％，表示仪器精密度良好。
(3)稳定性实验
取一批中药凝胶剂，按照供试品溶液制备方法处理后，分别于处理后的0、2、4、6、8、10、12h分别进样测定，得出样品中没食子酸、没食子酸甲酯、荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷与荭草苷峰面积的RSD值为0.36％、0.88％、0.69％、1.89％，表示供试品溶液在12h内稳定性良好。
(4)重复性实验
取一批中药凝胶剂，均匀取6份样，按照供试品溶液制备方法处理后得到6份供试品溶液，按照上述的色谱条件分别进样，记录峰面积后代入对应标曲计算供试品中没食子酸、没食子酸甲酯、荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷和荭草素的平均含量分别为0.103、0.019、0.042、0.018mg·g-1，RSD分别为1.55％、1.61％、0.49％、1.74％，表明该法重复性良好。
(5)加样回收率实验
取已知含量的中药凝胶剂9份，精密称定，分别精密加入相当于凝胶中4个待测成分含有量的80％、100％、120％倍的对照品溶液各9份，按上述方法制备供试品溶液，进样测定，计算各成分的加样回收率及RSD，结果见表2。
表2回收率实验结果
Table 2 Results of recovery experiment
Figure BDA0002919746300000151
Figure BDA0002919746300000161
结果如表2，没食子酸、没食子酸甲酯、荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷和荭草苷的平均回收率97.46％-99.92％之间，RSD值在1.47％-2.87％之间，表明该法准确度良好。
(6)样品含量测定
用上述方法测定三批中药凝胶剂(S1、S2、S3)中各物质的含量，测定结果见表3。
表3三批样品含量测定
Figure BDA0002919746300000162
结果如表3所示，三批中药凝胶剂中的没食子酸、没食子酸甲酯、荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷与荭草苷含量稳定。
由上述测试可知，本发明的质量控制方法，具有较强的专属性和良好的重现性，真正体现药品安全。
实施例2.
Ⅰ高效薄层色谱法鉴别
A没食子药渣的鉴别：
(1)制备供试品溶液：
取中药复方抑菌凝胶剂20.0g，置于烧杯中，加入18mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入22mL甲醇，搅拌后，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
(2)制备阴性对照品溶液：
以不含没食子药渣提取物的阴性对照凝胶剂作为阴性对照品，取阴性对照品20.0g，加入18mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入22mL甲醇搅拌后，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后用0.22μm微孔滤膜过滤，作为不含没食子药渣提取物的阴性对照品溶液。
(3)制备对照药材溶液：
取没食子药渣0.10g，用甲醇超声溶解后定容至25mL，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为对照药材溶液。
(4)制备对照品溶液：
向没食子酸中加入甲醇，混匀后，得0.220mg/mL的对照品溶液a；
向没食子酸甲酯加入甲醇，混匀后，得0.215mg/mL的对照品溶液b。
(5)鉴别：
色谱条件：采用CamagLinomat 5半自动点样仪点样，条带点样，点样量为3μL，条带宽为6mm，点样距底8mm，左右边距50mm，样品溶剂为甲醇，载气气体为氮气，速率为150nL/s。
测定：吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液和对照品溶液a、b各3μL，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(体积比为5：2：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷2％FeCl3显色剂，105℃加热至斑点清晰，白光检识，供试品色谱中与对照药材和对照品在薄层板相应位置上，显相同形状和颜色的斑点，供试品色谱图中各点与混合对照品的点一一对应。
B阿尔泰金莲花的鉴别：
1)制备供试品溶液：
取中药复方抑菌凝胶剂20.0g，置于烧杯中，加入18mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入22mL甲醇，搅拌后，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
2)制备阴性对照品溶液：
以不含阿尔泰金莲花提取物的阴性对照凝胶剂作为阴性对照品，取阴性对照品20.0g，加入18mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入22mL甲醇，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后用0.22μm微孔滤膜过滤，作为不含没食子药渣提取物的阴性对照品溶液。
3)制备对照药材溶液：
取阿尔泰金莲花0.10g，用甲醇超声溶解后定容至25mL，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为对照药材溶液。
4)制备对照品溶液：
取荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷对照品适量，加甲醇制成0.16mg/mL的溶液，作为对照品溶液c；
取荭草苷对照品适量，加甲醇制成0.04mg/mL的溶液，作为对照品溶液d。
5)鉴别：
色谱条件：采用CamagLinomat 5半自动点样仪点样，条带点样，点样量为3μL，条带宽为6mm，点样距底8mm，左右边距50mm，样品溶剂为甲醇，载气气体为氮气，速率为150nL/s。
测定：吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液和对照品溶液c、d各3μL，分别点样于同一聚酰胺薄膜板上，以二氯甲烷—丁酮—甲醇—甲酸(体积比为6：0.5：2：0.6)为展开剂，展开取出，晾干，喷2％AlCl3显色剂，105℃加热至斑点清晰，波长为366nm的紫外灯下检识，供试品色谱中与对照药材和对照品在薄层板相应位置上，显相同形状和颜色的斑点，供试品色谱图中各点与混合对照品的点一一对应。
Ⅱ高效液相含量测定
a具体方法为：
(1)制备供试品溶液：
取中药复方抑菌凝胶剂20.0g，置于烧杯中，加入18mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入22mL甲醇，搅拌后，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
(2)制备对照品溶液：
取没食子酸对照品适量，加甲醇，制成2.132mg/mL的溶液，作为对照品溶液A；
取没食子酸甲酯对照品适量，加甲醇，制成1.097mg/mL的溶液，作为对照品溶液B；
取荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷对照品适量，加甲醇，制成1.644mg/mL的溶液，作为对照品溶液C；
取荭草苷对照品适量，加甲醇，制成0.522mg/mL的溶液，作为对照品溶液D；
用移液管分别吸取对照品A、B、C、D溶液1.2mL、1mL、1mL、1mL至5mL容量瓶中后，用甲醇定容，定容至5mL，作为混合对照品溶液；
(3)含量测定：
色谱条件：色谱柱为Wondasil C18 Herb column(250×4.6mm,5μm)，0.1％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱(0-12min,16％B→19％B；12-12.5min，19％B→18％B；12.5-20min,18％B),流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为273nm(0-10.5min)和350nm(10.5-20min)，理论塔板数均不小于8000。进样量12μL。
将供试品溶液与混合对照品溶液分别过0.22μm的微孔滤膜，分别装入液相小瓶，设置色谱程序，建立一种波长切换法，记录20分钟内的色谱图。测定后，记录峰面积后计算即得。
混合对照品溶液的HPLC谱图和中药复方抑菌凝胶剂的HPLC谱图中均出现没食子酸、没食子酸甲酯、荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷和荭草苷的峰，且峰独立，其分离度好，峰形对称，峰面积满足测定的基本要求。
实施例3.
Ⅰ高效薄层色谱法鉴别
A没食子药渣的鉴别：
(1)制备供试品溶液：
取中药复方抑菌凝胶剂20.0g，置于烧杯中，加入22mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入18mL甲醇，搅拌后，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
(2)制备阴性对照品溶液：
以不含没食子药渣提取物的阴性对照凝胶剂作为阴性对照品，取阴性对照品20.0g，加入22mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入18mL甲醇搅拌后，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后用0.22μm微孔滤膜过滤，作为不含没食子药渣提取物的阴性对照品溶液。
(3)制备对照药材溶液：
取没食子药渣0.11g，用甲醇超声溶解后定容至25mL，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为对照药材溶液。
(4)制备对照品溶液：
向没食子酸中加入甲醇，混匀后，得0.228mg/mL的对照品溶液a；
向没食子酸甲酯加入甲醇，混匀后，得0.223mg/mL的对照品溶液b。
(5)鉴别：
色谱条件：采用CamagLinomat 5半自动点样仪点样，条带点样，点样量为3μL，条带宽为6mm，点样距底8mm，左右边距50mm，样品溶剂为甲醇，载气气体为氮气，速率为150nL/s。
测定：吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液和对照品溶液a、b各3μL，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(体积比为5：2：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷2％FeCl3显色剂，105℃加热至斑点清晰，白光检识，供试品色谱中与对照药材和对照品在薄层板相应位置上，显相同形状和颜色的斑点，供试品色谱图中各点与混合对照品的点一一对应。
B阿尔泰金莲花的鉴别：
1)制备供试品溶液：
取中药复方抑菌凝胶剂20.0g，置于烧杯中，加入22mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入18mL甲醇，搅拌后，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
2)制备阴性对照品溶液：
以不含阿尔泰金莲花提取物的阴性对照凝胶剂作为阴性对照品，取阴性对照品20.0g，加入22mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入18mL甲醇，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后用0.22μm微孔滤膜过滤，作为不含没食子药渣提取物的阴性对照品溶液。
3)制备对照药材溶液：
取阿尔泰金莲花0.105g，用甲醇超声溶解后定容至25mL，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为对照药材溶液。
4)制备对照品溶液：
取荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷对照品适量，加甲醇制成0.168mg/mL的溶液，作为对照品溶液c；
取荭草苷对照品适量，加甲醇制成0.06mg/mL的溶液，作为对照品溶液d。
5)鉴别：
色谱条件：采用CamagLinomat 5半自动点样仪点样，条带点样，点样量为3μL，条带宽为6mm，点样距底8mm，左右边距50mm，样品溶剂为甲醇，载气气体为氮气，速率为150nL/s。
测定：吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液和对照品溶液c、d各3μL，分别点样于同一聚酰胺薄膜板上，以二氯甲烷—丁酮—甲醇—甲酸(体积比为6：0.5：2：0.6)为展开剂，展开取出，晾干，喷2％AlCl3显色剂，105℃加热至斑点清晰，波长为366nm的紫外灯下检识，供试品色谱中与对照药材和对照品在薄层板相应位置上，显相同形状和颜色的斑点，供试品色谱图中各点与混合对照品的点一一对应。
Ⅱ高效液相含量测定
a具体方法为：
(1)制备供试品溶液：
取中药复方抑菌凝胶剂20.0g，置于烧杯中，加入22mL10％的NaCl溶液搅拌均匀后，加入18mL甲醇，搅拌后，超声20min，过滤，滤液蒸干后，得到固体物质。将固体物质用甲醇复溶，定容至5mL后，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
(2)制备对照品溶液：
取没食子酸对照品适量，加甲醇，制成2.132mg/mL的溶液，作为对照品溶液A；
取没食子酸甲酯对照品适量，加甲醇，制成1.097mg/mL的溶液，作为对照品溶液B；
取荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷对照品适量，加甲醇，制成1.644mg/mL的溶液，作为对照品溶液C；
取荭草苷对照品适量，加甲醇，制成0.522mg/mL的溶液，作为对照品溶液D；
用移液管分别吸取对照品A、B、C、D溶液1.2mL、1mL、1mL、1mL至5mL容量瓶中后，用甲醇定容，定容至5mL，作为混合对照品溶液；
(3)含量测定：
色谱条件：色谱柱为Wondasil C18 Herb column(250×4.6mm,5μm)，0.1％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱(0-12min,16％B→19％B；12-12.5min，19％B→18％B；12.5-20min,18％B),流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为273nm(0-10.5min)和350nm(10.5-20min)，理论塔板数均不小于8000，进样量12μL。
将供试品溶液与混合对照品溶液分别过0.22μm的微孔滤膜，分别装入液相小瓶，设置色谱程序，建立一种波长切换法，记录20分钟内的色谱图。测定后，记录峰面积后计算即得。
混合对照品溶液的HPLC谱图和中药复方抑菌凝胶剂的HPLC谱图中均出现没食子酸、没食子酸甲酯、荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷和荭草苷的峰，且峰独立，其分离度好，峰形对称，峰面积满足测定的基本要求。
以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定方法，其特征在于，所述的鉴定方法为采用薄层色谱法对没食子药渣和阿尔泰金莲花进行鉴别；
其中，使用高效硅胶G板对没食子药渣进行鉴别，聚酰胺薄膜板对阿尔泰金莲花进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，
所述的没食子药渣的鉴别包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：
向中药复方抑菌凝胶剂中加入10％的NaCl溶液混匀后，加入甲醇并混匀，过滤，得滤液；将所述的滤液蒸干后加入甲醇复溶，用0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液；
所述的中药复方抑菌凝胶剂与NaCl溶液、甲醇、复溶后的溶液的质量体积比为1g:0.9-1.1ml:0.9-1.1ml:0.25ml；
(2)制备阴性对照品溶液：
以不含没食子药渣提取物的阴性对照凝胶剂作为阴性对照品，采用步骤(1)所述的方法，制备阴性对照品溶液；
(3)制备对照药材溶液：
向没食子药渣中加入甲醇，混匀后，用0.22μm微孔滤膜过滤，得对照药材溶液；所述的没食子药渣与甲醇的质量体积比为0.10-0.11g:25mL；
(4)制备对照品溶液：
向没食子酸中加入甲醇，混匀后，得0.220-0.228mg/mL的对照品溶液a；
向没食子酸甲酯加入甲醇，混匀后，得0.215-0.223mg/mL的对照品溶液b；
(5)鉴别：
吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液和对照品溶液a、b各3μL，分别点样于同一硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，喷显色剂，加热至斑点清晰后，在白光下检识；
所述的阿尔泰金莲花的鉴别包括以下步骤：
(6)制备供试品溶液：
采用步骤(1)的方法，制备供试品溶液：
(7)制备阴性对照品溶液：
以不含阿尔泰金莲花提取物的阴性对照凝胶剂作为阴性对照品，采用步骤1)的方法，制备阴性对照品溶液；
(8)制备对照药材溶液：
向阿尔泰金莲花中加入甲醇，混匀后，用0.22μm微孔滤膜过滤，得对照药材溶液；所述的阿尔泰金莲花与甲醇的质量体积比为0.10-0.105g：25mL；
(9)制备对照品溶液：
向荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷中加入甲醇，混匀后，得0.160-0.168mg/mL的对照品溶液c；
向荭草苷加入甲醇，混匀后，得0.04-0.06mg/mL的对照品溶液d；
(10)鉴别：
吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液和对照品溶液c、d各3μL，分别点样于同一聚酰胺薄膜板上，展开，取出，晾干，喷显色剂，加热至斑点清晰后，在紫外灯下检识。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，
所述的步骤(1)中，中药复方抑菌凝胶剂与NaCl溶液、甲醇、复溶后的溶液的质量体积比为1g：1ml：1ml：0.25ml；
所述的步骤(3)中，所述的没食子药渣与甲醇的质量体积比为0.105g：25mL；
所述的步骤(4)中，对照品溶液a的浓度为0.224mg/mL，对照品溶液b的浓度为0.219mg/mL；
所述的步骤(5)中，所述的展开剂为二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸，显色剂为2％FeCl3，加热温度为105℃；
所述的步骤(6)中，阿尔泰金莲花与甲醇的质量体积比为0.101g：25mL；
所述的步骤(9)中，对照品溶液c的浓度为0.164mg/mL，对照品溶液d的浓度为0.05mg/mL；
所述的步骤(10)中，所述的展开剂为二氯甲烷-丁酮-甲醇-甲酸，显色剂为2％AlCl3，加热温度为105℃。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，
所述的步骤(1)中，向中药复方抑菌凝胶剂中依次加入10％的NaCl溶液、甲醇后，超声20min；
所述的步骤(5)中，二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸的体积比为5:2:1；
所述的步骤(10)中，二氯甲烷-丁酮-甲醇-甲酸的体积比为6:0.5:2：0.6。
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，
所述步骤(10)中，所述紫外灯紫外线波长为366nm。
6.一种中药复方抑菌凝胶剂的含量测定方法，其特征在于，所述的含量测定方法采用HPLC波长切换法测定中药复方抑菌凝胶剂中没食子酸、没食子酸甲酯、荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷和荭草苷的含量。
7.根据权利要求6所述的含量测定方法，其特征在于，所述的含量测定方法包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：
向中药复方抑菌凝胶剂中加入10％的NaCl溶液混匀后，加入甲醇并混匀，过滤，得滤液；将所述的滤液蒸干加入甲醇复溶，用0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液；
所述的中药复方抑菌凝胶剂与NaCl溶液、甲醇、复溶后的溶液的质量体积比为1g:0.9-1.1ml:0.9-1.1ml:0.25ml；
(2)制备对照品溶液：
向没食子酸中加入甲醇，混匀后，得2.132mg/mL的对照品溶液A；
向没食子酸甲酯加入甲醇，混匀后，得1.097mg/mL的对照品溶液B；
向荭草素-2″-O-β-L半乳糖苷加入甲醇，混匀后，得1.644mg/mL的对照品溶液C；
向荭草苷加入甲醇，混匀后，得0.522mg/mL的对照品溶液D；
将对照品溶液A、B、C、D混合后，用0.22μm微孔滤膜过滤，再用甲醇定容，得混合对照品溶液；
所述的对照品溶液A、B、C、D和混合对照品溶液的体积比为1.2:1:1:1:5；
(3)含量测定：
分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，色谱柱为WondasilC18 Herb column，记录20分钟内的色谱图；其中，所述所述流动相A为磷酸-水溶液，流动相B为乙腈。
8.根据权利要求7所述的含量测定方法，其特征在于，
所述的步骤(1)中，中药复方抑菌凝胶剂与NaCl溶液、甲醇、复溶后的溶液的质量体积比为1g:1ml:1ml:0.25ml；
所述的步骤(3)，磷酸-水溶液的质量分数为0.1％，流速1.0ml·min-1，柱温为35℃，进样量12μL。
9.根据权利要求7所述的含量测定方法，其特征在于，
所述的步骤(3)中，流动相B的体积分数变化为：0-12min,16％→19％；12-12.5min，19％→18％；12.5-20min，18％。
10.根据权利要求7所述的含量测定方法，其特征在于，
所述的步骤(3)中，0-10.5min时，检测波长为273nm；10.5-20min时，检测波长为350nm。
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