CN112753914A - 一种糙米乳功能性饮料及其二级发酵全效加工方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种糙米乳功能性饮料及其二级发酵加工方法，包括发芽、蒸米、一级发酵、冷却、二级发酵、灭活、研磨、调配均质、灌装杀菌等步骤。本发明采用耐受高温且具有高液化糖化能力的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BTJQ4和具有耐受高酸高糖且产香显著的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RPC22为发酵剂，采用二级发酵方法加工糙米乳饮料。本技术不仅充分利用了二次发酵所产生的天然酸甜口感和流体稳定性，还能提高产品的γ‑氨基丁酸、氨基酸等功能成分含量，大大改善了糙米的适口性，并实现糙米原料的全效利用。

Description

一种糙米乳功能性饮料及其二级发酵全效加工方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种糙米乳功能性饮料及其二级发酵全效加工方法。
背景技术
糙米是稻谷仅仅脱去外保护皮层稻壳后的颖果，含有胚芽和谷糠，由于内保护皮层完好，与普通精致白米相比，粗纤维、糠蜡、维他命、矿物质等成分含量较多，口感较粗、质地紧密、较难煮熟。糙米发芽后，内源酶如淀粉酶、蛋白酶、植酸酶等被激活和释放，还原糖、总蛋白质、可溶性蛋白、膳食纤维、维生素等含量均有不同程度增加，γ-氨基丁酸(GABA)、谷胱甘肽、六磷酸肌醇、植物甾醇等生理活性物质也大量产生，是具有广泛功能性疗效的新一代"医食同源"主食产品。发芽糙米中含有γ-氨基丁酸100-150mg/100g，是糙米的2倍。以发芽糙米为原料制备的糙米乳饮料对维护机体健康具有重要意义，是有效预防现代饮食习惯所带来“精粮病”的重要健康饮品。
中国专利CN102952663B，公开了一种发酵发芽糙米乳饮料的制备方法，包括以下步骤：1、蒸好的发芽糙米饭中拌入酒曲，然后将酒缸置于培养箱中27～30℃下进行发酵6-8天；2、往含有发酵好的米酒及酒糟的酒缸中加水后打浆，过胶体磨2-3次； 3、步骤2中浆液添加α-淀粉酶，糖化酶进行酶解；4、往步骤3制得的酶解液中加水至固形物的浓度为10-20％，加入添加剂调配成饮料。该专利技术方案仅采用一级液化发酵，而且液化温度为常温，常温发酵往往的液化糖化速度慢，同时因为敞开式发酵环境，极易感染其他杂菌，造成食品安全隐患。糙米质地结构较为紧密，仅仅采用酶制剂或传统生物发酵技术，无法提高不可溶成分蛋白、淀粉、膳食纤维等的利用率，产品适口性以及流体稳定性也降低，加工过程往往需要去除大量不可溶米渣等加工副产物，无法实现全效加工利用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种糙米乳功能性饮料及其二级发酵全效加工方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种糙米乳功能性饮料的二级发酵全效加工方法，包括以下步骤：
(1)发芽：将糙米洗净后，加入50-60℃净水和植酸酶进行发芽，植酸酶用量为1000-10000U/kg，密封保温浸泡4-15h，浸米程度以米粒保持完整、可指掐成粉状、无粒心为宜；
(2)蒸米：沥干水分，将发芽糙米置于121℃高压锅中蒸煮30-60min，得到熟糙米，米饭的糊化程度观察饭心，不得有白心存在；
(3)液化糖化发酵剂活化：将液化糖化发酵剂用其2-10倍质量的45-55℃的温水搅拌均匀，活化20-100min；
所述液化糖化发酵剂为耐受高温的发酵剂且具有高液化糖化能力的发酵剂，具体为地衣芽孢杆菌BTJQ4或其扩培液，地衣芽孢杆菌BTJQ4已于2020年12月11日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020892；
(4)接种：将熟糙米按重量比1:1加入净水，同时加入熟糙米重量5-10％的液化糖化发酵剂，快速搅拌均匀，搅拌全程应保持熟糙米中心温度为50-60℃；
(5)一级发酵：将接种后的糙米置于50-60℃发酵8-18h，直至糙米出现明显液化，其可溶性固形物达30％以上，且pH值不低于5.2，成为一级发酵浆液；
(6)冷却：将一级发酵浆液在洁净环境中冷却至25-30℃，备用；
(7)二级发酵：二级发酵采用乳酸菌和酵母菌组成的复合发酵剂，各菌种分别扩培2次，使菌体生物量达108CFU/mL以上，经4800-6000r/10min离心取菌泥，用无菌水洗脱，按原体积复原，按一级发酵浆液重量重量的1-10％接种，置于20-35℃环境发酵5-25h，控制发酵终点pH值4.0-4.8；
所述复合发酵剂由植物乳杆菌RPC22(Lactobacillus plantarum RPC22)、酿酒酵母JJ4组成，此外，还可添加副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38，其中，植物乳杆菌RPC22 于2019年4月26日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019297；
进一步的，所述复合发酵剂可以由植物乳杆菌RPC22∶酿酒酵母JJ4＝1∶1组成，或者由植物乳杆菌RPC22∶酿酒酵母JJ4：副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38＝1∶1∶1 组成；
(8)灭活：二级发酵后的糙米用水浴杀菌，保持中心温度100℃维持10-30min，注意应边加热边搅拌，冷却后成为糙米发酵基料，冷藏备用；
(9)研磨：将糙米发酵基料加热至78-83℃，用胶体磨研磨1-5次；
(10)调配均质：将糙米发酵基料用净水调整可溶性固形物含量为10-15％，pH 值为4.2-4.6，再用高压均质机均质(60MPa)1-5次；
(11)灌装杀菌：热灌装，沸水浴灭菌30min。
步骤(1)中，采用50℃-60℃条件下浸泡糙米可提高出饭率、膨胀率和米汤固形物，有利于发酵剂增殖，同时采用50-60℃净水、植酸酶及密封均是为了提高出芽率，以及提高GABA等得率。
二级发酵过程所采用的植物乳杆菌RPC22具有以下特性：较强的抗逆性：能耐受pH值2.5的酸度和达12％的盐浓度；产酸快的特性：培养24h后产酸总量达到18.63 g/L；所述植物乳杆菌RPC2用于二级发酵时，在控制发酵品质的同时能增加成品的风味口感。
本发明的有益效果在于：(1)采用两次发酵相结合制备糙米乳饮料，一级发酵是高温条件下的液化糖化发酵，二级发酵是采用乳酸菌和酵母菌为复合发酵剂的增加风味的发酵。(2)一级发酵过程主要进行液化糖化发酵，通过靶向筛选方法选育出耐受高温的液化糖化发酵剂，可在50-60℃发酵，有利于加快糙米液化糖化速率，并能利用高温抑制开放式生产环境中其他杂菌生长，同时获得pH值不低于5.2的低酸发酵液，以有利于后续二级发酵。(3)二级发酵过程主要进行产酸增香发酵，以自主筛选的产酸能力强、发酵风味好、耐酸及耐受糖渗透压能力高的植物乳杆菌RPC22 为主，选用低产酒精的酿酒酵母JJ4复配，可添加或不添加其他已知乳酸菌，如副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38。(3)本发明经过两次发酵，瓦解了糙米原有紧实结构，提高淀粉及蛋白利用率，增加了产品中GABA、膳食纤维等特殊活性营养成分含量，并赋予饮料愉悦宜人的发酵风味，无需额外添加甜味、酸味调节剂，或增稠稳定剂，能够保持天然的且协调的酸甜口感和较理想的流体稳定性，实现糙米乳饮料的全效利用，达到加工零排放的节本增效减排目的。
附图说明
图1为实施例1的细菌菌群物种注释krona图，该图为样品物种分类学组成的交互展示，扇形大小反映了不同分类水平的物种相对丰度高低，从里到外分别代表不同分类水平(门纲目科属种)的丰度情况。
图2为实施例1的细菌属水平菌群相对丰度。
图3为实施例1的真菌菌群物种注释krona图。
图4为实施例1的真菌属水平菌群相对丰度。
图5为各菌株发酵期间可溶性固形物含量变化情况。
图6为各菌株发酵期间pH值变化情况。
图7为LB平板菌落及显微图片。
图8为基于16S rDNA的菌株BTJQ4系统发育树。
图9为菌株BTJQ4不同培养温度下OD600变化情况。
图10为菌株BTJQ4在45℃下生长曲线。
图11为二级复配发酵的pH值与感官评分结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1高液化糖化力发酵剂分离筛选
1.1分离源：酿造酒曲，福建省三明地区农户自制，用于传统酿造工艺采用50℃以上的发酵。
1.2.地方特色酿造酒曲菌群结构解析
1.2.1样品cDNA提取方法
参照DNA Kit(OMEGA Soil RNA Kit)试剂盒说明书，提取得到的RNA样品用 1％琼脂糖凝胶电泳检测和分光光度法(260nm/280nm光密度比)进行质量检测，再经
Figure RE-GDA0002952444730000041
DNase I(RNase-free)试剂盒处理去除剩余的DNA，随后将RNA反转录成cDNA，并用
Figure RE-GDA0002952444730000042
XP试剂盒纯化。
1.2.2菌群结构高通量测序方法
样品委托北京奥维森科技有限公司，利用IlluminaMiseq PE300高通量测序平台测序，检测得到的原始序列数据上传至NCBI中SequenceRead Archive数据库。项目编号AWGT20051302。
细菌采用16s测序，真菌采用ITS测序。真菌TS1(ITS1-ITS2)引物为F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和R(TGCGTTCTTCATCGATGC)，细菌16S V3-V4引物为338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3’)。PCR反应体系：12.5μl 2×Taq PCR MasterMix,3μl BSA(2ng /μl),2Primer(5uM),2μl模板cDNA,和5.5μlddH2O。反应参数：95℃预变性 5min；95℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸45s，32个循环；72℃延伸 10min。测序原始序列上传至NCBI的SRA数据库。
1.2.3细菌菌群结构分析结果
细菌菌群物种注释结果见图1。优势纲：芽胞杆菌纲(Bacilli)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和Chloroplast。优势目：芽胞杆菌目(Bacillales)、乳杆菌目(Lactobacillales)、Bromus_tectorum、肠杆菌目(Enterobacteriales)、立克次氏体目(Rickettsiales)。优势科：芽胞杆菌科(Bacillaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、Bromus_tectorum、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、Mitochondria。优势属：芽胞杆菌属(Bacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)、Bromus_tectorum、泛菌属(Pantoea)、未知属。优势种：未知种、融合魏斯氏菌(Weissella_confusa)、 Bromus_tectorum、发酵乳杆菌(Lactobacillus_fermentum)、植物乳杆菌 (Lactobacillus_plantarum)。以属水平菌群相对丰度为例(见图3)，发酵剂B的细菌菌群以芽胞杆菌属(Bacillus)为最主要菌群，占比高达48.1％，其次是魏斯氏菌属(Weissella)的14.4％。
由于液化糖化发酵过程在55℃下进行，魏斯氏菌属(Weissella)耐受高温能力差，而芽孢杆菌属(Bacillus)重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢，因此可在较高温度等恶劣环境下增殖并进行代谢活动，产生淀粉酶等丰富酶系，是液化糖化发酵的最主要执行者。
1.2.4真菌菌群结构分析结果
真菌菌群物种注释结果见图2。优势纲：酵母菌纲(Saccharomycetes)、毛霉纲(Eurotiomycetes)；优势目：酵母菌目(Saccharomycetales)、毛霉目(Eurotiales)。优势科：酵母菌科(Saccharomycetaceae)、根霉科(Phaffomycetaceae)、未知科(unidentified)、毛霉科(Aspergillaceae)。优势属：酵母菌属(Saccharomyces)、拟威尔嗜杀酵母(Cyberlindnera)、未知属(unidentified)、曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)。优势种：粟酒裂殖酵母(Saccharomyces_mikatae)、比恩塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera_fabianii)、黑曲霉(Aspergillus_niger)。以属水平菌群相对丰度为例(见图4)，发酵剂B的真菌菌群中，酵母菌属(Saccharomyces)占比高达 78.1％，拟威尔嗜杀酵母(Cyberlindnera)和未知属(unidentified)分别占比7.6％，曲霉属(Aspergillus)占比4.2％。因此可以推断，酵母菌属(Saccharomyces)可能对液化糖化特性或风味具有主要贡献。
实施例2地衣芽孢杆菌的分离、筛选及鉴定
1.1培养基：LB琼脂培养基和马铃薯葡萄糖肉汤培养基。
1.2试验方法
1.2.1菌株分离纯化
根据样品中细菌菌群解析结果，对高丰度种属进行选择性分离培养。取适量样品，无菌操作将分离样品研碎，取5g于45mL无菌水中，放入玻璃珠，150转/分钟摇床振荡30min，置于80℃水浴锅加热20min，后迅速冷却至室温，采用对数稀释涂布法，将合适的稀释梯度涂布于LB培养基上，于55℃下培养，挑取单菌落在平板进行3次连续划线纯化培养，得到纯菌株并保存。
1.2.2菌株菌悬液制备
将初筛获得菌株用LB培养基扩培2次，获得生物量达108cfu/mL的菌株培养液，取适量菌液于4℃下6000转/min，离心10min，洗脱两次取菌坭，用无菌生理盐水复原至原体积，重悬后备用。
1.2.3高温液化糖化力菌株筛选
将糯米蒸熟，摊凉后按料液比1:2加入蒸馏水，分装于250mL三角瓶内，每瓶 60g，预热至55℃，将待筛选菌株按接种量5％分别接入，监测发酵过程的可溶性固形物含量和pH。
1.2.4菌种生物学鉴定
对具有高温液化糖化力特性的菌株进行形态学观察和分子生物学鉴定。
形态学上对菌株平板菌落和显微形态进行拍照。
分子生物学鉴定：采用试剂盒法提取菌株的基因组DNA。以目标菌株的基因组 DNA为模板，采用16S rRNA基因通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCMT-GGCTCAG-3′) 和1492r(5′[5′-TACGGYTACCTTGTTACGACT T-3′]扩增16S r RNA基因。PCR反应体系：2×Taq PCRMaster mix 10μL，正、反向引物(10μmol/L)各1μL，模板DNA 1μL， ddH2O 12μL。PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 1min，循环30 次；72℃ 10min。将扩增的PCR产物送基因公司完成片段测序，序列提交GenBank 数据库用来比对分析。获得相关种属的16SrRNA基因序列，在MEGA X软件中使用邻接法(Neighbor-Joining method)构建系统发育树，采用Bootstrap法对进化树分支聚类的稳定性进行评价，重复1000次，初步确定产酶菌株的种属分类地位。
1.2.5优选菌种生理特性研究
(1)最适生长温度
将菌株按106cfu/mL浓度接种于LB肉汤培养基中，分别置于35、40、45、50、 55、60℃下培养，监测发酵过程pH值及OD600，每个处理重复2次。
(2)菌株生长曲线：
将菌株以106cfu/mL浓度接种于LB肉汤培养基中，置于最适生长温度下，230 r/min培养，监测培养过程的菌量变化，每个处理重复2次。
1.3结果与分析
1.3.1菌株分离纯化
挑选并纯化菌株10株，在高温55℃条件下的糖化液化能力进行检测，结果见图5。BTJQ4在10株菌株中糖化液化能力最强，在发酵7h的可溶性固形物含量即达17％，与发酵24h相当，说明其液化糖化能力强且速度快。各菌株的产酸水平见图6，发酵 7h时，除了BTJQ333，其他菌种的发酵pH均高于5.8；发酵24h时，BGBJ514、BTJQ4、 BGBJ112和BGBJ19的发酵pH仍高于5.8。综上，BTJQ4是一株液化糖化能力强且速度快、产酸低的优良发酵菌种。
2.3菌株BTJQ4的鉴定
2.3.1菌株形态学观察
菌株BTJQ4在LB琼脂平板上，35℃下生长24h后，如图7所示，形成的菌落较大，表面光滑，不透明，粘着，边缘锯齿状，细胞经革兰氏染色后呈紫色，判断其为革兰氏阳性菌，菌株细胞呈杆状，不成链，大小2-4um。
2.3.2分子生物学鉴定
将菌株BTJQ4的16s rDNA序列与NCBI数据库中的模式代表菌株一同构建系统发育树，图8显示BTJQ4与Bacillus licheniformis DSM 13以100的分值聚类在同一进化分支，初步鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌。
2.3菌株BTJQ4最适生长温度
图9显示不同温度下菌株BTJQ4在0-3h的OD600值增长较慢；培养期的3-24h，其OD600快速增长；24h至48h OD值变化减缓，并在后期出现略微下降。相对其他温度，其在45℃条件下培养27h时的OD600值最大，达到10.38，45℃是其最适生长温度。
2.3菌株BTJQ4生长曲线
如图10中所示，菌株BTJQ4在马铃薯葡萄糖肉汤培养基中，45℃下，摇速230r/min培养48h，0-4h菌量变化不大，为其生长的迟滞期；4-10h，菌量快速增长，为其生长对数期；10-24h，菌量较为稳定，为其生长稳定期；24h后菌量逐渐下降，为其衰亡期。
实施例3二级发酵的适宜菌种筛选
1.菌种
1.1本实验室分离、鉴定并保存菌种：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)RPC22，保藏号CCTCC M:2019297；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)JJ4，保藏号CCICCNO：M:2018219；副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)RP38，保藏号CCICC NO：M:2019322，均由福建省农产品(食品)加工重点实验室提供。
1.2购自中国工业微生物菌种保藏中心：瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)CICC 20243、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)CICC 6084、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CICC 22709。
2.原料：液化糖化后的糙米浆基质。
3.试验方法
各菌种分别扩培2次，使菌体生物量达108CFU/mL以上，经4800r/10min离心取菌泥，用无菌水洗脱，按原体积复原备用，按糙米浆重量的2％接种，置于30℃发酵10h，检测发酵过程的pH值变化，发酵结束后沸水浴杀菌，中心温度100℃维持 15min，冷却后进行风味评价，评价方法同实施例1的感官评价法。选取风味良好处理组进行验证试验，检测发酵过程的pH值变化以确定最佳发酵时间。
4.菌种筛选试验结果
二级发酵结果见表1。单菌发酵处理组里，处理1-1pH值最低即产酸高，感官评价最好。复配发酵处理组的感官评分均高于单菌发酵组，其中，处理2-1、2-2、2-3 的pH值均低于5，感官评分均达9.2分以上。综上，菌株RPC22具有产酸能力强且产香増味的特点，是适用于糙米乳发酵的理想菌种，适宜与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)JJ4、副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei) RP38和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CICC 20243复配发酵。
根据前期试验，选用RPC22:RP38:JJ4＝1:1:1进行二级复配发酵，检测发酵过程pH值变化并进行感官评分，结果见图11。pH值随着发酵时间延长而降低，发酵8h 的感官评分最高达9.6，此时pH值为4.75，发酵10h的感官评分最高达9.0，此时pH 值为4.54，因此，二级复配发酵的适宜发酵时间为8-10h，适宜pH可控制在4.5-4.8，同时，在实际生产中可用pH值作为快速评价二级复配发酵风味的简易指标。
表1二级发酵结果
Figure RE-GDA0002952444730000081
Figure RE-GDA0002952444730000091
以下实施例，以筛选出的液化糖化发酵剂以及二级发酵剂进行糙米乳饮料的加工。
实施例4
一种糙米乳功能性饮料的二级发酵全效加工方法，包括以下步骤：
(1)发芽：将糙米洗净后，加入50℃净水和植酸酶进行发芽，植酸酶用量为 1000-U/kg，密封保温浸泡，浸米程度以米粒保持完整、可指掐成粉状、无粒心为宜；
(2)蒸米：沥干水分，将发芽糙米置于121℃高压锅中蒸煮30min，得到熟糙米；
(3)液化糖化发酵剂活化：将液化糖化发酵剂用其2倍质量的45℃的温水搅拌均匀，活化100min；
所述液化糖化发酵剂为地衣芽孢杆菌BTJQ4；
(4)接种：将熟糙米按重量比1:1加入净水，同时加入熟糙米重量5％的液化糖化发酵剂，快速搅拌均匀，搅拌全程应保持熟糙米中心温度为50℃；
(5)一级发酵：将接种后的糙米置于50℃发酵18h，直至糙米出现明显液化，测得可溶性固形物达30％，pH值为5.3，成为一级发酵浆液；
(6)冷却：将一级发酵后浆液在洁净环境中冷却至25℃，备用；
(7)二级发酵：二级发酵采用由植物乳杆菌RPC22∶酿酒酵母JJ4＝1∶1组成的复合发酵剂，各菌种分别扩培2次，使菌体生物量达108CFU/mL以上，经4800r/10min 离心取菌泥，用无菌水洗脱，按原体积复原，按一级发酵浆液重量的1％接种，置于 20℃环境发酵25h，控制发酵终点pH值4.0；
(8)灭活：二级发酵后的糙米用水浴杀菌，保持中心温度100℃维持10min，注意应边加热边搅拌，冷却后成为糙米发酵基料，冷藏备用；
(9)研磨：将糙米发酵基料加热至78℃，用胶体磨研磨1次；
(10)调配均质：将糙米发酵基料用净水调整可溶性固形物含量为10％，pH值为4.2，再用高压均质机均质(60MPa)1次；
(11)灌装杀菌：热灌装，沸水浴灭菌30min。
实施例5
一种糙米乳功能性饮料的二级发酵全效加工方法，包括以下步骤：
(1)发芽：将糙米洗净后，加入60℃净水和植酸酶进行发芽，植酸酶用量为10000U/kg，密封保温浸泡，浸米程度以米粒保持完整、可指掐成粉状、无粒心为宜；
(2)蒸米：沥干水分，将发芽糙米置于121℃高压锅中蒸煮60min，得到熟糙米，米饭的糊化程度观察饭心，不得有白心存在；
(3)液化糖化发酵剂活化：将液化糖化发酵剂用其10倍质量的55℃的温水搅拌均匀，活化20min；
所述液化糖化发酵剂为地衣芽孢杆菌BTJQ的扩培液；
(4)接种：将熟糙米按重量比1:1加入净水，同时加入熟糙米重量10％的液化糖化发酵剂，快速搅拌均匀，搅拌全程应保持熟糙米中心温度为60℃；
(5)一级发酵：将接种后的糙米置于560℃发酵8h，直至糙米出现明显液化，测得可溶性固形物达32％，且pH值为5.2，成为一级发酵浆液；
(6)冷却：将一级发酵浆液在洁净环境中冷却至30℃，备用；
(7)二级发酵：二级发酵采用由植物乳杆菌RPC22∶酿酒酵母JJ4＝1∶1组成的复合发酵剂，各菌种分别扩培2次，使菌体生物量达108CFU/mL以上，经6000r/10min 离心取菌泥，用无菌水洗脱，按原体积复原，按一级发酵浆液重量的10％接种，置于 35℃环境发酵5h，控制发酵终点pH值4.8；
(8)灭活：二级发酵后的糙米用水浴杀菌，保持中心温度100℃维持10-30min，注意应边加热边搅拌，冷却后成为糙米发酵基料，冷藏备用；
(9)研磨：将糙米发酵基料加热至83℃，用胶体磨研磨1次；
(10)调配均质：将糙米发酵基料用净水调整可溶性固形物含量为12.5％，pH值为4.6，再用高压均质机均质(60MPa)5次；
(11)灌装杀菌：热灌装，沸水浴灭菌30min。
实施例6
一种糙米乳功能性饮料的二级发酵全效加工方法，包括以下步骤：
(1)发芽：将糙米洗净后，加入55℃净水和植酸酶进行发芽，植酸酶用量为 5000U/kg，密封保温浸泡10h，浸米程度以米粒保持完整、可指掐成粉状、无粒心为宜；
(2)蒸米：沥干水分，将发芽糙米置于121℃高压锅中蒸煮45min，得到熟糙米，米饭的糊化程度观察饭心，不得有白心存在；
(3)液化糖化发酵剂活化：将液化糖化发酵剂用其6倍质量的50℃的温水搅拌均匀，活化60min；
所述液化糖化发酵剂为地衣芽孢杆菌BTJQ4或其扩培液；
(4)接种：将熟糙米按重量比1:1加入净水，同时加入熟糙米重量7.5％的液化糖化发酵剂，快速搅拌均匀，搅拌全程应保持熟糙米中心温度为55℃；
(5)一级发酵：将接种后的糙米置于55℃发酵13h，直至糙米出现明显液化，测得其可溶性固形物达31.6％，pH值为5.25，得到一级发酵浆液；
(6)冷却：将一级发酵浆液液在洁净环境中冷却至28℃，备用；
(7)二级发酵：二级发酵采用由植物乳杆菌RPC22∶酿酒酵母JJ4：副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38＝1∶1∶1组成的复合发酵剂，各菌种分别扩培2次，使菌体生物量达108CFU/mL以上，经5500r/10min离心取菌泥，用无菌水洗脱，按原体积复原，按一级发酵浆液重量的5％接种，置于30℃环境发酵10h，控制发酵终点pH值4.5；
(8)灭活：二级发酵后的糙米用水浴杀菌，保持中心温度100℃维持20min，注意应边加热边搅拌，冷却后成为糙米发酵基料，冷藏备用；
(9)研磨：将糙米发酵基料加热至80℃，用胶体磨研磨3次；
(10)调配均质：将糙米发酵基料用净水调整可溶性固形物含量为15％，pH值为4.5，再用高压均质机均质(60MPa)3次；
(11)灌装杀菌：热灌装，沸水浴灭菌30min。
对比例1
以相同糙米物料配比进行无发酵处理的加工方法为对照组(其它步骤同实施例6)，制备糙米饮料。
测定实施例6和对比例1所得糙米饮料的主要营养成分，比较不同加工方法对糙米乳饮料主要营养成分的影响。
检测方法
1氨基酸：GB 5009.124-2016食品安全国家标准食品中氨基酸的测定
2蛋白质：GB 5009.5-2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定
3γ-氨基丁酸：DB35/T 1326-2013植物类农产品中γ-氨基丁酸的测定
4维生素B1:GB 5009.84-2016食品安全国家标准食品中维生素B1的测定
5维生素B2:GB 5009.85-2016食品安全国家标准食品中维生素B2的测定
6维生素B6:GB 5009.154-2016食品安全国家标准食品中维生素B6的测定
实施例6和对比例1所制备的两种饮料主要营养成分对比结果见表2和表3。试验结果表明，实施例6采用的二级发酵全效加工方法获得的游离氨基酸、总氨基酸、蛋白质、γ-氨基丁酸等含量均高于对照组，这可能与液化糖化一级发酵及产酸增香二级发酵所使用的菌种有关，二级发酵破坏了糙米原有紧实的淀粉-蛋白结构，淀粉被降解破坏，不溶性蛋白质被暴露并被相关酶降解成小分子蛋白或氨基酸成分，因此提高了蛋白质含量。相关文献报道表明，发酵过程的氨基酸及γ-氨基丁酸等活性营养成分增加，可能是芽孢杆菌属、酵母菌属、乳杆菌属等菌种的直接代谢活动生成，或者蛋白酶活性累积进而水解蛋白质生成谷氨酸等多种游离氨基酸，其中的谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。
表2二级发酵全效加工方法对氨基酸成分的影响(mg/100mL)
主要氨基酸 二级发酵全效加工 对照组
天门冬氨酸 139.25 109.25
苏氨酸 53.94 43.04
丝氨酸 85.14 60.14
谷氨酸 227.20 187.28
甘氨酸 58.48 45.41
丙氨酸 68.53 62.33
胱氨酸 36.03 26.13
缬草氨酸 71.09 41.41
蛋氨酸 30.57 20.61
异亮氨酸 51.96 42.94
亮氨酸 105.89 75.87
酪氨酸 58.38 47.38
苯丙氨酸 81.08 51.80
赖氨酸 49.94 40.91
组氨酸 57.25 25.23
精氨酸 76.29 77.29
脯氨酸 74.40 58.40
合计 1325.42 1015.42
表3二级发酵全效加工方法对其他主要营养成分的影响
主要营养成分 二级发酵全效加工 对照组
VB2(mg/100mL) <0.02 <0.02
VB1(mg/100mL) 0.08 0.07
维生素B6(mg/100mL) 0.06 0.06
蛋白质(mg/100mL) 1.34 1.10
γ-氨基丁酸(mg/L) 211.5 158.5

Claims (8)

1.一种糙米乳功能性饮料的二级发酵全效加工方法，其特征在于：其包括以下步骤：
（1）发芽：将糙米洗净后，加入水和植酸酶进行发芽，植酸酶用量为1000-10000U/kg，密封保温浸泡；
（2）蒸米：沥干水分，将发芽糙米置于高压锅中蒸煮得到熟糙米；
（3）液化糖化发酵剂活化：将液化糖化发酵剂用其2-10倍质量的45-55℃的温水搅拌均匀，活化20-100min；
（4）接种：将熟糙米按重量比1:1加入净水，同时加入熟糙米重量5-10%的活化后的液化糖化发酵剂，快速搅拌均匀；
（5）一级发酵：将接种后的糙米置于50-60℃发酵8-18h，直至糙米出现明显液化，其可溶性固形物达30%以上，且pH值不低于5.2，成为一级发酵浆液；
（6）冷却：将一级发酵浆液在洁净环境中冷却至25-35℃，备用；
（7）二级发酵：二级发酵采用乳酸菌和酵母菌组成的复合发酵剂，各菌种分别经扩培使菌体生物量达108 CFU/mL以上，经离心取菌泥，用无菌水洗脱，按原体积复原，按一级发酵浆液重量的1-10%接种，置于20-35℃环境发酵5-25h，控制发酵终点pH值4.0-4.8；
（8）灭活：二级发酵后的糙米用水浴杀菌，杀菌后冷却成为糙米发酵基料；
（9）研磨：将糙米发酵基料加热至78-83℃，用胶体磨研磨1-5次；
（10）调配均质：将糙米发酵基料用水调整可溶性固形物含量为10-15%，pH值为4.2-4.6，再用高压均质机均质1-5次；
（11）灌装杀菌：灌装、杀菌后得到所述糙米乳饮料。
2.根据权利要求1所述的糙米乳功能性饮料的二级发酵全效加工方法，其特征在于：步骤（1）所述水的温度为50-60℃，浸泡时间为4-15h。
3.根据权利要求1所述的糙米乳功能性饮料及其二级发酵全效加工方法，其特征在于：步骤（3）所述液化糖化发酵剂为耐受高温的发酵剂且具有高液化糖化能力的发酵剂。
4.根据权利要求3所述的糙米乳功能性饮料的二级发酵全效加工方法，其特征在于：步骤（3）所述液化糖化发酵剂为地衣芽孢杆菌BTJQ4或其扩培液，已于2020年12月11日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020892。
5.根据权利要求1所述的糙米乳功能性饮料的二级发酵全效加工方法，其特征在于：步骤（4）所述搅拌全程保持熟糙米中心温度为50-60℃。
6.根据权利要求1所述的糙米乳功能性饮料的二级发酵全效加工方法，其特征在于：步骤（7）所述复合发酵剂由植物乳杆菌RPC22、酿酒酵母JJ4组成；
其中，植物乳杆菌RPC22于2019年4月26日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019297。
7.根据权利要求6所述的糙米乳功能性饮料的二级发酵全效加工方法，其特征在于：所述复合发酵剂由植物乳杆菌RPC22∶酿酒酵母JJ4=1∶1组成。
8.根据权利要求1-7任一项所述的加工方法得到的糙米乳功能性饮料。
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