CN112592982B - 基于snp分子标记鉴定马苏金枪鱼的引物、方法和试剂盒 - Google Patents

基于snp分子标记鉴定马苏金枪鱼的引物、方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的成套引物，其包括基于马苏金枪鱼的物种特异性SNP分子标记而设计的一对PCR扩增引物和一条探针。该SNP分子标记包括位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C碱基，一对PCR扩增引物中上游引物的序列是或包含5’‑CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT‑3’，下游引物的序列是或包含5’‑GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT‑3’，探针是序列为5’‑TTTCATTCTGCCACTGTG‑3’的普通探针或者序列为5’‑cattctg(C)ca‑3’的循环探针，探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

Description

基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的引物、方法和试剂盒
技术领域
本发明属于水产品物种鉴别、检测的技术领域，具体涉及基于物种特异性的SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的引物、方法和试剂盒。
背景技术
金枪鱼具有很高的的经济价值，是世界上高档的水产品之一。在国内金枪鱼的主要销售形式为生鱼片、寿司和罐头，金枪鱼及制品的销售量从几吨上升到了几万吨，高档金枪鱼甚至占市场份额的60％以上。不同品种金枪鱼价格差异很大，加之其体型较大，多采用去头去皮后分割销售的方式，使得一般消费者很难区分这种缺失了典型外形特征的产品，导致金枪鱼市场上标签错乱和以次充好的问题尤为严重。
马苏金枪鱼被世界自然保护联盟红色名录列为极度濒危等级，虽然已经开始进行人工养殖，但其自然群体资源已处于过度捕捞状态。马苏金枪鱼是一个重要的商业物种，该物种在生鱼片市场非常珍贵，寿司店常用高品质的含脂肪的该种鱼作高档寿司。
鲜活的马苏金枪鱼具有鲜明和完整的外部形态学特征，可采用形态学鉴定方法进行鉴别，但是针对生鱼片或者经深加工工艺处理过的鱼类产品如罐头等，原本的形态学特征和蛋白质伴随加工过程的进行而逐渐流失或变性，由于缺乏外部形态学特征，不易鉴定其真伪，不法商家以次充好，甚至通过染色的方式，以低价值的其他金枪鱼生鱼片冒充高价值的马苏金枪鱼，获取暴利，扰乱了市场秩序，破坏了商业诚信，损害了消费者利益，马苏金枪鱼鉴别方法成为金枪鱼行业的迫切需求。另一方面，国际组织开展非法捕捞的打击活动、濒危物种的保护活动，也需要快速、准确鉴别马苏金枪鱼物种。因此，快速、准确地鉴定马苏金枪鱼及其制品的试剂和方法已成为国内外研究的热点。
发明内容
本发明的目的一方面在于提供基于SNP分子标记用于鉴定马苏金枪鱼的成套引物，所述成套引物包括基于所述SNP分子标记而设计的一对PCR扩增引物和一条探针。
优选地，所述SNP分子标记包括位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C碱基。
优选地，所述一对扩增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述探针的序列是5’-TTTCATTCTGCCACTGTG-3’，5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB(Minor Groove Binder，小沟结合物)。
优选地，所述一对扩增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述探针是循环探针，其序列是5’-cattctg(C)ca)-3’，5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团Eclipse。
另一方面，本发明还提供一种基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的方法，所述SNP分子标记包括位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C碱基，所述方法包括以下步骤：(I)基于所述SNP分子标记设计一对PCR扩增引物和一条探针；(II)从待鉴定对象的肌肉组织中提取DNA；(III)利用所述一对PCR扩增引物和所述探针，以步骤(II)中所提取的DNA为模板进行实时荧光PCR反应。
优选地，所述一对PCR扩增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述探针的序列是5’-TTTCATTCTGCCACTGTG-3’，5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。在步骤(III)中，利用所述一对PCR扩增引物和所述探针进行实时荧光PCR反应。
优选地，所述成套引物包括一对PCR扩增引物和一条循环探针，所述一对PCR扩增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述循环探针的序列是5’-cattctg(C)ca-3’，5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团Eclipse。在步骤(III)中，利用所述一对PCR扩增引物和所述循环探针进行实时荧光PCR反应。
另一方面，本发明还提供用于鉴定马苏金枪鱼的试剂盒，其包含基于SNP分子标记而设计的成套引物，所述SNP分子标记包括位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C。
优选地，所述成套引物包括一对PCR扩增引物和一条探针，所述一对PCR扩增引物中上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述探针的序列是5’-TTTCATTCTGCCACTGTG-3’，5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。
优选地，所述成套引物包括一对PCR扩增引物和一条循环探针，所述一对PCR扩增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物是或包含序列5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述循环探针是5’-cattctg(C)ca-3’，5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团Eclipse。
优选地，所述试剂盒还包括作为阳性质控品的马苏金枪鱼肌肉组织冻干粉或基因组DNA、作为阴性质控品的草鱼肌肉组织冻干粉或基因组DNA、实时荧光PCR反应所需的其他试剂。
附图说明
图1是示出本发明实施例1中利用基于SNP位点设计的成套引物，以马苏金枪鱼基因组DNA为模板进行实时荧光PCR反应时的结果图。
图2是实施例2中对利用实施例1的实时荧光PCR法检测时的灵敏度进行分析的结果图，图中标注为10、0.1、0.01和0.001的曲线分别是模板DNA浓度为10ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL和0.001ng/μL时的扩增曲线。
图3是示出实施例3中利用基于SNP位点设计的成套引物，以马苏金枪鱼基因组DNA为模板进行实时荧光PCR反应时的结果图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中利用2b-RAD的测序分析结果，针对马苏金枪鱼(Thunnusmaccoyii)，以蓝鳍金枪鱼(Thunnusthynnus)、黄鳍金枪鱼(Thunnusalbacares)、大目金枪鱼(Thunnusobesus)和长鳍金枪鱼(Thunnusalalunga)等金枪鱼为参照，筛选马苏金枪鱼物种特异性的SNP位点。
将初步筛选到的SNP位点按照品种特异标记界定标准进行二次筛选：(1)同一位点在不同物种中有且只有2种分型结果；(2)马苏金枪鱼分型结果与其他物种不相同，且其他物种之间全部相同，目的是筛选出马苏金枪鱼与其余四种金枪鱼在该位点碱基上的差异，例如马苏金枪鱼在某SNP位点的碱基为C，其余四种金枪鱼在该SNP位点的碱基都为A，则符合筛选要求。这个过程中筛选获得596个马苏金枪鱼物种特异性的SNP位点。
再根据如下筛选原则对上述596个SNP位点进行第三次筛选：(1)每条染色体基因只有一个SNP位点，即每一条染色体只对应1条包含SNP位点的短序列；(2)剔除没有对应染色体的基因，目的是确保所筛选的SNP位点在参考序列中有据可查，确保科学性与准确性。
对以上筛选出的SNP位点进行验证实验。针对每个SNP位点设计引物和实验条件，进行PCR扩增后测序验证，除去测序结果有底峰、无法判读、非纯和、双峰、缺失或引物设计困难等情况，从中筛选与2b-RAD测序结果完全一致的SNP位点。
接下来，针对上述筛选出的与2b-RAD测序结果完全一致的SNP位点，利用上述设计的引物和实验条件，以蓝鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大目金枪鱼和长鳍金枪鱼的DNA为模板进行PCR反应并测序验证，最终确定18个SNP位点在马苏金枪鱼与蓝鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大目金枪鱼、长鳍金枪鱼之间存在差异。
针对上述所确定的马苏金枪鱼的SNP位点以及它们上下游的序列分别设计引物并优化实验条件，以马苏金枪鱼和其他四种金枪鱼的DNA为模板进行实时荧光PCR反应。最终确定针对其中一个特异性SNP位点设计的引物、方法和/或试剂盒能够准确地将马苏金枪鱼与其他四种金枪鱼区分开。
该马苏金枪鱼物种特异性SNP位点是位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C碱基。
本发明基于该SNP位点及其上下游序列设计了成套引物，其中包括一对PCR扩增引物和一条探针。该一对PCR扩增引物中的上游引物的序列优选是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列优选是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’。探针可以是普通探针，也可以是循环探针(Cyclingprobe)。当该探针是普通探针时，其序列优选为5’-TTTCATTCTGCCACTGTG-3’，5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。当该探针是循环探针时，其序列优选为5’-cattctg(C)ca-3’，其中序列中的小写英文字母代表DNA碱基，括号标注的大写英文字母代表RNA碱基，且5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团Eclipse。
基于上述成套引物，本发明还提供用于鉴定马苏金枪鱼的方法，主要包括以下步骤：按照常规技术从待鉴定对象的肌肉组织中提取DNA；利用上述一对扩增引物和探针，以前述所提取的DNA为模板进行实时荧光PCR反应；结果判定。
基于上述成套引物，本发明还提供用于鉴定马苏金枪鱼的试剂盒，其包括上述成套引物，以及进行实时荧光PCR反应所需的其他试剂。其中，成套引物可以是干粉状态的引物或者溶解于去离子水中的引物。其他试剂包括但不限于：阳性质控品、阴性质控品、ddH2O、PCR反应试剂和/或DNA提取试剂等。PCR反应试剂包括但不限于DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2溶液(25mmol/L)等。dNTPs中含有dATP、dTTP、dGTP、dCTP，各种dNTP的浓度优选为2.5mmol/L。阳性质控品优选为马苏金枪鱼的肌肉组织冻干粉或基因组DNA，阴性质控品优选为草鱼的肌肉组织冻干粉或基因组DNA。
实施例1：利用普通探针进行的实时荧光PCR反应
以蓝鳍金枪鱼、马苏金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大目金枪鱼和长鳍金枪鱼5种金枪鱼作为待检样品。
从各待检样品中分别取肌肉组织100mg，剪碎，放入l.5mL离心管中，加入300μL组织裂解液(含有10mMTris-HCl、0.1M EDTA和0.5％SDS，pH8.0)和20μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀，置于55℃水浴锅消化至混合物变澄清。往消化液中加入300μLTris-饱和酚和300μL氯仿，充分混合10min，12000rpm离心10min。将上清转移至新的离心管中，加入600μL氯仿进行抽提，充分混合10min，12000rpm离心10min。将上清转移至新的离心管中，加入1000μL冰乙醇沉淀DNA，12000rpm离心3min，弃去上清液。用70％乙醇清洗沉淀两次，室温下干燥，最后加入100μL去离子水溶解DNA。
利用由具有上文所述序列的一对PCR扩增引物以及普通探针组成的成套引物，以上述提取的DNA为模板，使用Premix Ex Taq(2×)(宝生物工程(大连)有限公司)和LightCycler 480IIp实时荧光PCR仪(瑞士Hoffmann-La Roche公司)，进行实时荧光PCR反应。其中，成套引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应体系如下：
Figure BDA0002815112900000061
反应条件：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，，收集荧光信号，循环反应40次。
反应结果如图1所示，从图中可以看出，以马苏金枪鱼DNA为模板的反应体系出现了明显的荧光信号和典型的扩增曲线，且Ct值明显小于35.0，获得典型的阳性结果。而在相同的反应体系、反应条件以及反应程序下，以蓝鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大目金枪鱼和长鳍金枪鱼的DNA为模板进行实时荧光PCR反应均无荧光信号与扩增曲线，呈典型的阴性反应。
说明通过该实时荧光PCR反应能够准确地区分出马苏金枪鱼，因而所涉及的成套引物和方法能用于对马苏金枪鱼进行物种鉴定。
实施例2：实施例1的实时荧光PCR法的灵敏度分析
本实施例对实施例1的实时荧光PCR法鉴定马苏金枪鱼时的灵敏度进行了分析。具体过程如下。
用微量核酸/蛋白浓度分析仪测定提取的马苏金枪鱼DNA模板浓度后，先用去离子水调整DNA模板浓度至10ng/μL，然后用去离子水稀释成为0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL，将上述不同浓度的DNA作为模板，按照实施例1的方法和反应体系，分别进行实时荧光PCR反应。每个浓度设置2个平行，以检测实施例1的方法的灵敏度。
结果如图2所示，结果表明，模板浓度在10ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL时，均出现了明显的荧光信号与典型的扩增曲线，且Ct值均明显小于35.0，均获得典型的阳性结果。模板浓度在0.0001ng/μL时，有微弱的荧光信号与不典型的扩增曲线，属于弱阳性或疑似阳性结果。重复试验的结果与上述结果一致。根据以上实验结果可确定，实施例1的方法的灵敏度至少可达0.001ng/μL。
实施例3：利用循环探针进行的实时荧光PCR反应
利用由具有上文所述序列的一对PCR扩增引物以及循环探针组成的成套引物，以实施例1中提取的DNA为模板，使用CycleavePCRTMReaction Mix(宝生物工程(大连)有限公司)和Light Cycler 480IIp实时荧光PCR仪(瑞士Hoffmann-La Roche公司)，进行实时荧光PCR反应。其中，成套引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。反应体系如下：
Figure BDA0002815112900000071
反应程序为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，55℃退火10秒，72℃延伸20秒，收集荧光信号，循环反应40次。
结果如图3所示，从图中可以看出，通过该实时荧光PCR反应能够准确地区分出马苏金枪鱼，而在相同的反应体系、反应条件以及反应程序下，以蓝鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大目金枪鱼和长鳍金枪鱼的DNA为模板进行实时荧光PCR反应均无扩增信号。因而所涉及的成套引物和方法能用于对马苏金枪鱼进行物种鉴定。
以上通过实施例对本发明的具体实施方式进行了详细的说明，但本发明的保护范围并不受限于此。在实现本发明目的的前提下，本领域技术人员能对本发明的技术方案做出各种改变和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的引物、方法和试剂盒
<130> HHS2020-3
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 581
<212> DNA
<213> 马苏金枪鱼（Thunnus maccoyii）
<400> 1
acattccatc cctttataga ggacaaagtt tttctaactc tgaacaatca ttcagtgact 60
catcacatcc cacatgaagt aactctatac gttctaaaat tacttcaatc attttattca 120
tcagtgccaa gttgaattct tgcaagtgca taaataaaca caatagacct ttcctgtatc 180
ttaatcagta tttgccacaa cctctgagtc tgaacctcag acattttaaa acaaacagtg 240
aagttttcat tctgccactg tgtctccaaa agggaaaaaa taatttgttg tttactatca 300
gcctttgcag cagtttggaa aaacagtctc gtttttcaca cttgtgctca tatttatgaa 360
cttattcaat cagggtttgg actgactttc atacactcca tgtaaaggtt tgcataaacc 420
ttcagttcaa ggggaattta gaaaaaaaat gttaattttt caatcacgcc catgcatttt 480
tggttcataa aacatcacac ataaacacat aaatgaccat gcagacatcc aacacaagca 540
caatttccaa aaaaacagac tcattttctc attgagcagc a 581

Claims (6)

1.一种基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的成套引物，其特征在于：
所述成套引物包括基于所述马苏金枪鱼的物种特异性SNP分子标记而设计的一对PCR扩增引物和一条探针，
所述SNP分子标记包括位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C碱基，
所述一对扩增引物中的上游引物的序列是5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，
所述探针的序列是5’-TTTCATTCTGCCACTGTG-3’，所述探针的5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。
2.一种基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的成套引物，其特征在于：
所述成套引物包括基于所述马苏金枪鱼的物种特异性SNP分子标记而设计的一对PCR扩增引物和一条探针，
所述SNP分子标记包括位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C碱基，
所述一对PCR扩增引物中的上游引物的序列是5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，
所述探针是循环探针，其序列是5’-cattctg(C)ca-3’，所述循环探针的5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团Eclipse，其中所述探针序列中的小写英文字母代表DNA碱基，括号标注的大写英文字母代表RNA碱基。
3.一种基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的方法，其特征在于：
所述SNP分子标记包括位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C碱基，
所述方法包括以下步骤：
(I)基于所述SNP分子标记设计一对PCR扩增引物和一条探针；
(II)从待鉴定对象的肌肉组织中提取DNA；
(III)利用所述一对PCR扩增引物和所述探针，以步骤(II)中所提取的DNA为模板进行实时荧光PCR反应，其中，所述一对PCR扩增引物中的上游引物的序列是5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述探针的序列是5’-TTTCATTCTGCCACTGTG-3’，所述探针的5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB，
在步骤(III)中，利用所述一对PCR扩增引物和所述探针进行实时荧光PCR反应。
4.一种基于SNP分子标记鉴定马苏金枪鱼的方法，其特征在于：
所述SNP分子标记包括位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C碱基，
所述方法包括以下步骤：
(I)基于所述SNP分子标记设计一对PCR扩增引物和一条探针；
(II)从待鉴定对象的肌肉组织中提取DNA；
(III)利用所述一对PCR扩增引物和所述探针，以步骤(II)中所提取的DNA为模板进行实时荧光PCR反应，
所述一对PCR扩增引物中的上游引物的序列是5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述探针是循环探针，其序列为5’-cattctg(C)ca-3’，5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团Eclipse，其中所述探针序列中的小写英文字母代表DNA碱基，括号标注的大写英文字母代表RNA碱基，
在步骤(III)中，利用所述一对PCR扩增引物和所述循环探针进行实时荧光PCR反应。
5.一种用于鉴定马苏金枪鱼的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含基于SNP分子标记而设计的成套引物，所述SNP分子标记包括位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C碱基，
其中，所述成套引物包括一对PCR扩增引物和一条探针，
所述一对PCR扩增引物中的上游引物的序列是5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，
所述探针的序列是5’-TTTCATTCTGCCACTGTG-3’，所述探针的5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。
6.一种用于鉴定马苏金枪鱼的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含基于SNP分子标记而设计的成套引物，所述SNP分子标记包括位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C碱基，
所述成套引物包括一对PCR扩增引物和一条循环探针，
所述一对扩增引物中的上游引物的序列是5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，
所述循环探针的序列是5’-cattctg(C)ca-3’，所述循环探针的5’端标记有荧光报告基团6-FAM，3’端标记有荧光淬灭基团Eclipse，其中所述探针序列中的小写英文字母代表DNA碱基，括号标注的大写英文字母代表RNA碱基。
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