CN115184479A - 金莲花口服液hplc指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：(1)制备不同供试品溶液；(2)制备混合对照品溶液；(3)采用HPLC进样分析，生成对照指纹图谱(R)；(4)确认有22个共有色谱峰，并指认出：2号峰为荭草素‑2″‑O‑β‑L‑半乳糖苷、4号峰为荭草苷、8号峰为牡荆苷、17号峰为槲皮素；(4)利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似度分析。本发明稳定性高，准确性与重复性好，能较全面的反映金莲花口服液的质量信息，可用于金莲花口服液的生产过程监控和制剂质量的控制。
Description
技术领域
本发明涉及中药指纹图谱建立技术领域，尤其是涉及金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。
背景技术
金莲花口服液是由金莲花单味药材组成的制剂，用于风热邪毒袭肺，热毒内盛引起的上呼吸道感染、咽炎、扁桃体炎。现收载于《中国药典》2020年版一部。
药品的质量是保证临床用药安全有效的前提，目前《中国药典》中用来评价金莲花口服液制剂质量的方法是以荭草苷为指标进行控制，但是金莲花口服液成分复杂，仅靠单一成分的含量测量并不能对金莲花口服液的质量进行整体描述与评价，难以有效反映金莲花口服液的整体质量。
中药指纹图谱作为一种综合的可量化的鉴定手段，其信息量大、特征性强、整体性、模糊性等特点能全面地反映中药所含化学成分的种类和数量，目前已成为符合中药特点的质量控制模式之一，并在中药制剂质量控制上的应用愈加广泛。
目前，国内外尚未见有关于金莲花口服液指纹图谱建立的专利及文献报道。
发明内容
本发明是为了提供一种稳定性高，准确性与重复性好的金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法，能较全面的反映金莲花口服液的质量信息，可用于金莲花口服液的生产过程监控和制剂质量的控制，从而保证产品质量均一稳定，保证临床用药的安全性和有效性。
本发明还提供了一种金莲花口服液HPLC指纹图谱。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明的金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)制备不同供试品溶液。
(2)制备对照品混合溶液：精密称取荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素对照品适量，用体积百分含量为30％～100％甲醇溶液配制成每1mL分别含10～80μg荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、10～80μg荭草苷、5～50μg牡荆苷、5～50μg槲皮素的对照品混合溶液。(3)采用HPLC分别对不同供试品溶液及对照品混合溶液进行进样分析，记录不同供试品溶液HPLC指纹图谱及混合对照品溶液HPLC指纹图谱，以其中1个批次的供试品溶液HPLC指纹图谱作为参照图谱，设置时间窗宽度设为0.1min，采用中位数矢量法计算，经多点校正、数据匹配，生成对照指纹图谱(R)。
(4)通过比对对照品混合溶液HPLC指纹图谱和对照指纹图谱(R)中各色谱峰的出峰时间，确认有22个共有峰，并指认出：2号峰为荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、4号峰为荭草苷、8号峰为牡荆苷、17号峰为槲皮素。
(5)以荭草苷作为参照峰，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对不同批次供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)进行相似度计算分析。本申请中采用的中药色谱指纹图谱相似度评价系统采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)；4号峰荭草苷分离度好，峰面积较大且保留时间适中，故以荭草苷为参照峰。
作为优选，步骤(1)中，所述供试品溶液通过以下方法制得：精密量取金莲花口服液3～10mL于100mL容量瓶中，加入体积百分含量为30％～100％甲醇溶液50～100mL，超声处理5～30min，超声功率400W，超声频率40W，放冷至室温，定容，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取10mL续滤液于25mL容量瓶中，加入体积百分含量为30％～100％甲醇溶液稀释定容至刻度，摇匀，过0.45μm有机微孔滤膜。
作为优选，所述供试品溶液通过以下方法制得：精密量取供试品溶液5mL于100mL量瓶中，加入甲醇80mL，超声处理10min，超声功率400W，超声频率40kHz，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10mL，置25mL量瓶中，加体积百分含量为50％甲醇溶液至刻度，摇匀，过0.45μm有机微孔滤膜滤过。
作为优选，所述供试品溶液中的供试品溶液为金莲花口服液或提取浓缩液。金莲花口服液的制备工艺源自《中国药典》2020年版一部金莲花口服液质量标准[制法]项，为：取金莲花，加水煎煮三次，每次1.5小时，煎液滤过，滤液合并，50℃减压浓缩至相对密度为1.15(即得提取浓缩液)，静置24小时，滤过，滤液中加入单糖浆117.6g、羟苯乙酯0.2g及苯甲酸钠1.8g，加水至1000mL，混匀，静置24小时，滤过，即得金莲花口服液；本发明中的供试品溶液最优选为金莲花口服液。
作为优选，步骤(2)中，所述混合对照品混合溶液通过以下方法制得：精密称取荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素对照品适量，用体积百分含量为50％甲醇溶液配制成每1mL分别含50μg荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、60μg荭草苷、18μg牡荆苷、5μg槲皮素的对照品混合溶液。
作为优选，步骤(3)中，所述HPLC色谱条件为：进样量为20μL；采用Kinetex-XB-C18色谱柱，色谱柱规格为：250mm×4.6mm，5μm；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长340nm；以乙腈为流动相A，体积百分含量0.35％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，在泵与进样器间接50mm×4.6mm I.D,杂质捕集柱，梯度洗脱程序为：
0～12min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为12％∶88％→12％∶88％；
12～25min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为12％∶88％→15％∶85％；25～28min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为15％∶85％→19％∶81％；28～40min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为19％∶81％→23％∶77％；40～46min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为23％∶77％→25％∶75％；46～55min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为25％∶75％→25％∶75％；55～60min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为25％∶75％→33％∶67％；60～65min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为33％∶67％→33％∶67％；65～70min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为33％∶67％→90％∶10％。上述洗脱程序也可如表A表述：
表A梯度洗脱程序表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～12 | 12→12 | 88→88 |
| 12～25 | 12→15 | 88→85 |
| 25～28 | 15→19 | 85→81 |
| 28～40 | 19→23 | 81→77 |
| 40～46 | 23→25 | 77→75 |
| 46～55 | 25→25 | 75→75 |
| 55～60 | 25→33 | 75→67 |
| 60～65 | 33→33 | 67→67 |
| 65～70 | 33→90 | 67→10 |
现有技术中，金莲花口服液含量测定多使用甲醇-乙腈-0.1％磷酸溶液、乙腈-0.1％磷酸溶液、乙腈-0.1％磷酸溶液(含1％四氢呋喃)、乙腈-1％冰醋酸溶液、乙腈-0.35％磷酸溶液等的洗脱效果，申请人通过考察这五种系统的洗脱效果发现，甲醇-乙腈-0.1％磷酸溶液、乙腈-0.1％磷酸溶液、乙腈-0.1％磷酸溶液(含1％四氢呋喃)、乙腈-1％冰醋酸溶液系统洗脱的色谱图中，色谱峰的数量较少，峰的分离度较差，不足以全面代表金莲花口服液的物质基础，因此本发明中采用乙腈-0.35％磷酸溶液作为洗脱剂，在该条件下得到的色谱峰显著地优于其他的洗脱系统。
作为优选，步骤(3)中，22个共有峰分别为：相对保留时间为0.565的1号峰、相对保留时间为0.883的2号峰、相对保留时间为0.946的3号峰、相对保留时间为1.000的4号峰、相对保留时间为1.061的5号峰、相对保留时间为1.091的6号峰、相对保留时间为1.115的7号峰、相对保留时间为1.288的8号峰、相对保留时间为1.368的9号峰、相对保留时间为1.428的10号峰、相对保留时间为1.478的11号峰、相对保留时间为1.702的12号峰、相对保留时间为1.775的13号峰、相对保留时间为1.888的14号峰、相对保留时间为1.912的15号峰、相对保留时间为1.969的16号峰、相对保留时间为2.270的17号峰、相对保留时间为2.348的18号峰、相对保留时间为2.386的19号峰、相对保留时间为2.448的20号峰、相对保留时间为2.815的21号峰、相对保留时间为2.965的22号峰。
一种金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法得到的金莲花口服液HPLC指纹图谱。
因此，本发明具有如下有益效果：提供了一种金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法，通过该方法建立金莲花口服液及其关键工艺提取浓缩液(提取浓缩液)的指纹图谱，并对金莲花口服液及其关键工艺提取浓缩液(提取浓缩液)中的四种有效成分进行定量分析，能较全面地反应金莲花口服液的质量信息，保证产品质量均一稳定，根据物质基础相对峰面积、含量的变化趋势和程度，确定关键工艺控制环节，制定相应的关键点质控标准，可用于金莲花口服液的生产过程监控，对于全过程质量控制体系的建立提供了一定的理论依据和支持，保证临床用药的安全性和有效性。
附图说明
图1是实施例1中混合对照品溶液HPLC指纹图谱。
图2是批号200502-2的金莲花口服液溶液HPLC指纹图谱。
图3是实施例中金莲花口服液溶液对照指纹图谱(R)。
图4是实施例1中10份供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)的叠加图。
图5是专属性试验中阴性样品溶液HPLC指纹图谱。
图6是专属性试验中空白样品溶液HPLC指纹图谱。
图7是专属性试验中荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷对照品溶液HPLC指纹图谱。
图8是专属性试验中荭草苷对照品溶液HPLC指纹图谱。
图9是专属性试验中牡荆苷对照品溶液HPLC指纹图谱。
图10是专属性试验中槲皮素对照品溶液HPLC指纹图谱。
图11是重复性试验中6份供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)的叠加图。
图12是中间精密度试验中6份供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)的叠加图。
图13是溶液稳定性试验中9份供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)的叠加图。
图14是实施例2中3份供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)的叠加图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的描述。
以下实施例中用到的仪器及试剂如下：
仪器：电子天平(XSE205DU，梅特勒-托利多)；pH计(Seven Compact S210，梅特勒-托利多)；高效液相色谱仪(Agilent 1260，安捷伦公司)；超声波清洗器(YM-1001LUS，语盟)。
试药：荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷对照品(批号：20191003，振强生物技术有限公司)、荭草苷对照品(批号：111777-202003，中国食品药品检定研究院)、牡荆苷对照品(批号：111687-201704，中国食品药品检定研究院)、槲皮素对照品(批号：100081-201610，中国食品药品检定研究院)。
试剂：色谱甲醇、乙腈购自美国默克公司，磷酸(EP)购自Scharlur公司，所用水为纯化水(自制)。
根据《中国药典》2020年版一部金莲花口服液质量标准[制法]项，为：取金莲花，加水煎煮三次，每次1.5小时，煎液滤过，滤液合并，50℃减压浓缩至相对密度为1.15，得提取浓缩液并取样，将取样得到的提取浓缩液进行后续生产，静置24小时，滤过，滤液中加入单糖浆117.6g、羟苯乙酯0.2g及苯甲酸钠1.8g，加水至1000mL，混匀，静置24小时，滤过，即得成品并取样，共得10个批次的成品。10个批次的金莲花口服液供试样品均由浙江康恩贝制药股份有限公司生产，基本信息及对应关系见表1。
表1金莲花口服液供试样本基本信息及对应关系
实施例1
金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法
(1)制备不同供试品溶液：取表1中10批金莲花口服液成品分别制备不同供试品溶液，供试品溶液的具体制备方法为：精密量取供试品溶液5mL，置100mL量瓶中，加入甲醇80mL，超声处理10min，功率400W，频率40kHz，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10mL于25mL量瓶中，加体积百分含量为50％甲醇溶液至刻度，摇匀，过0.45μm有机微孔滤膜滤过。
(2)制备混合对照品混合溶液：精密称取荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素对照品适量，用体积百分含量为50％甲醇溶液配制成每1mL分别含50μg荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、60μg荭草苷、18μg牡荆苷、5μg槲皮素的对照品混合溶液。
(3)采用HPLC分别对不同供试品溶液及对照品混合溶液进行进样分析，记录10批供试品溶液HPLC色图谱及混合对照品溶液HPLC指纹图谱(如图1所示)，以批号200502-2的金莲花口服液溶液HPLC指纹图谱(如图2所示)作为参照图谱进行共有峰匹配，设置时间窗宽度设为0.1min，采用中位数矢量法计算，经多点校正、数据匹配，生成对照指纹图谱(R)(如图3所示)。
(4)通过比对对照品混合溶液HPLC指纹图谱和对照指纹图谱(R)中各色谱峰的出峰时间，确认有22个共有峰，并指认出：2号峰为荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、4号峰为荭草苷、8号峰为牡荆苷、17号峰为槲皮素，22个共有峰分别为：相对保留时间为0.565的1号峰、相对保留时间为0.883的2号峰、相对保留时间为0.946的3号峰、相对保留时间为1.000的4号峰、相对保留时间为1.061的5号峰、相对保留时间为1.091的6号峰、相对保留时间为1.115的7号峰、相对保留时间为1.288的8号峰、相对保留时间为1.368的9号峰、相对保留时间为1.428的10号峰、相对保留时间为1.478的11号峰、相对保留时间为1.702的12号峰、相对保留时间为1.775的13号峰、相对保留时间为1.888的14号峰、相对保留时间为1.912的15号峰、相对保留时间为1.969的16号峰、相对保留时间为2.270的17号峰、相对保留时间为2.348的18号峰、相对保留时间为2.386的19号峰、相对保留时间为2.448的20号峰、相对保留时间为2.815的21号峰、相对保留时间为2.965的22号峰；HPLC色谱条件为：进样量为20μL；采用Kinetex-XB-C18色谱柱，色谱柱规格为：250mm×4.6mm，5μm；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长340nm；以乙腈为流动相A，体积百分含量0.35％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，在泵与进样器间接50mm×4.6mm I.D,杂质捕集柱，梯度洗脱程序为：
0～12min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为12％∶88％→12％∶88％；
12～25min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为12％∶88％→15％∶85％；
25～28min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为15％∶85％→19％∶81％；
28～40min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为19％∶81％→23％∶77％；
40～46min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为23％∶77％→25％∶75％；
46～55min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为25％∶75％→25％∶75％；
55～60min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为25％∶75％→33％∶67％；
60～65min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为33％∶67％→33％∶67％；
65～70min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为33％∶67％→90％∶10％；
(5)以荭草苷作为参照峰，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，对10批供试品(金莲花口服液成品)溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)进行相似度计算分析，10批供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)的叠加图如图4所示，计算得到的相似度如表2所示。
表2 10批金莲花口服液溶液HPLC指纹图谱相似度
| 批号 | 相似度 |
| 200502-2 | 0.985 |
| 211101-1 | 0.993 |
| 211101-2 | 0.990 |
| 211101-3 | 0.993 |
| 211201-1 | 0.994 |
| 211201-2 | 0.994 |
| 211201-3 | 0.994 |
| 211202-1 | 0.995 |
| 211202-2 | 0.995 |
| 211202-3 | 0.995 |
从表2可以看出，10批金莲花口服液指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.95，表明不同批次间的相似度较高，工艺相对稳定。
1.指纹图谱方法学考察
1.1专属性试验
制备阴性样品溶液：按处方比例称取单糖浆117.6g、羟苯乙酯0.2g及苯甲酸钠1.8g加入1000mL容量瓶中，用纯化水溶解稀释至刻度。
空白样品溶液：50％甲醇溶液。
制备荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷对照品溶液：精密称取荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷对照品适量，用体积百分含量为50％甲醇溶液配制成每1mL含50μg荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷的对照品混合溶液。
制备荭草苷对照品溶液：精密称取荭草苷对照品适量，用体积百分含量为50％甲醇溶液配制成每1mL含60μg荭草苷的对照品混合溶液。
制备牡荆苷对照品溶液：精密称取牡荆苷对照品适量，用体积百分含量为50％甲醇溶液配制成每1mL含18μg牡荆苷的对照品混合溶液。
制备槲皮素对照品溶液：精密称取槲皮素对照品适量，用体积百分含量为50％甲醇溶液配制成每1mL含5μg槲皮素的对照品混合溶液。
将阴性样品溶液、空白样品溶液、荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷对照品溶液、荭草苷对照品溶液、牡荆苷对照品溶液及槲皮素对照品溶液分别按实施例1中色谱条件进样测定，得阴性样品溶液HPLC指纹图谱、空白样品溶液HPLC指纹图谱、荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷对照品溶液HPLC指纹图谱、荭草苷对照品溶液HPLC指纹图谱、牡荆苷对照品溶液HPLC指纹图谱及槲皮素对照品溶液HPLC指纹图谱分别如图5～图10所示。
根据图1、图2、图5～图10可以看出，辅料对供试品溶液HPLC指纹图谱测定无干扰。
1.2重复性试验
取金莲花口服液(批号200502-2)，平行6份，制成6份供试品溶液(供试品溶液制备方法同实施例1)，采用HPLC分别进样分析(色谱条件同实施例1)，记录6份供试品溶液HPLC指纹图谱，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)计算6份供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)的相似度，计算得到的相似度如表3所示；6份供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)的叠加图如图11所示，从图11可知，6份供试品溶液HPLC指纹图谱呈现22个与对照指纹图谱(R)相应的色谱峰，其中4号峰与参照峰保留时间相应，全峰匹配，故以4号峰荭草苷为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，各共有峰与参照峰的相对峰面积如表4所示，相对保留时间如表5所示。
表3重复性试验金莲花口服液溶液HPLC指纹图谱相似度
表4重复性试验各共有峰相对峰面积
表5重复性试验各共有峰相对保留时间
从表3～5可以看出，6份平行供试品(金莲花口服液成品)溶液HPLC指纹图谱相似度均大于0.95，各共有峰相对保留时间RSD在0～0.29％之间，均小于3％，相对峰面积极差在0～0.008之间，均小于0.03，表明该方法重复性良好。
1.3中间精密度试验
取金莲花口服液(批号200502-2)，平行6份，制成6份供试品溶液(供试品溶液制备方法同实施例1)，采用HPLC分别进样分析(色谱条件同实施例1)，记录6份供试品溶液HPLC指纹图谱，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)计算6份供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)的相似度，计算得到的相似度如表6所示；6份供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)的叠加图如图12所示，从图12可见，6份供试品溶液HPLC叠加指纹图谱呈现22个与对照指纹图谱(R)相应的色谱峰，其中4号峰与参照峰保留时间相应，全峰匹配，故以荭草苷为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，各共有峰与参照峰的相对峰面积如表7所示，相对保留时间如表8所示。
表6中间精密度试验金莲花口服液溶液HPLC指纹图谱相似度
表7中间精密度试验各共有峰相对峰面积
表8中间精密度试验各共有峰相对保留时间
从表6～8可以看出，6份供试品(金莲花口服液成品)溶液HPLC指纹图谱相似度均大于0.95，与重复性试验共12份供试品溶液各共有峰相对保留时间RSD在0～1.10％之间，均小于3％，相对峰面积极差在0～0.021之间，均小于0.03，表明该方法中间精密度良好。
1.4溶液稳定性试验
取金莲花口服液(批号200502-2)，按实施例1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按实施例1中色谱条件对供试品溶液分别于0小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时进样，记录9份供试品溶液HPLC指纹图谱，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)计算9份供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)的相似度，计算得到的相似度如表9所示；9份供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)的叠加图如图13所示，从图13可见，9份供试品溶液HPLC叠加指纹图谱呈现22个与对照指纹图谱(R)相应的色谱峰，其中4号峰与参照峰保留时间相应，全峰匹配，故以荭草苷为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，各共有峰与参照峰的相对峰面积如表10所示，相对保留时间如表11所示。
表9稳定性试验供试品溶液HPLC叠加指纹图谱相似度
表10稳定性试验各共有峰相对峰面积
表11稳定性试验各共有峰相对保留时间
从表9～11可以看出，9份供试品(金莲花口服液)溶液HPLC指纹图谱相似度均大于0.95，各共有峰相对峰面积极差在0～0.009之间，均小于0.03，相对保留时间的RSD在0～1.83％之间，均小于3％，说明溶液在72h内稳定性良好。
2.金莲花口服液四种有效成分测定方法学考察
2.1专属性试验
按“1.1专属性试验”项进行操作，根据图1、图2、图5～图10可以看出，辅料对荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素含量测定无干扰。
2.2定量限试验
取荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素对照品，分别用体积百分含量50％甲醇溶液溶解并逐级稀释制成限度测试溶液。按实施例1中色谱条件进样测定，结果表明，荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素定量限浓度分别为：0.2025μg/mL、0.1205μg/mL，0.0723μg/mL，0.2012μg/mL，信噪比均大于10，已高于定量限要求。重复性试验结果荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素的保留时间RSD分别为0.77％、0.59％、0.42％、0.19％。
2.3检测限试验
取荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素对照品，分别用50％甲醇溶液溶解并逐级稀释制成限度测试溶液。按实施例1中色谱条件进样测定，结果表明，荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素检测限浓度分别为：0.1013μg/mL、0.06025μg/mL、0.03615μg/mL、0.1006μg/mL，信噪比均大于3。高于最低检测限要求。
2.4线性与范围
精密称取对照品适量，稀释至不同质量浓度，按实施例1中色谱条件进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表12。
表12各成分线性关系
从表12可知，各成分在各自范围内线性关系良好。
2.5准确度试验
取批号200502-2的金莲花口服液，分别精密量取2.5mL，置100mL量瓶中，分3组各分别加入荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素对照品溶液适量(低、中、高三个浓度的混合对照品溶液)，按实施例1中供试品溶液的制备方法制备9份供试品溶液，并按实施例1中的色谱条件分别进样测定，记录色谱图，以外标法计算回收率并计算RSD值，结果见表13。
表13四种成分的加样回收率
注：回收率＝测得量/加入量×100％。
从表13可知，荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素平均回收率分别为102.2％、101.7％、99.2％、96.2％、RSD为1.6％、0.9％、0.8％、5.5％，各浓度点回收率均在85％～110％以内，本方法准确度良好。
2.6重复性试验
按实施例1中1.2项进行重复性试验，以外标法计算含量并计算RSD值，结果见表14。
表14重复性试验含量测定结果(mg/mL)
| 编号 | 荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷 | 荭草苷 | 牡荆苷 | 槲皮素 |
| 1 | 2.63 | 2.90 | 0.85 | 0.23 |
| 2 | 2.63 | 2.90 | 0.84 | 0.23 |
| 3 | 2.64 | 2.91 | 0.85 | 0.23 |
| 4 | 2.68 | 2.95 | 0.86 | 0.23 |
| 5 | 2.65 | 2.92 | 0.85 | 0.23 |
| 6 | 2.65 | 2.92 | 0.85 | 0.23 |
| 平均值 | 2.63 | 2.92 | 0.85 | 0.23 |
| RSD(％) | 0.71 | 0.64 | 0.75 | 0.00 |
从表14可知，重复测定6次，荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷平均含量为2.63mg/mL，RSD为0.71％，荭草苷平均含量为2.92mg/mL，RSD为0.64％，牡荆苷平均含量为0.85mg/mL，RSD为0.75％，槲皮素平均含量为0.23mg/mL，RSD为0.00％；RSD均小于3％，说明方法重复性良好。
2.7中间精密度试验
按实施例1中1.3中间精密度试验方法，取金莲花口服液(批号200502-2)，平行6份，制成6份供试品溶液(供试品溶液制备方法同实施例1)，2名分析人员于不同时间、两台仪器上分别采用HPLC进行连续进样(色谱条件同实施例1)，记录色谱图。与表13测定结果一起分析比较，结果见表15。
表15中间精密度试验结果
从表15可知，两名不同人员取同一份样品，在不同时间用两台仪器分别测定12份，荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素含量RSD分别为0.89％、0.98％、1.04％、2.24％，均小于3％，说明本方法中间精密度良好。
2.8溶液稳定性试验
按实施例1中1.4溶液稳定性试验，取金莲花口服液(批号200502-2)，按实施例1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按实施例1中色谱条件对供试品溶液分别于0小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时进样，记录色谱图。按峰面积计，结果见下表16～17。
表16对照品溶液稳定性试验结果
表17供试品溶液稳定性试验结果
结果表明：在72小时内，对照品溶液色谱图中荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素主峰面积RSD为0.47％、0.44％、0.54％、1.16％，供试品溶液色谱图中荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素主峰面积RSD为0.60％、0.35％、0.60％、0.46％，均小于2％，说明对照品溶液、供试品溶液在72小时内稳定，均满足测定需求。
2.9指标成分含量的测定
取表1中的10个批次金莲花口服液，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备10份供试品溶液，按实施例1中色谱条件分别进样，记录各指标成分的峰面积，按外标法计算。不同批次金莲花口服液中各指标化学成分含量结果见表18。
表18 10个批次金莲花口服液中四种成分含量测定结果(mg/mL，n＝2)
由表18可知，金莲花口服液不同批次间四种药效指标成分含量差别不显著。证明金莲花口服液质量均一稳定。
实施例2
关键工艺提取浓缩液的指纹图谱及四种成分测定
取表1中3个批次的金莲花口服液提取浓缩液各3mL，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按实施例1中色谱条件分别进样分析，记录3份供试品溶液HPLC指纹图谱，3份供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)的叠加图如图14所示，从图14可见，3份供试品溶液HPLC叠加指纹图谱呈现22个与对照指纹图谱(R)相应的色谱峰，其中4号峰与参照峰保留时间相应，全峰匹配，故以荭草苷为参照峰，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)计算3份供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)的相似度，计算得到的相似度如表19所示。
表19 3批金莲花口服液提取浓缩液指纹图谱相似度
| 批号 | T211101 | T211102 | T211103 |
| 相似度 | 0.994 | 0.994 | 0.993 |
从表19可知，3批供试品(提取浓缩液)溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.95，不同批次间的相似度较高，工艺相对稳定。
取表1中3批提取浓缩液所制备的对应9批成品溶液分别按实施例1的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，并按实施例1中色谱条件分别进样分析，记录9批成品溶液HPLC指纹图谱；以荭草苷为参照峰，分别计算每批提取浓缩液溶液与其对应3份成品溶液的各共有峰与参照峰的相对峰面积，并按外标法计算四种成分含量；其中批号T211101的提取浓缩液和对应成品中各共有峰相对峰面积及四种测定含量的变化分别见表20、表21；批号T211102的提取浓缩液和对应成品中各共有峰相对峰面积及四种测定含量的变化分别见表22、表23；批号T211103的提取浓缩液和对应成品中各共有峰相对峰面积及四种测定含量的变化分别见表24、表25。
表20批号T211101的提取浓缩液和对应成品共有峰相对峰面积
表21批号T211101的提取浓缩液和对应成品中四种成分测定结果(mg/mL)
表22批号T211102的提取浓缩液和对应成品各共有峰相对峰面积
表23批号T211102的提取浓缩液和对应成品中四种成分测定结果(mg/mL)
表24批号T211103的提取浓缩液和对应成品各共有峰相对峰面积
表25批号T211103的提取浓缩液和对应成品中四种成分测定结果(mg/mL)
根据表21、23、25可知，各成分含量规律如下：由提取浓缩过程到金莲花口服液成品稀释约1倍，故荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素各含量指标也同步降低约1倍，表明不同批次药材的工艺过程相对稳定；根据表20、22、24则可知，不同工艺过程各共有峰相对峰面积的变化规律如下：由提取浓缩过程到金莲花口服液成品，除9号峰11号峰略有升高外，其余各共有峰相对峰面积均无明显变化。由此说明不同批次药材的工艺过程相对稳定。
以上试验结果表明，本发明提供的一种金莲花口服液指纹图谱的建立方法及其指纹图谱与应用，较全面地分析了金莲花口服液的整体成分，能够基本代表反映金莲花口服液的有效成分和物质基础，可以通过建立金莲花口服液及其提取浓缩液的指纹图谱，对口服液各指标成分在不同工艺过程含量及变化规律进行检测，对制剂不同工艺环节的质量控制有一定的鉴别意义，为全过程质量控制体系的建立提供了一定的理论依据和支持，能较全面的反映金莲花口服液的质量信息，保证产品质量均一稳定。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (8)
1.金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备不同供试品溶液；
(2)制备对照品混合溶液：精密称取荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素对照品适量，用体积百分含量为30％～100％甲醇溶液配制成每1mL分别含10～80μg荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、10～80μg荭草苷、5～50μg牡荆苷、5～50μg槲皮素的对照品混合溶液；
(3)采用HPLC分别对不同供试品溶液及对照品混合溶液进行进样分析，记录不同供试品溶液HPLC指纹图谱及混合对照品溶液HPLC指纹图谱，以其中1个批次的供试品溶液HPLC指纹图谱作为参照图谱，设置时间窗宽度设为0.1min，采用中位数矢量法计算，经多点校正、数据匹配，生成对照指纹图谱(R)；
(4)通过比对对照品混合溶液HPLC指纹图谱和对照指纹图谱(R)中各色谱峰的出峰时间，确认有22个共有峰，并指认出：2号峰为荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、4号峰为荭草苷、8号峰为牡荆苷、17号峰为槲皮素；
(5)以荭草苷作为参照峰，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对不同批次供试品溶液HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(R)进行相似度计算分析。
2.根据权利要求1所述的金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(1)中，所述供试品溶液通过以下方法制得：精密量取金莲花口服液3～10mL于100mL容量瓶中，加入体积百分含量为30％～100％甲醇溶液50～100mL，超声处理5～30min，超声功率400W，超声频率40W，放冷至室温，定容，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取10mL续滤液于25mL容量瓶中，加入体积百分含量为30％～100％甲醇溶液稀释定容至刻度，摇匀，过0.45μm有机微孔滤膜。
3.根据权利要求2所述的金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述供试品溶液通过以下方法制得：精密量取供试品5mL于100mL量瓶中，加入甲醇80mL，超声处理10min，超声功率400W，超声频率40kHz，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10mL于25mL量瓶中，加体积百分含量为50％甲醇溶液至刻度，摇匀，过0.45μm有机微孔滤膜滤过。
4.根据权利要求1所述的金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述供试品溶液中的供试品为金莲花口服液或提取浓缩液。
5.根据权利要求1所述的金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合对照品混合溶液通过以下方法制得：精密称取荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素对照品适量，用体积百分含量为50％甲醇溶液配制成每1mL分别含50μg荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、60μg荭草苷、18μg牡荆苷、5μg槲皮素的对照品混合溶液。
6.根据权利要求1所述的金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，所述HPLC色谱条件为：进样量为20μL；采用Kinetex-XB-C18色谱柱，色谱柱规格为：250mm×4.6mm，5μm；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长340nm；以乙腈为流动相A，体积百分含量0.35％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，在泵与进样器间接50mm×4.6mm I.D,杂质捕集柱，梯度洗脱程序为：
0～12min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为12％∶88％→12％∶88％；
12～25min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为12％∶88％→15％∶85％；
25～28min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为15％∶85％→19％∶81％；
28～40min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为19％∶81％→23％∶77％；
40～46min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为23％∶77％→25％∶75％；
46～55min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为25％∶75％→25％∶75％；
55～60min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为25％∶75％→33％∶67％；
60～65min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为33％∶67％→33％∶67％；
65～70min，流动相A体积百分含量∶流动相B体积百分含量为33％∶67％→90％∶10％。
7.根据权利要求1所述的金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，22个共有色谱峰分别为：相对保留时间为0.565的1号峰、相对保留时间为0.883的2号峰、相对保留时间为0.946的3号峰、相对保留时间为1.000的4号峰、相对保留时间为1.061的5号峰、相对保留时间为1.091的6号峰、相对保留时间为1.115的7号峰、相对保留时间为1.288的8号峰、相对保留时间为1.368的9号峰、相对保留时间为1.428的10号峰、相对保留时间为1.478的11号峰、相对保留时间为1.702的12号峰、相对保留时间为1.775的13号峰、相对保留时间为1.888的14号峰、相对保留时间为1.912的15号峰、相对保留时间为1.969的16号峰、相对保留时间为2.270的17号峰、相对保留时间为2.348的18号峰、相对保留时间为2.386的19号峰、相对保留时间为2.448的20号峰、相对保留时间为2.815的21号峰、相对保留时间为2.965的22号峰。
8.一种如权利要求1～7任一项所述的金莲花口服液HPLC指纹图谱的建立方法得到的金莲花口服液HPLC指纹图谱。
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