CN1124456A - 淋球菌抗个体基因型抗体及其使用方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)的抗个体基因型抗体。本发明还涉及使用该抗个体基因型抗体的方法和组合物，用于预防、治疗和诊断淋病感染。
Description
本发明涉及抗淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的抗个体基因型抗体。本发明还涉及使用这种抗个体基因型抗体的方法和组合物、用于预防、治疗和诊断淋病感染。
性传染病(淋病)作为一种最普遍报道的传染病形成了世界范围的危害。淋病由细胞淋病奈瑟氏球菌(一种革兰氏阴性双球菌)引起。尽管病原体首先感染粘膜，但它能侵入组织并躲避宿放防御。淋病奈瑟氏球菌是一系列后遗症的病原体。这些后遗症范围包括在男人和妇女中从无症状的粘膜感染到明显的疾病综合症。例如，这些综合症中较严重的包括在男人和妇女中传播淋球菌感染，以及妇女输卵管炎或骨盆发炎疾病(PID)，输卵管炎或PID本身可能导致长期的后遗症，包括子宫外孕和不育。其它重要的后遗症(有时需要外科治疗)包括再发性感染，慢性腰痛，交媾困难，骨盆粘连和其它发炎后遗症。
在美国，估计1984年用于治疗PID和有关子宫外孕和不育的直接和间接花费为2.6个十亿美元(65)。1990年总的直接花费估计是2.18个十亿美元，间接花费为1.54个十亿美元。假定通货膨胀率和PID的发病率不变，到2000年该疾病预计的总花费将达到8个十亿美元(6)。
尽管在美国控制淋球菌感染所做出的公共卫生努力和有效抗生素治疗的可获得性，疾病控制中心(CDC)每年报道的淋病病例大约为一百万(9)。所有淋病病例中大部分发生在无症状的感染个体中，他们是群体中最新病例的来源(4)。抗生素抗性菌株流行的增加使感染的治疗复杂化(7，8，64)。
淋病瑟氏球菌有多种毒性因子。该病原体表面成份在附着和侵入宿主细胞中发挥着重要作用，也为宿主免疫应答提供了有效靶。淋球菌感染引起对作为细菌表面暴露抗原的一些成份产生局部和全身的体液和细胞免疫应答，尤其是对菌毛，Porin(Por)或蛋白质I(PI)，浊度相关性蛋白质Opas)或蛋白质IIs，Rmp或蛋白质III，和脂寡糖(LOS3)(5)。菌毛，Opa，Por和LOS都涉及附着和侵入宿主并在其表面暴露区都表现出重要的变化(33，56，57)。淋球菌表面成份的菌株内和菌株间变化导致有假说认为在不同的位点有组织特异性并且该生物体具有再感染和持续致病性的潜力。
在有症状和无症状的病人中，淋球菌感染显示出刺激抗淋球菌血清免疫球蛋白的水平增加。外周体液应答占优势的是IgG(主要是IgG3亚类)，IgM和IgA的量较少(11)。在数量上，抗体反应首先发生在抗菌毛，Opa蛋白质和LOS。局部抗体存在于生殖分泌物中，但量减少(59)，并且可能抗与在血清中相比不同的抗原靶(34)。存在于分泌物中占优势的抗体类型也是IgG(主要是IgG3)而不是分泌IgA(sIgA)(5)。抗LOS的抗体也存在，但与抗菌毛，Por和Opa的抗体相比量较少。尽管感染淋病奈瑟氏球菌的病人可能表现出对许多淋球菌抗原的抗体反应，但从传播感染(DGI)的病人中分离出的淋病瑟氏球菌对正常人血清(NHS)和大多数恢复期血清的杀菌作用具有抗性(46)。这种血清抗性表型(称作稳定血清抗性(SR))使该生物体能躲避局部防御，穿透粘膜屏障并经血流传播。
经过传代培养，许多淋球菌菌株变得在表型上对由NHS引起的杀伤敏感或血清敏感性(46)。这些生物体称为血清敏感型(SS)(或不稳定血清抗性[SR])。该生物体通常从带有严重局部炎症症状或有PID临床迹象的妇女中分离出。急性输卵管炎与PID(由SS淋球菌引起)在病理学上相似，它很少发展成败血症或DGI。这表明由SS淋球菌引起的剧烈的局部炎症反应可用于控制感染和防止败血症，尽管需要付出损伤局部组织的代价。SS淋球菌与SR淋球菌相比引起产生的来自于趋化肽的补体(C5a)的量明显更大(12)。这可能对由SS淋球菌引发的多形核白细胞(PMN)介导的炎症反应负责。
淋病奈瑟氏球菌抗生素抗性菌株的发展，使得对这种感染的控制越来越困难。治疗中的淋球菌感染的效果加速了对抗淋球菌疫苗的需要。预防淋球菌感染，尤其是PID的严重并发症成了许多研究者的目标。然而，不断发展中的产生有效抗淋球菌疫苗的尝试面临着一些困难。
由于其抗原的变异性，使用病原体的单个表面成份作为常规疫苗靶的尝试尚未成功。菌毛疫苗仅对同源菌株(用于生产菌毛疫苗)的感染具有保护性，且即使在人类实验攻击中，Por接种尚未成功。而且，淋病奈瑟氏球菌表现出显著的表型多相性，典型地以103个生物体中＞1的频率从一种抗原形式变化成另一种抗原形式(60，61)，使得该生物体的表面对大多数疫苗方案产生一种移动靶。尽管侯选疫苗激发抗体反应，但产生的抗体和免疫应答不具备广泛的保护性。
LOS是一种重要的淋病奈瑟氏球菌致病决定簇。相当多的证据支持LOS充当抗淋病奈瑟氏球菌表面之杀菌抗体的主要靶(1，12，17，43，58)。抗LOS抗体有一些重要功能：杀菌活性，通过典型的或选择性补体途径进行补体激活(1)，和调理活性(12)。而且，LOS显示出是诱导抗同源和异源淋球菌之功能性抗体反应的最有效的淋球菌抗原(63)。
单克隆抗体(mAb)2C7(36)检查LOS衍生的寡糖(OS)抗原决定基显示出广泛的保守性和在淋球菌临床分离物中表达。典型地，糖类是T细胞依赖性抗原。当作为免疫单独用药时，它们一般仅引发初级抗体反应。而且寡糖较小(＜10个糖单位)(20)，很可能需要增加生化衍生作用才能引起其免疫原性。因此，这种寡糖用作侯选疫苗受到一些方面的局限。
已有建议将分子内构象决定簇用于疫苗(42)。通过mAb技术，可生产出抗病原体上感兴趣的抗原决定簇之保护性抗体(Ab1)。可纯化这种特定的抗体(Ab1)并随后用作诱导抗个体基因型抗体(Ab2)的免疫原，Ab2可能是病原体原始抗原决定基的一种分子内构象。
根据Jerne“网状”理论的预测(24)，用抗个体基因型抗体(Ab2)进行抗第一抗体(Ab1)之抗原结合位点的免疫可能诱导对名义上的抗原之特异性的体液免疫反应。所得的抗—抗个体基因型抗体(或Ab3)应与原始第一抗原发生反应。如果第一抗原是寡糖(且因此预期产生不依赖于T细胞的免疫应答)，则用Ab2(相当于蛋白质)进行的免疫可能诱导T细胞依赖性应答。
在动物系统中使用抗个体基因型抗体成功地提高了抗各种病原体的保护性抗体(28，29，40，51，52，53，66)。抗个体基因型抗体不包含名义上的抗原(如糖抗原的例子)，因而避免了与将该抗原用作免疫原相关的不必要的有害影响。抗个体基因型抗体是蛋白质抗体，它们通常(但并不总是)充当T细胞依赖性免疫原(30)。
为防止淋球菌输卵管炎(可能与虚弱和慢性腰痛，不育和子宫外孕相联系的一种感染[50])。存在对用于预防或治疗淋病之药剂的需要。另一个重要的目的是防止该生物体从被感染但无症状的宿主传染给其他免疫的性伙伴。其重要性在于男人和妇女所有淋病病例中。极大的一部分是无症状的，而且被感染后无症状的，性活跃的人很可能是大多数新感染的主要传染源。因此，仅能减轻有症状的淋病之严重性的淋球菌疫苗可能导致无症状/有症状病例的比率更高，其结果是该疫菌可能促进淋病的传播、除非它也能阻止其传染(49)。
本发明经提供抗个体基因型抗体及其片段普遍解决了上面提到的问题，该抗体及其片段的抗原结合位点与识别在人血液抗原组中并不存在的淋病奈瑟氏球菌寡糖抗原决定基之抗体发生免疫特异性结合。还提供了产生根据本发明的抗个体基因型抗体及其片段的细胞以及经培养这些细胞生产该抗体和片段的方法。
根据本发明，抗个体基因型抗体及其片段在预防、治疗和检查淋病奈瑟氏球菌感染的方法和组合物中有用。
图1描绘了用各种剂量的纯化mAb CA1(Ab2)经腹膜内免疫后的同源小鼠中IgG抗LOS抗体(Ab3)水平。图中箭头表示免疫时间。
图2比较了用mAb1(Ab2)与用mAb CA1，LOS和PBS作为对照mAb的相同等模式样品免疫同源小鼠后的IgG抗LOS抗体(Ab3)水平。图中箭头表示加强免疫。
图3描绘了用mAb CA1(Ab2)，对照mAb，PBS和LOS免疫的同源小鼠中的IgM抗LOS抗体(Ab3)水平。图4描绘了用各种剂量的mAb CA1结合KLH经皮下免疫的异源性兔中IgG抗LOS抗体(Ab3)水平。图中箭头表示初次和加强免疫。
图5描绘了接受加强剂量的mAb CA1之异源性兔中IgG抗LOS水平。图中箭头表示初次和加强免疫。符号表示初次和加强免疫的途径。
图6描绘了用mAb CA1，对照mAb，LOS和C—MCP免疫的异源性兔中IgG抗LOS(Ab3)水平的比较结果。
图7描绘了用各种剂量的CA1—KLH，对照mAb，LOS和C—MCP免疫的兔中抗LOS IgM(Ab3)反应的比较结果。
图8描绘了用100μg LOS免疫的兔中IgM抗—LOS反应。图中箭头表示初次和加强免疫。
图9描绘了mAb 2C7对稳定血清抗性(SR)细菌株WG，7IH和一种血清敏感性(SS)菌株24—1(唾液酸结合型和未结合唾液酸型)的杀菌活性。
图10描绘了来自小鼠和兔CA1和LOS免疫后的血清之杀菌活性。
图11描绘了单独用荧光黄或用荧光黄和抗生蛋白链菌素—PE—德克萨斯红染色的细菌株24—1，WG和7IH之相对免疫荧光水平。
图12描绘了以附着到PMNS上的，经荧光黄处理的淋球菌之免疫荧光定量测定的，mAb 2C7抗体对细菌附着到PMN上的附着力之影响。图中结果表示如下：A组：以mAb 2C7调理的24—1；B组：未调理的24—1；C组：以mAb 2C7调理的WG；D组：未调理的WG；E组：以mAb 2C7调理的7IH；F组：未调理的7IH。补体来源如图所示。
图13描绘了用mAb 2C7(Ab1)调理后被PMN吞噬的生物体增加，以SAPETR结合的减少和红色荧光的相应减少来反映。图中结果表示如下：A组：调理过的24—1；B组：未调理过的24—1；C组：调理过的WG；D组：未调理过的WG；E组：调理过的7IH；F组：未调理过的7IH。X轴代表37℃下与PMN培养的时间(分钟)。存在的补体来源如图所示。
图14描绘了由以Ab2(CA1)免疫的异源性兔产生的调理抗体Ab3对血清敏感性(SS)和血清抗性(SR)淋球菌株附着到PMN上的附着力之影响。
图15描绘了用抗体Ab3(由异源性兔产生)调理后PMN吞噬血清敏感性(SS)和血清抗性(SR)淋球菌菌株的增加，由SAPETR结合的减少和相应的红色荧光减少来反映。生物体用mAb CA1(Ab2)免疫前(0—0)或免疫后(△—△)的免血清调理。定义
用于本文的“抗体”是完整的免疫球蛋白分子，包含各两个免疫球蛋白轻链和重链。因此抗体包括IgA，IgG，IgE，IgD，IgM类(及其亚类)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是K型或N型。
用于本文的抗体“片段”是完整免疫球蛋白的一部分，它保留抗原结合特异性，如Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，F(v)片段，含有一个或多个补体决定区(CDR)的片段，重链单体或二聚体，轻链单体或二聚体，由一个重链和一个轻链组成的二聚体、和类似物。
本文所用的“单克隆抗体”是由单克隆的抗体形成细胞最初产生的单一特异性抗体。
本文所用的“重组抗体”是由用编码给定免疫球蛋白分子轻链和重链的DNA转化的细胞产生的抗体。
本文所用的“人类化(humanized)重组抗体”是一种最初来源于非人类的哺乳动物之抗体，其中，使用重组DNA技术用人类免疫球蛋白轻链或重链相应区的氨基酸取代该抗体中一些或全部对抗原结合不需要的氨基酸。
用于本文的“嵌合的重组抗体”是一种最初来自于非人类哺乳动物的抗体，其中使用重组DNA技术用人免疫球蛋白轻链或重链的相应区取代全部或部分重链的铰合区和恒定区和/或轻链的恒定区。
本文所用的“免疫预防上有效的”指在正常个体中诱导足够的免疫应答保护所述病人在一段时间内抵抗淋病奈瑟氏球菌感染的能力。
本文所用的“免疫治疗上有效的”指在治疗的病人中诱导足够的免疫应答以防止一些或全部淋病奈瑟氏球菌感染之影响的能力。
本文所用的“诊断上有效的”指检测在体内或体外抗淋病奈瑟氏球菌寡糖抗原之抗体的能力。
根据本发明的抗个体基因型抗体及其在组合物中的用途和方法
本发明的一个方面涉及抗个体基因型抗体或其片段、它们与抗淋病奈瑟氏球菌寡糖抗原的个体基因型发生反应，该寡糖抗原决定基不存在于人血液抗原组中；还涉及产生所说抗体或片段的细胞。
生产单克隆抗体的技术是本领域的技术人员已知的。简单地说，一种无限细胞系(典型的是鼠骨髓瘤细胞)与用含有给定抗原制品免疫过的哺乳动物淋巴细胞(典型的是脾细胞)融合，从所得的杀交瘤细胞培养物上清液中筛选抗该抗原的抗体(31)。
为生产本发明的抗个体基因型单克隆抗体，可使用与淋病奈瑟氏球菌寡糖抗原反应的任一抗体(Ab1)作为免疫原，或产生所述抗体的杂交瘤细胞。在本发明的例子中，我们使用产生mAb 2C7的杂交瘤作为免疫原(Ab1)以生产抗个体基因型单克隆抗体(Ab2)。我们使用以淋病奈瑟氏球菌外膜免疫的小鼠脾细胞制备产生mAb 2C7的杂交瘤细胞。作为选择，也可使用纯化的淋病奈瑟氏球菌LOS作为免疫原生产Ab1。
生产Ab1的另一种方法是用本发明举例的抗个体基因型抗体作为免疫原以生产抗—抗个体基因型抗体(Ab3)，Ab3在功能上与mAb 2C7相似。于是这些Ab3抗体可用于产生与抗淋病奈瑟氏球菌寡糖抗原但不抗人血抗原组的个体基因型发生反应的抗体。
使用标准程序可完成免疫。单位剂量和免疫方式取决于被免疫的哺乳动物种类，其免疫状态和包括动物体重的因素。典型地，免疫的动物被抽血，使用适当的筛选试验分析每个血液样品血清中的特定抗体。
典型地，无限细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)与淋巴细胞一样来自相同的哺乳动物种类。优选的无限细胞系是对含次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培养基(“HAT培养基”)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。使用聚乙二醇(例如，PEG 3350)使HAT敏感性小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合(35)。然后使用HAT培养基挑选融合所得的杂交瘤细胞，该培养基杀死未融合的和无生产性的融合骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞由于未转化在几天后死亡)。使用检测具有所需特异性的mAb之试验筛选杂交瘤培养物上清液来检测产生所需抗体的杂交瘤。
根据本发明，为生产抗个体基因型抗体，在足以允许杂交瘤细胞分泌单克隆抗体到培养基中的条件下和培养时间内，在营养培养基中培养本文所述的在筛选试验中检查为阳性的杂交瘤细胞。组织培养技术和适于杂交瘤细胞的培养基是公知的。可收集条件杂交瘤培养物上清液并用常规方法选择性地进一步纯化抗体。
作为选择，所需抗体可用给预先注入2，6，10，14—四甲基五癸烷(PRISTANE，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的小鼠腹膜腔注射杂交瘤细胞来生产。杂交瘤细胞在腹膜腔内增生，分泌的抗体以腹水液的形式积累。经过用注射器抽出腹膜腔内的腹水液体来收获抗体。
本发明的重组抗体可用常规重组DNA技术来生产，例如，用含有编码所需抗体免疫球蛋白轻链和重链之DNA的合适表达载体来转化宿主细胞。而且，还可以生产重组嵌合抗体，其中本发明抗体的一些或全部重链铰合和恒定区和/或轻链恒定区被不同种类的免疫球蛋白轻链或重链的相应区域取代，和用CDR移植制备重组的“人类化”抗体，其中该抗体除补体决定区外全部被人类抗体的相应部分取代，减低了该抗体的抗原性(26，62，68)。
另外，本发明还包括本文所述抗体的抗原结合片段，如Fab，Fab’，F(ab)2，和F(v)片段，含有一个或多个补体决定区(CDR)的片段，单链抗体，重链单体或二聚体，轻链单体或二聚体，由一个重链和一个轻链组成的二聚体。该抗体片段可用化学方法来生产，例如，用蛋白酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)裂解完整的抗体；或经重组DNA技术来生产，例如，用截短的重链和/或轻链基因转化的宿主细胞来生产。还设计了产生该片段的合成方法。用还原试剂(如二硫苏糖醇或β—疏基乙醇)处理完整抗体或用编码所需重链或轻链或两者的DNA转化宿主细胞可同样地生产重链和轻链单体。
在本发明的一个实施方案中，与抗淋病奈瑟氏球菌寡糖抗原的个体基因型发生反应的抗个体基因型抗体或其片段可用于给未感染的个体用药，以诱导抗淋球菌生物体或带有所说寡糖抗原之细胞的特异性免疫应答。该免疫应答在防止接触淋球菌生物体之受体应发生的感染时所表现出的特性可能具有免疫预防性。
在另一实施方案中，用本发明的抗体(Ab2)，(Ab3)或片段作为免疫原产生的抗体或片段在免疫治疗学上可用于治疗已被淋病奈瑟氏球菌感染或表现出淋病感染症状的病人。
为用于治疗和预防，本发明的抗个体基因型抗体和抗体片段可配制成药物组合物，该组合物含有免疫治疗上或免疫预防上有效量的，与药物上可接受的载体混合的抗体或抗体片段；其中的有效量指在补体存在时能大量杀死感染的微生物，或调理感染性微生物使其被宿主PMN吞噬而杀死。在单疗程的治疗中或其特征为淋病奈瑟氏球菌感染的疾病预防中、在免疫治疗上或免疫预防上每单位剂量的完整抗体有效量范围从大约0.1到大约10mg/kg病人体重，优选每kg病人体重大约1mg。在一周内单位剂量的用药从每天二次到每天一次。然而，应认识到也可使用更低或更高的剂量和其它用药方式。
本发明优选的药物组合物与用于人类被动免疫的其他抗体药物组合物相似。典型地，本发明的抗体可悬浮于无菌盐水溶液中用于治疗。作为选择，可配成药物组合物从控制活性成份的释放或延长它们在病人系统中的存在。可知大量合适的药物释放系统，例如，包括可植入的药物释放系统，水凝胶，羟甲基纤维素，微囊体，脂质体，微乳状液，微球体和类似物。
本发明的药物组合物可以用任意合适的方式用药，如口服，鼻内，皮下，肌肉内，静脉内，动脉内，或肠胃外。一般来说优选静脉内(i.v.)或肠胃外用药。
对本领域的普通技术人员而言，本发明的抗体或其片段的免疫治疗上有效量或免疫预防上有效量是显而易见的，它依赖于用药方式，所用抗体或片段的单位剂量，抗体或片段是否与其它治疗剂结合用药，病人的免疫状态和体质，所用抗体或抗体片段的治疗活性，和治疗医生的判断。
根据本发明的抗个体基因型抗体或其片段也可被标记并用于筛选方法，诊断方法或在体内或体外检测与淋病奈瑟氏球菌寡糖抗原发生反应的抗体的测定法。例如，这些包括酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，经过将样品与本发明标记的抗个体基因型抗体接触并检测标记物来筛选存在与淋病奈瑟氏球菌寡糖抗原发生反应的抗原之样品。同样地，也可制备抗一抗个体基因型抗体(Ab3)并用于检测临床样品中淋球菌寡糖(OS)抗原的存在。因此，本发明包括诊断试剂盒，它包含带有可检测标记的本发明抗个体基因型抗体或其片段或抗一抗个体基因型抗体或其片段作为一种试剂，还包含使用该试剂检测与淋病奈瑟氏球菌寡糖抗原发生反应的抗体或寡糖抗原本身的完整说明。根据本发明的检测方法可以包含的步骤：在固态支持物上使用抗免疫球蛋白抗体；在固态支持物上使用生物学样品；从固态支持物上去掉多余的生物学样品；在固态支持物上使用根据本发明带有可检测标记的抗体或片段；洗涤固态支持物并分析固态支持物上标记物的存在。
合适的标记物可以是放射性、酶的、荧光的、磁性或化学发光标记。放射标记的抗体可采用已知的方法经偶联放射性同位素(如3H，32P，35S，59Fe，125I)来制备，然后，它们可用P计数器，闪烁计数器或放射自显影来检测。本发明的抗个体基因型抗体和抗—抗个体基因型抗体可适于用酶(如酵母乙醇脱氢酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，和类似物)来标记，显色后用分光光度法或肉眼观察来检测。合适的荧光标记物包括荧光素异硫氰酸酯，荧光胺，若丹明，和类似物。合适的化学发光标记包括氨基苯二酰肼，咪唑，草酸酯，虫荧光素，和类似物。
为更好地理解本发明，陈述了下列实施例。这些实施例仅仅是用于说明，而不应以任何方式解释为是对本发明范围的限制。
实施例材料和方法1.菌株
使用了两种血清抗性淋球菌菌株、WG(DGI—1)(25，44，45)和7IH(DGI—5)(12，43)、和一种血清敏感性菌株24—1(12，36)。所有菌株在-70℃下贮存于20％的甘油/胰蛋白酶大豆肉汤培养基中。II.抗原：
(a)脂寡糖(LOS)的制备：
经改进热酚水抽提程序(18，67)，从淋病奈瑟氏球菌原型血清敏感性菌株(SS)中制备LOS(含2C7抗原决定基)。从纯化的冷冻种子培养物(-70℃)中移取微生物并接种到巧克力琼脂平板上。平板在蜡烛熄灭罐中37℃培养16—18小时。将一个平板的过夜培养物传代到10个平板上(并按上述培养)，再传代到100个平板上产生微生物的汇合菌苔。用无菌橡皮匙突小心刮下微生物(不刮破琼脂)并重悬于100ml冰冷的无菌生理盐水(0.9％NaCl)中。4℃下离心微生物10分钟(5000xg)，以将细胞重悬于冰冷的生理盐水中并再离心法洗涤沉淀两次。最终沉淀重悬于10ml无菌冷的去离子蒸馏水中并冻干。
干燥的全部微生物以1gm/21ml(重量/体积)的比例重悬于去离子蒸馏水中，加热到65℃并不断搅拌。然后加入等体积的90％酚(Fisher Scientific，Medford，MA)，65℃下持续搅拌混合物15分钟。混合物转移到50ml玻璃离心管中，冷却到10℃，然后在4℃下离心(5000xg)15分钟。用巴斯德吸管小心将上面水层(含LOS和核酸)转移到一分开的试管中，而不要破坏交界处的白色浑浊层。向试管内的剩余物中加入等体积的去离子蒸馏水并重复抽提程序。合并水层并离心去掉不溶物。然后，上清液在冷的去离子蒸馏水中透析(使用10,000MW封闭的透折袋；Fisher，Medford，MA)2周(每周更换三次外周水)。透折后，加入6倍体积的冷0.05M乙酸钠的95％乙醇溶液在-20℃下沉淀LOS≥4小时。4℃下离心(5000xg)15分钟取出沉淀并使残余的乙醇蒸发。干燥的沉淀重悬于去离子蒸馏水中，4℃下超速离心(105,000xg)3小时。经将其重悬于去离子蒸馏水中并重复超速离心(如上)去掉残余核酸来洗涤所得的沉淀(即：直到上清液OD测量值[280和260nm]小于0.01)。最终干净的沉淀(含LOS)重悬于少量体积(大约0.5ml)的去离子蒸馏水中并冻干。称重干燥的LOS粉末并在室温下贮存。该物质用作ELISA试验中的靶抗原(筛选用于特异性抗体生产的杂交瘤细胞)和用作动物研究中的对照免疫原。
(b)LOS的鉴定
(i)SDS—PAGE
用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分析LOS抗原的纯度。根据Laemmli的程序(32)，制备含尿素的不连续的Tris—甘氨酸SDS—PAGE。将14％T分离凝胶(丙烯酰胺：N，N’—亚甲双丙烯酰胺为29.2∶0.8，溶于0.375M Tris，0.1％SDS，pH8.8，25％尿素的溶液中)注入垂直的玻璃模中使其在室温下聚合。4％T堆积凝胶(丙烯酰胺：N，N’—亚甲双丙烯酰胺为29.2∶0.8，溶于0.125M Tris，0.1％SDS，pH6.8；25％尿素中)置于分离凝胶的上层。梳子(含10mm宽的齿)插到堆积凝胶中以产生加样泳道并使凝胶在室温下发生聚合。取出梳子并用去离子蒸馏水洗涤泳道。
电泳前，将LOS加入消化缓冲液(含4.4％SDS的0.18M Tris—HCl溶液，14.7％甘油，1.4％二硫苏糖醇，pH6.8；25％溴酚兰[1μg/μl]并煮沸10分钟。为估测每个电泳后的LOS样品分子量(MW)，也在消化缓冲液中制备了来自Bio—Rad(Richmond，CA)的分子量蛋白质标准品(MW 14.4 KD 200KD)、浓度为5μl标准品/100μl消化缓冲液。
每个样品溶液的10μg/10μl等份试样或10μl MW标准品溶液加入SDS—PAGE泳道，在电极缓冲液(0.025M Tris，0.2M甘氨酸和0.1％SDS)中10—15℃下以70mA的恒定电流电泳2.5小时。用银染(Bio—Rad银染试剂盒)显色LOS带。IlI.抗体
(a)个体基因型抗体(Ab1)杂交瘤细胞的生产
产生mAb 2C7(Ab1)的杂交瘤细胞系是一种用于抗淋病奈瑟氏球菌在体内广泛表达的抗原决定基的IgG 3λ。经过将小鼠骨髓瘤细胞系SP210—Ag14与用淋球菌全部外膜免疫过的品系A小鼠之脾细胞融合制备杂交瘤细胞。以有限稀释法亚克隆分泌抗淋球菌LOS的OS抗原决定基之抗体的单个细胞并随后贮存于液氮中(36)。
从液氮(或干冰)中取出2C7细胞系的冷冻小瓶用于尽快使之变暖而融化。当细胞几乎融化(即，还残余少许冰)时，在去掉瓶盖前用70％的乙醇擦净小瓶外表面。将细胞转移到15ml离心管中，该离心管预先装有10ml冰冷的Iscove培养基(Iscove氏改良Dulbec-co培养基、含4mML—谷氨酰胺，5μg/ml庆大霉素和10％胎牛血清)，温和(200xg)离心5分钟。去掉上清液，细胞重悬于10ml新鲜的冰冷Iscove氏培养基中。轻轻混匀后，将细胞转移到6孔组织培养板的2孔中在37℃5％的CO2培养箱中培养。细胞生长到汇合单层时，以1∶10稀释再使其长到汇合。定期检查抗体产量以证实细胞保持其产生抗体的能力。
将2ml 108个mAb 2C7分泌细胞加入到含150ml新鲜Iscove氏培养基的162cm2组织培养瓶中37℃(5％CO2)培养至杂交瘤死亡。此时上清液中含最高浓度的抗体。离心(1000xg)10分钟去掉细胞碎片，上清液贮存于-20℃(100ml/瓶)。随后从这些上清液中纯化出抗体(IIIb部分)。
以离心(2000xg；4℃)并将其重悬于含Ca2+和Mg2+离子的Hanks平衡盐溶液(HBSS++)(Sigma)中将一些活的抗体产生细胞洗涤2次。这些细胞沉淀以105活细胞/0.5ml的浓度重悬于HBSS++中。这些细胞悬液用免疫小鼠使产生抗个体基因型抗体(Ab2)(IVa部分)。
(b)个体基因型抗体2C7(Ab1)的纯化
大约100ml冷冻的mAb 2C7(IgG 3λ)上清液在室温下融化。加入等体积0.1M磷酸盐缓冲液pH7.0(PBS)，将混合物缓慢(10ml/小时)加到5ml抗—小鼠IgG3琼脂糖柱(Sigma，St.Louis.MO)上。这些柱具有每ml抗体一琼脂糖结合0.4mg(最小量)小鼠IgG3的能力。施加上清液后，用PBS洗柱直到滴下馏分的OD280达到零。然后用0.1M甘氨酸—HCl(pH3.0)从柱上洗脱结合的抗体。为保存抗体活性，经过将洗脱抗体馏分收集到装有等体积0.2M Tris—HCl(pH8.0)的0.5M NaCl溶液的管中立即中和洗脱馏分的pH。合并OD280读数超过背景的馏分并使用Centricon 30微量浓缩器(Amicon；Beverly，MA)浓缩到0.5mg蛋白质/ml，用生理盐水透析，并过滤灭菌。100μl等分试样贮存于-20℃。这些抗体用于ELISA试验以筛选产生Ab2的杂交瘤，和用于功能性试验，如杀菌试验和调理吞噬作用试验。
(c)Ab1的生物素标记
纯化的mAb 2C7(IgG3λ)用生物素(NHS—LC—生物素；Pierce，Rockford，IL)标记。简单地说，纯化的抗体(IIIb部分)用75,000MW封闭的胶棉袋(Schleicher and Schuell，Keene，NH)在50mM碳酸氢盐缓冲液(pH8.5)中透析。透析后的抗体转移到冰浴的16×125mm玻璃试管中，以1.7nmol生物素/1个IgG分子的比率加入生物素。这一比率是用Hnatowich等人(22)和Green(19)所述的方法预测出来的。
反应混合物在冰浴中保温2小时。为去掉剩余的生物素，使用Centricon 30微量浓缩器将混合物离心(1000xg)两次(每次30分钟)。用0.1M磷酸盐缓冲液pH7.0洗涤样品，并在Centricon 30中再次离心。稀释后，从Centricon 30中取出生物素标记的抗体并以50μl等份试样贮存于-20℃。
(i)直接ELISA试验
直接ELISA(酶联免疫吸附试验)用于测定保留LOS结合特异性的生物素标记的mAb 2C7和用于检测抗体上生物素的存在。所有ELISA试验都使用96孔Immulon U型底聚苯乙烯微量滴定板(Dy-natech；Chantilly，VA)。用100μl在碳酸盐缓冲液(1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，0.2g NaN3溶于11去离子蒸馏水中，pH9.6)中以1/200稀释的完整淋球菌覆盖微量滴定孔。平板在37℃下培养3小时(以100rpm摇动)、然后4℃贮存过液。去掉残余淋球菌(抗原溶液)后，用含0.05％Tween 20的0.01M PBS(PBS—Tween)以200μl/孔洗涤孔3次。平板在纸巾上吸干然后浸入含PBS—Tween的玻璃皿中。在平板顶端放置搅拌棒并低速搅拌(≥30分钟)以便用洗涤溶液清洗各孔。然后再吸干平板。
在PBS—Tween中稀释的各种稀释度的生物素标记的和未标记的抗体(mAb 2C7)加入适当的抗原覆盖的孔中，37℃下温育1小时(在摇动器上)。按上面所述洗涤和干燥平板。接着，将100μl碱性磷酸酶联结的抗小鼠IgG或联结的抗生物素蛋白质(在PBS—Tween中以1/1000稀释)加入适当的孔中并在37℃下再温育1小时(以100rpm摇动)。联结的抗小鼠IgG用于检测生物素标记的抗体对LOS的结合特异性，联结的抗生物素蛋白质用于检测在mAb 2C7上生物素的存在。按上所述洗涤和干燥平板。
最终洗涤后，每孔加入100μl底物溶液(一片磷酸对硝基苯酯片剂[Sigma 104底物片剂]/5ml二乙醇胺缓冲液，pH9.8)。在DynatechELISA平板阅读器上读出405nm下颜色的形成。在0时间进行测量并在25℃下使显色反应进行30分钟(每5分钟读数一次)。平板上还包括阴性对照(每份缺少一种成份)。
生物素标记的抗体随后用于ELISA试验以筛选产生Ab2的杂交瘤。
(d)单克隆抗体2C3
mAb 2C3(IgGlk亚类)与高度保守的表面暴露性淋球菌脂蛋白抗原决定基(命名为H.8)结合(2)。2C3细胞系贮存于液氮中，使用上面用于mAb 2C7生产所述的方法从该细胞系中生产抗体。使用与纯化2C7所述基本相同的方法从上清液中纯化2C3，除了使用抗IgGl抗体作为固相配体来代替抗IgG3(IIIa和b部分)。根据上面所述的程序(IIc部分)用生物素(NHS—LC—生物素)标记纯化的抗体。生物素标记的抗体贮存于—20℃(100μl等份试样)并用于后来调理吞噬试验(VI[ii]部分)中，以检测附着(但不吞入)在人多形核白细胞(PMN)上的生物体。
(e)筛选与主要和次要人血型抗原可能发生交叉反应的2C7抗原决定基
为分析与主要ABO血型抗原可能发生的交叉反应性，24—1LOS附着到固相上，预先与mAb 2C7一起温育，接着与NHS血型血清(A、B或O型)温育，并以与碱性磷酸酶结合的抗人类IgG或IgMmAb来识别。接着在常规血细胞凝集试验中mAb 2C7的PBS溶液与A1，A2，B或O型红细胞(用24—1 LOS致敏的O型红细胞用作阳性对照)温育。常规血型血清(A和B)也与LOS致敏的红细胞温育。使用为暴露被噬液酸封闭的抗原决定基，用胰蛋白酶或唾液酸苷酸预处理过的(37)红细胞重复凝集试验。
经ELISA测定首先分析了2C7抗原决定基与已知与淋球菌交叉反应的次要血型抗原可能的交叉反应性。与淋球菌和人鞘糖脂类抗原都结合的mAbs之糖类序列特异性如下：mAb3 3F11和06B4分别与分枝的和线型的抗原决定基(由Galβ1→4GlcNAcβ1→3GalB1→4Glc形成)结合(36，37)；3D9(抗—Pk)结合Galα1→4Galβ1→4Glc→神经酰胺[cer](69)；4C8(由M.A.Apicella赠送)与GlcNAcβ1→3GalB1→4Glc结合；4C4与Galα1→4Gal结合(70)；SH—34和103HT30与无唾液酸—GM1(GalB1→3NAcβ1→4Galβ1→4Glc—Cer)结合，但103HT30不结合淋球菌(71)；2D4与无唾液酸—GMz(GalNAcβ1→4GalB1→4Glc—Cer)结合(71)。首先测定了这些mAb与固相LOS和完整微生物(菌株24—1，在存在和缺乏CMP—NANA的条件下都生长)的直接结合。随后用ELISA抑制分析了mAb 2C7抑制与固相LOS或完整微生物结合的那些mAb之结合的能力。IV.抗个体基因型抗体(Ab2)的形成
(a)使用抗个体基因型抗体(Ab2)的鼠免疫
经以105个分泌2C7 mAb(Ab1)的杂交瘤细胞(IIIa部分)腹膜内免疫降植烷处理的BALB/C小鼠(Jackson实验室，Bar Harbor，ME)来制备单克隆抗个体基因型抗体(Ab2)。小鼠每周接受注射，共注射4周。这些免疫小鼠的脾细胞按下面所述用于产生抗个体基因型抗体。
(b)细胞融合产生抗个体基因型抗体(Abz)
融合前一周从液氮种子培养物中复苏Sp210—Ag14骨髓瘤细胞(如IIIa部分所述)并在加有10％胎牛血清的Iscove培养基中生长。在其用于融合试验前，用光学显微镜观察来监测骨髓瘤细胞以确保其生活力和迅速分裂。融合前一天，细胞用新鲜培养基饲养。
经在热平板上融化固态PEG然后冷却到37℃来制备35％PEG溶液(PEG4000，美国典型培养物收集中心，Rockville，MD)。将3.71ml预热的无菌Iscove培养基(无血清)加入到2克无菌PEG中。含PEG的Iscove培养基等分试样(2ml/管)贮存于-20℃，用前融化。
初次免疫32天后(最后一次加强免疫后3天)，以颈折断法处死免疫的小鼠(IVa部分)。无菌摘取脾脏并放入装有7ml预热PBS的10mm组织培养皿中。用2个无菌镊子撕开脾脏直到大多数脾细胞释放出来。经吹打几次进一步使细胞团破裂。所得的细胞悬液转移到15ml聚丙烯离心管中，留下较大块的组织和细胞团。向剩余团块中加入另一7ml体积的PBS并再次只出与其他悬浮液合并(共14m1)。混合后，细胞悬液静置2—3分钟使大团块沉到管底。从沉积物中小心取出悬浮细胞并转移到另一管中。向残余沉积物中加入1ml PBS经吹打使细胞团块破裂。静置2分钟后，吸出上清液加入到前面收集的14ml悬液中。接着，全部细胞悬液在室温下离心10分钟(250xg)并用PBS洗涤2次。在第二次洗涤的同时，收集骨髓瘤细胞(Sp210—Ag14，上面制备)并在分开的试管中离心。第三次洗涤时，脾细胞和骨髓瘤细胞分别在Iscove培养基(不含血清)中洗涤。对在最后一次洗涤和离心前取出的脾细胞和骨髓瘤细胞的等份试样进行计数。
大约108个脾细胞重悬于10ml新鲜培养基中，向其中加入109个骨髓瘤细胞，使骨髓瘤细胞：脾细胞为10∶1。室温下离心(250xg)细胞混合物5分钟并滗析培养基(尽可能去掉更多的培养基)。2ml 35％PEG(室温下)与细胞悬液混合超过2分钟。室温下离心(500xg)细胞3分钟并在不去掉上清液的条件下静置3分钟。慢慢向细胞中加入50ml Iscove培养基(无血清)，轻轻混合(稀释PEG)并在室温下离心(250xg)5分钟。小心吸出上清液，细胞重悬于60ml加有15％胎牛血清(FBS)和HT(100μM次黄嘌呤和16μM胸苷)的Iscove培养基中。细胞以1ml等份试样转移到60个孔(2个48孔平底组织培养板)中并在37℃下，7％CO2培养箱中培养。在24小时时，每孔加入1ml含15％FBS和HAT(100μM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤和16μM胸苷)的培养基。细胞每周检查2次，检查2周并用含HAT的新鲜培养基置换50％的培养基。2周后，细胞每周饲养2次，用含HT的培养基置换50％的旧培养基。然后使细胞完全耗尽HT并在Iscove′s培养基(无HAT或HT)中生长。融合14天后，筛选产生抗个体基因型抗体(Ab2)的细胞上清液。
(c)筛选抗个体基因型抗体
(i)免疫点试验
用免疫点试验初筛产生抗体的杂交瘤培养物上清液中的抗个体基因型(Ab2)(21)。将Immobilon PVDF膜(微孔)在甲醇中预处理2秒，用去离子蒸馏水洗涤2分钟，然后放入0.7％乙酸中处理30分钟。用将2层湿滤纸放在几层干燥纸巾上面的方法制备毛细吸印场。湿膜放在滤纸上面，去掉膜与滤纸间的气泡。将50μl上清液以小点的形式点样于膜表面。在PBS中稀释的LOS抗原(20μg/50μl)用作阳性对照。50μl培养基和50μl不产生抗体细胞的上清液用作2个阴性对照。这些对照样品以相同的方式点样于膜上。按照Blake等人(3)的程序洗涤和处理膜。简单地说，膜在室温下，在封闭缓冲液(含0.5％Tween 20的PBS)中培养2小时。接着将膜放入在含0.5％NaCl的1％BSA—PBS中以1/500稀释的生物素标记的抗体2C7(Ab1)(IIIc部分)溶液中。膜在往复摇床(100rpm)上4℃培养过夜，然后以在室温下将其放入新鲜封闭缓冲液中3次，每次5分钟来洗涤。随后膜放入在1％BSA—PBS中以1/1000稀释的碱性磷酸酶标记的抗生物素蛋白质(Sigma)中，在摇床上室温培养2小时，然后在封闭缓冲液中洗涤3次并用0.15M佛罗那乙酸盐缓中液(pH9.6)洗涤1次。碱性磷酸酶底物贮液接下面方法制备：5—溴—4—氯羟基吲哚磷酸酯(5mg/ml)溶于二甲基甲酰胺中(US BiochemicalsCorp.Cleveland Chio)，NBT(1mg/ml溶于佛罗那乙酸盐缓冲液中，USBiochemicals Corp)和2M MgCl2。将20μl MgCl2，1ml0.1％NBT，0.1ml羟基吲哚磷酸酯和9ml佛罗那乙酸盐缓冲液混合并加到洗过的膜上，室温下在摇床上培养至颜色形成。用去离子蒸馏水洗涤膜来终止反应。
(ii)等模式试验
基于mAb的小鼠免疫球蛋白(Gibco BRL)等模式系统用于被鉴定为抗个体基型阳性的等模式细胞上清液(例如，在上述免疫点试验中它们是阳性)。根据厂家提供的说明进行试验。所有试剂在试剂盆中提供。试验操作如下。
抗小鼠等模式特异性抗体(即，抗IgGI，抗IgG2a，抗IgG2b，抗IgG3，抗IgM和抗IgA)和免疫球蛋白轻链(k和λ)特异性抗血清在50mM Tris，200mM NaCl(pH7.5)(TBS)中稀释5倍。50μl上述抗体稀释液加入U型底96孔Immulon I板(Dynatech)的孔中。平板37℃培养1小时，用含0.05％Tween20的TBS洗涤4次，在纸巾上吸干。每孔加入50μl封闭缓冲液(1％BSA的TBS溶液)并37℃培养15分钟。平板按上述方法洗涤和干燥，在合适的孔中加入50μl上清液样品。50μl阳性和阴性对照样品加入合适的孔中。平板培养1小时(37℃)，洗涤并干燥如上。每孔加入50μl碱性磷酸酶结合的大鼠抗小鼠Ig并培养1小时(37℃)。洗涤并干燥平板；每孔加入50μl底物溶液(10％[w/v]二乙醇胺[pH9.8]，0.5mM MgCl2，0.02％[w/v]叠氮化钠，在试剂盒中提供)并培养30分钟(37℃)。使用Dynatech ELISA阅读器检查孔中的颜色反应。如果细胞上清液含有特定等模式mAbs，则可检测到颜色反应。比较样品与阳性和阴性对照的光密度(OD405)。
(iii)竞争性ELISA
用从24—1淋球菌中制备的(IIa部分)在巴比妥乙酸盐缓冲液(pH4.6)中稀释的100μl LOS(80μg/ml)覆盖U型底96孔1mmulonI平板(Dynatech；Chantilly，VA)的各孔(34)。平板按上述方法培养过液(III部分C[i])。
第二天，将产生抗个体基因型抗体(Ab2)的细胞上清液之稀释液(在PBS—Tween 20中)与固定量的生物素标记的Ab1(III部分c)在12×75mm玻璃试管中混合并在摇动水浴中37℃培养1小时使Ab1上的结合位点饱和。所用的生物素标记的Ab1总量(当用碱性磷酸酶标记的抗生物素蛋白质检测时)预先测定，使用的稀释度是能在(室温)30分钟后使OD405读数为大约0.4。
洗涤和干燥平板(与在直接ELISA试验中一样)。将100μl Ab1∶Ab2混合物加入各孔中并在摇床上37℃培养1小时。去掉残余的Ab1∶Ab2混合物后，加入100μl碱性磷酸酶标记的抗生物素蛋白质(Sigma)(在PBS—Tween中以1/1000稀释)。平板在摇床上37℃培养1小时，然后洗涤并干燥。再向各孔中加入100μl底物溶液(一片磷酸对硝基苯酯[Sigma 104底物片剂]5ml二乙醇胺缓冲液，pH9.8)。按上面所述(III中分c[i]在Dynatech ELISA平板阅读器上读出OD405的颜色反应。将反应混合物中的颜色强度与每个平板中包括的未抑制的对照(未吸附的Ab1)进行比较。
(iv)置换ELISA
在本试验中，将固定量的生物素标记的mAb 2C7(Ab1)加入24—1淋球菌LOS覆盖的孔中并在摇床上培养1小时(37℃)。按上面所述(IV部分c[iii]洗涤和干燥平板。在适当的孔中加入100μl在PBS Tween 20中稀释的抗个体基因型(AB2)上清液以置换结合的mAb 2C7。平板培养，洗涤，和干燥如上并接IV部分c(iii)所述进行反应。
(d)杂交瘤克隆
(i)软琼脂糖克隆
分泌Ab2的杂交瘤细胞(以免疫点、竞争和置换试验筛选上清液来鉴定)克隆如下。在无内毒素的无菌水(Sigma)中制备3％琼脂糖(Sigma)溶液，高压灭菌30分钟，然后在水浴中放置5分钟冷却到42℃。该琼脂糖溶液在6个月内保持稳定并可经微波透射以备将来使用。含有20％胎牛血清(FBS)和10％Origene杂交瘤克隆因子(Igen，Inc.，Rockville，MD)的Iscove培养基(42℃)加入琼脂糖中使其终浓度为O.3％琼脂糖。5ml等汾试样加入无菌60mm组织培养皿中，并在4℃使其固化，然后转移到37℃5％CO2培养箱中至少30分钟。
从培养板中收获杂交瘤细胞并重悬于Iscove培养基中使终浓度为10,000个细胞/ml。100μl细胞悬液的等份试样加入到1ml 0.3％琼脂糖培养基(上面制备的；42℃)中。吸出1ml细胞—琼脂糖—培养基溶液(含大约1000个细胞)迅速滴加到含5ml固化0.3％琼脂糖的组织培养皿上面并形成一个环。每份细胞悬液至少制备5个培养皿。培养皿迅速转移到4℃工作台上使上面细胞—琼脂糖—培养基层固化5分钟，然后将培养皿转移到5％CO2，37℃培养箱中。3—5天后出现显微镜下可见的克隆。用无菌吸管挑出单个克隆转移到96孔组织培养板上的100μl培养基中并37℃培养3天。以等模式ELISA(IV部分c[ii])筛选各孔上清液中的抗体产物。具有高抗体滴度的产生抗体的细胞以更大的体积繁殖并以竞争和置换ELISAS检查特异性抗体产物。这些克隆的杂交瘤细胞经在含10％二甲亚砜(DMSO)的组织培养基中缓慢冷冻后贮存于溶氮中。
(e)Ab2的纯化
使用与纯化Ab1(III部分b)所用的相似的方法进行单克隆抗个体基因型抗体Ab2(本例中是IgM)的纯化，不同的是与琼脂糖结合的抗小鼠IgM用于免疫纯化。纯化的抗体用于生产抗—抗个体基因型抗体(Ab3)。
(f)Ab2的KLH结合
根据Mishell等人(38)的程序用戊二醛将纯化的单克隆抗个体基因型抗体(IV部分e)与锁眼帽贝血蓝蛋白(KLH)偶联。纯化的抗个体基因型抗体(1.4mg)(Ab2)0.5mg/ml 0.9％NaCl)用大约100ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.8)透折，然后与KLH按0.5mg抗体对2.5mg KLH的比率进行混合。向混合物中缓慢加入每0.5mg抗体10μl的0.5％水合戊二醛(新鲜配制)并在室温下使其反应1小时。经用大约100ml 0.1M(NH4)2CO34℃透折3—4小时终止反应，接着用100ml 0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.5)透折过夜。10,000rpm离心15分钟去掉沉淀(如果有沉淀的话)。将上清液施加到以0.05M磷酸盐(pH7.5)平衡的Sepharose C1—2B柱(1×40cm)上，收集2ml馏分。合并包含Ab2—KLH的第一峰并用Centricon 30微量浓缩器浓缩至原始体积。50μl等份试样贮存于-20℃。该物质用于免疫兔以产生抗—抗个体基因型抗体(Ab3)(V部分b)。
24—1淋球菌LOS(500μg)，C型脑膜炎球菌荚膜多糖(C—MCP)(500μg)，和一种无关IgMk mAb(Sigma)(1.5mg)也按上述方法与KLH结合。使用Centricon 30微量浓缩器将24—1 LOS和C—MCP浓缩至1ml，用Centricon 30微量浓缩器将无关IgMk mAb浓缩至2ml。这些KLH结合的制品用于免疫对照兔(Vb部分)。V.抗—抗个体基因型抗体Ab3)的形成
(a)免疫同源小鼠以产生Ab3
经腹膜内(ip)注射0.5ml纯化的Ab2(1，10，100，或200μg)无菌PBS溶液诱导12周龄的同源BALB/c小鼠(Jackson实验室，Bar Harbor，ME)产生抗—抗个体基因型抗体(Ab3)。用无菌PBS，10μg无关IgMk mAb，或10μg 24—1淋球菌LOS免疫对照小鼠。10μg剂量用于免疫4只小鼠，每种余下的免疫原各免疫一只动物。2周后用等剂量的原始抗原经ip进行加强免疫。从第0天开始小鼠每周经尾部抽血。其血清用于ELISA试验(Vc(i)部分)。
(b)免疫异源兔以生产Ab3
用悬浮于完全Freund佐剂(CFA)(2ml免疫原：2ml CFA)中的纯化Ab2—KLH(5，10，50或100μg)在第0和14天在10个不同的部位(400μl/部位)经皮下(SC)免疫6周龄的新西兰白兔(PineAcres Farm，MA)。在第42天接受静脉内(iv)注射(相等剂量；无KLH或CFA)，在第28，30，和32周接受SC注射(相等剂量，含KLH的CFA溶液)。在第60周用50μg Ab2经iv加强免疫接受过10μg和100μg剂量CA1的兔。
按上面方法用100μg 24—1淋球菌LOS，100μg无关单克隆鼠IgMk或100μg c型脑膜炎球菌荚膜多糖(C—MCP)(均与KLH偶联并悬浮于CFA中)免疫对照兔。在开始7周内的每周和以后每次加强注射前对兔抽血(经耳动脉)。在ELISA中检查血清(VC[i]部分)。
(c)Ab3抗体的筛选
(i)酶联免疫吸附试验(ELISA)
用ELISA检查小鼠和兔(Va和b部分)免疫前和免疫后血清的抗—抗个体基因型(Ab3)产物。用100μl溶于巴比妥乙酸盐缓冲液pH4.66(10)中的24—1淋球菌LOS(80μg/ml)覆盖U型底，96孔Immulon I板(如IIIc[i]部分所述)。洗涤并干燥平板。向微量滴定孔中加入血清稀释物(用PBS—Tween 20稀释)并在摇床上37℃培养1小时。平板洗涤和干燥后，在适当的孔中加入100μl 1/1000稀释的碱性磷酸酶联结的羊抗小鼠IgG(或IgM)或碱性磷酸酶联结的羊抗兔IgG(或IgM)并在摇床上37℃培养1小时。经洗涤和干燥后，每孔中加入100μl底物溶液并读下形成的颜色(如IIIc[i]部分所述)。VI.Abl和Ab3的功能活性
(a)补体的制备
根据Joiner等人(23)所述的方法，使用能以商品形式买到的新鲜正常小鼠血清(SIGMA)和新鲜正常兔血清(Gibcco)作为杀菌试验中的补体来源制备补体。从C5缺陷型B10.D20SNJ小鼠(TheJackson Laboratory，Bar Harbor.ME)中抽出的新鲜血液经首先室温凝结15分钟，再3000xg离心(10分钟)并立即放入冰浴中用作调理细胞吞噬试验的补体来源。
微生物划线到巧克力琼脂板上并在37℃，5％CO2气体中培养过夜蜡烛熄灭罐中)。用棉头签将它们收集到1ml 0.1M PBS中，离心收获。微生物在1ml 0.25％戊二醛PBS中室温培养30分钟并按上述洗涤。然后1ml DL—赖氨酸(1mg/ml的PBS)加入微生物中(抑制残余的戊二醛)室温下处理20分钟。洗涤微生物(按上述方法)，加入5ml血清并翻转摇动1小时(4℃)。血清在4℃下离心(3000xg)10分钟(去掉微生物)并通过0.22μm微孔滤器过滤除菌。血清(补体来源)贮存于-70℃。含有用于本试验的微生物的等份试样融化后立即用于试验中(VId部分)。
(b)微生物的繁殖
根据Morse等人(39)所述的方法制备用于繁殖萘瑟氏球菌属微生物的培养基。
将1.5g蛋白酶胨#3，0.4g磷酸钾(二代的)，0.1g磷酸钾(一代的)，0.5g氯化钠和0.1g可溶性淀粉溶于100ml去离子蒸馏水中来制备溶液A。高压灭菌15分钟，冷却到室温并在4℃下贮存2周。将0.042g碳酸氢钠和4.0g葡萄糖溶于90ml去离子蒸馏水中制备溶液B，过滤除菌(0.22μm微孔滤器)并贮存于4℃。
一菌环量的融化微生物(从贮存于-70℃的冷冻种子培养物中得到)转移到巧克力琼脂板上，37℃在5％CO2气体中培养14—16小时蜡烛熄灭罐中)。纯克隆划线到第二巧克力琼脂板上得到固态微生物菌苔。平板按上述方法培养。在需要唾液酸结合型微生物的实验中，淋球菌在含1ml 80μg 5’—胸苷单磷酸N—乙酰神经氨酸(CMP—NANA)铵盐(SIGMA)的巧克力琼脂板上生长。
培养后，微生物收集到1ml的溶液A中并彻底混合。将细菌悬液加到含9ml溶液A，1ml溶液B和0.1ml与商品Isovitalex相同的由维生素氨基酸和右旋糖配成的混合物之无菌侧臂瓶中(直到OD650＝0.1)。另外，如果需要唾液酸结合型微生物，则向液体生长培养基中加入CMP—NANA(80μg/ml)。37℃下使培养物生长，并剧烈搅拌使通气，得到大约108CFU/ml(OD650＝0.2)的对数中期浓度。
这些生物体悬液用于下述杀菌试验(IVC部分)和调理细胞吞噬试验(VId部分)中。
(c)杀菌试验
所用的杀菌试验方法是Roberts(47)和Gold and Wyle(55)用于脑膜炎奈瑟氏球菌所述的程序的改进(27)。按上面所述制备细菌培养物(108CFU/ml，OD＝0.2)并用溶液A稀释400倍得到大约105CFU/ml。试管在37℃旋转摇动水浴中培养直到使用(最多10分钟)。
在带盖的12×75mm无菌聚苯乙烯管中制备反应混合物。每份试验混合物含0.025ml稀释剂(Gey平衡盐溶液)，0.025ml细菌悬液，0.05ml试验抗体[Ab1(2C7)或Ab3系列稀释的抗体或在用LOS或C—MCP免疫的动物中制备的对照抗体](III[b]，V[a]和[b]部分)和0.05ml吸附的补体来源(VIa部分)。旋转混匀后，将0.025ml混合物一式二份接种到巧克力琼脂板上并用灼烧过的玻璃棒均匀扩散开以得到0时的菌落形成单位(CFU)的数目。然后混合物在旋转摇动水浴中37℃培养30分钟。0.025ml反应混合物的等份试样(在30分钟时间时)再一式两份接种到另一套巧克力琼脂板上并按上述扩散开。平板在37℃下5％CO2气体(蜡烛熄灭罐)中培养。
使用Quebec菌落计数器计数CFU。用与0分钟时相比较30分钟时菌落数减少的百分数来表示杀菌力。
作为存在足够补体活性的阳性对照，使用对细菌试验菌株已知具有杀菌活性的血清。阴性对照包括无试验血清的活性补体和含加热灭活(56℃30分钟)的补体和试验血清的反应混合物。
(d)调理细胞吞噬试验
所用的微生物的调理和细胞吞噬试验是对Sveum等人(55)和Ross and Densen(48)所述程序的改进。
(i)PMN的制备
根据PolymorphprepTM(13.8％Sodium Metrizoate和8％Dextran500)(Nycomed Pharma As，N—0 401，Oslo4，Norway)厂商描述的程序制备多形核白细胞(PMN)。简单地说，从正常成人自愿者中抽出30ml全血并立即转移到含45—50mg EDTA二钾盐的50ml离心管中，轻轻混匀。大约5ml经抗凝血处理的全血小心铺到15ml离心管中的3.5ml PolymorphprepTM层上面。管在摆动转子中室温下离心(500xg，30分钟)。小心去掉血清(上层)和界面由单核细胞组成的细胞带而不破坏下层的PMN带。PMN转移到另一1Sml离心管中并用等体积0.45％NaCl稀释。离心(500xg，4℃下10分钟)并用无菌0.1M PBS 4℃下洗涤2次。如果PMN出现红细胞污染(粉红色)，则白细胞中加入1ml冷的无菌水处理30秒(溶解红细胞)，然后加入PBS至总体积为14ml并按上述离心。最终细胞沉淀重悬于lml PBS中并用血细胞计数器计数细胞。悬液用PBS稀释至终浓度为2×107PMNs/ml并在冰上保存，在30分钟内使用。
(ii)微生物的调理
108CFU/ml(OD650＝0.2)细菌试验生物体(IVb部分)用于本试验。8ml细菌培养物(从10ml的总体积中取出)在微量离心机中离心并用含Ca2+和Mg2+离子(HBss++)的Hank′s平衡盐溶液(Sigma)洗涤2次。含大约5×108个细菌的沉淀重悬于0.5ml 0.1M的NaHCO3(pH9.5)中，向悬液中加入0.5ml荧光黄(Sigma)(以2mg/ml溶于0.1m NaHCO3中，pH9.5)并在室温下翻转摇动45分钟。细菌在HBss++中洗涤三次(如上)并以5×108个细菌/ml的浓度重悬于HBss++中。将调理抗体Im Ab 2C7(Ab1)(IIIa部分)或兔免疫前或14天后的血清(Ab3)(Vb部分)]加入到250μl细菌悬液中使最终抗体稀释度mAb 2C7为1/100，兔血清为1/500。然后，混合物在旋转摇动水浴中37℃培养30分钟。在一分开的管中，培养250μl不含调理抗体的细菌悬液作为阴性对照。培养30分钟后，细菌在室温下用HBss++洗涤3次(如上)。调理后的细菌以5×108细胞/ml的浓度重悬于Hbss++中。并在用于细胞吞噬试验前在冰上培养大约5分钟。
作为阴性染色对照。剩余的2ml细菌(来自于最初的10ml培养物)用0.5ml含1％多聚甲醛的Haema—line Z(Serono—Baker Di-agnostics，Allentown，PA)固定并在冰上保存直到用于分析。染色细菌的等份试样也以相同的方式固定。
(iii)细胞吞噬试验
附着
在分开的反应试管中使调理的(试验)和未调理的(对照)细菌(2.5×107个细胞/50μl HBss++)附着到PMN上(106个细胞/50μlHBss++)。在使用补体的实验中，在加入PMN前，向细菌中加入10％(10μl)的补体(在Va部分中制备)。混合物(以25个细菌/PMN的比例)在0℃下培养30分钟(允许附着但不被吞噬)。含1％BSA的1ml冰冷的HBss++加入试管中，离心从PMN中分离未结合的细菌(250xg，5分钟，4℃)。每份沉淀含有附着有细菌的PMN，将它重悬于100μl冰冷的含1％BSA的HBss++中，分成等分试样放入预冷的12×75mm无菌聚苯乙烯管中(25μl/管)，并保存于冰上。
细胞吞噬
3份25μl附着有细胞的PMN等份试样(调理的或未调理的)在旋转摇动水浴中37℃进行培养。这些条件允许PMN吞噬细菌。经每隔10分钟向一支管中加入42μl含1％BSA的冰冷HBss++并将它放置到冰浴中来终止吞噬反应。
复染
细胞吞噬后，PMN与50μl冰冷生物素标记的mAb 2C3(0.5μg/ml)(IIId部分)一起培养30分钟。mAb 2C3仅与PMN表面的细菌生物体结合。每管加入1ml含1％BSA的HBss++并离心(1500xg)10分钟。经将它们悬浮于1ml含1％BSA的HBss++中并按上面所述进行离心来洗涤细胞。细胞沉淀与1.5μg(6μl)抗生蛋白链菌素藻红蛋白(PE)—德克萨斯红(SAPETR)(Gibco)一起在冰上培养30分钟。然后洗涤细胞(按上面所述)。接着，用含1％多聚甲醛的Haema—line Z固定PMN/细菌沉淀并贮在于冰上直到用于分析。作为SAPETR染色对照，荧光黄染色的未调理和未吞噬的细菌与生物素标记的mAb 2C3一起培养并按上面所述方法进行处理。
流式细胞光度术
在单氩离子激光器FACS(Becton Dickinson，FACS系统，Suny-vale，CA)上对固定的PMN进行流式细胞光度术分析。荧光黄(绿荧光)激发光为488nm，发射光为520nm[在荧光1(FL1)波道上检测]。藻红蛋白激发光为488nm，发射光为575nm，它又激发邻近的德克萨斯红，而德克萨斯红(红荧光)的发射光为618nm[大多数在荧光3(FL3)波道上检测]。
FL1和FL3中荧光发射的增加以波道上的平均荧光值(10,000个细胞发射的荧光平均强度)来表达。荧光强度与平均荧光直接关(16)。平均荧光测量值越高表明附着到PMN上的细菌数越大(13，54)。
由于发生细胞吞噬，能结合生物素标记的mAb 2C3的淋球菌减少，因此SAPETR结合减少(即，FL3中的发射光减弱)，而存在的细菌总数保持恒定(FL1中的发射光恒定)。结果I.第一抗原(LOS)的鉴定
经SDS—PAGE证实了LOS抗原的纯度和无可识别的蛋白质污染。大多数淋球菌菌株产生1—6个在抗原性上和结构上独特的LOS，在SDS—PAGE上以分子量范围为3200—7100mw的亚单位进行迁移。经45％热酚提取由血清敏感性菌株24—1制备的LOS在SDS—PAGE上比14.4KD标准品迁移更快。在凝胶上观察不到更高MW的蛋白质带。II.抗体(a)个体基因型抗体2C7(Ab1)的生产和纯化
从2C7杂交瘤细胞系中生产个体基因型mAb 2C7(Ab1)并从组织培养物上清液中进行纯化(26)。
用亲和层析实现mAb 2C7(Ab1)(鉴定为IgG3λ亚类)的富集和浓缩。100ml杂交瘤细胞上清液在琼脂糖连接的抗小鼠IgG亲和柱上过柱。合并峰馏分并用Centricon 30微量浓缩器浓缩至0.5mg/ml，用生理盐水透析并过滤灭菌。等分试样(100μl)在—20℃冷冻。在将抗体浓缩至更高浓度(即＞1mg/ml)的试验中抗体溶液产生沉淀并在直接ELISA试验中抗体结合活性丧失。(b)个体基因型抗体2C7(AB1)与人血型抗原反应性的鉴定
已知一些抗—LOS MAb(3F11和06B4)识别人血型前体抗原(37)。淋病奈瑟氏球菌上的LOS抗原决定基与人红细胞前体的结构相似性在淋球菌感染发病机理的一些方面具有意义。首先，抗原相似性可能使生物体能模拟宿主表面结构，因此促进其结合和附着到宿主表面和吞噬细胞上。这也可能在淋球菌对人生殖上皮细胞的特异性上发挥作用。其次、抗原相似性可能使细菌表现出象“自身”表面并搅乱了正常的体液和细胞免疫反应。这种抗原相似性在来源于LOS的OS抗原决定基被当作候选疫苗时尤其重要，其中“自身”抗原刺激的存在可能导致无反应或更重要的是导致自身免疫反应的产生。
因此，用抑制ELISA来试验MAb 2C7识别人红细胞GSL抗原的可能性(14)。NHS取自具有A，B，或O型血的供血者。血型由下面特征定义：(i)存在凝集异源性红血细胞的抗体，(ii)血型特异性MAb以凝集反应正确鉴别供血者红血细胞的能力。在这些实验中，从命名为24—1(121)的SS原型菌株制备的LOS覆盖到微量滴定板孔中。首先向孔中加入各种稀释度的MAb 2C7，接着以NHS培养，最后用抗人IgG或IgM—HRP结合物来识别。证实在4种B型血清(显示出具有抗血型A抗原的抗体)，3种O型血清(抗A和B抗原的抗体)和4种A型血清(抗血型B抗原的抗体)中无抑制反应。而且，2C7(在PBS中稀释)不凝集A1，A2，B或O型红细胞，但凝集用SS(24—1)LOS致敏的O型红细胞(阳性对照)。所用的血清都不凝集LOS致敏的红细胞。综合这些资料表明被MAb 2C7识别的抗原决定基与主要人血型(ABO)抗原不相似。
识别人鞘糖脂抗原并早先显示出与淋球菌LOS抗原决定基交叉反应的mAb随后用完整的淋球菌和纯化的LOS筛选。随后测定mAb 2C7抑制直接线合ELISA中mAb阳性结合的能力。结果表明在2C7抗原决定基和早先鉴定为交叉反应性的抗原决定基之间无交叉反应性。其他人已证实用胰蛋白酶和神经氨酸苷酶处理，暴露唾液酸结合的GSL抗原决定基后，可增强mAb 3F11介导的红细胞凝集(37)；然而，胰蛋白酶和神经氨酸苷酶处理不能诱导mAb 2C7凝集红细胞(mAb 2C7能凝集用菌株24—1 LOS致敏的阳性对照O型红细胞)。同样地，ELISA资料表明：mAb3F11预光吸附胰蛋白酶或神经氨酸苷酶处理过的红细胞使其与固相24—1 LOS的结合分别减少了大约50％和95％(与预先吸附未处理过的红细胞相比)，而剩余的与LOS结合的mAb2C7是未被吸附的。综合这些资料表明：被mAb 2C7识别的抗原决定基与人鞘糖脂抗原无抗原相似性，因此预期不会引起自身免疫反应。III.抗个体基因型抗体(Ab2)(a)抗个体基因型抗体(Ab2)的形成
经过用分泌mAb 2C7(IgG3)的杂交瘤细胞腹膜内免疫降植烷处理过的BALB/c小鼠，接着将其脾细胞与无分泌性的Sp210—Ag14骨髓瘤细胞系融合来生产抗个体基因型抗体(Ab2)。经HAT挑选后，首先用免疫点试验筛选上清液中与生物素标记的mAb 2C7相结合的抗体产物。阳性上清液随后用于等模式ELISA中。144份上清液中有101个产生IgMk抗体。我们挑选了21个细胞生长迅速的孔并用覆盖到固相上的24—1淋球菌LOS(带有2C7抗原决定基)在2个另外的ELISA试验中检查上清液。
在第一个ELISA(竞争性ELISA)中，试验了各种稀释度的Ab2上清液与生物素标记的mAb 2C7竞争性结合LOS的能力。21份上清液中，有10份在本试验中以1/8的上清液稀释度对2C7与LOS的结合显示出＞45％的抑制。剩余上清液显示出较小的(＞30％到＜45％)抑制作用。2个阴性对照(培养基和无抗体产生细胞的上清液[1∶8稀释])显示出＜15％的抑制作用。
我们从10个在竞争性ELISA中产生＞45％抑制的上清液中选出5个在第二(置换)ELISA中进行试验。
在置换ELISA中，我们试验了各种稀释度的Ab2上清液置换预先与固相LOS结合的生物素标记的mAb 2C7之能力。5份上清液(1∶2稀释)中有4份置换出＞60％的生物素标记的mAb 2C7，1份置换出40％。阴性对照(无抗体产生细胞的上清液[1∶2稀释])显示出＜20％的置换率。5个克隆中的一个(命名为CA1)产生大量的IgMk抗体，用软琼脂糖方法将它进一步亚克隆。
为生产大量抗体而繁殖和扩增产生抗体的克隆后，我们用亲合层析法从上清液中纯化了mAb CA1。(b)抗个体基因型抗体CA1(Ab2)的纯化
使用抗小鼠IgM琼脂糖亲合层折从100ml杂交瘤细胞上清液中纯化mAb CA1(IgMk)。从柱上洗脱出的总蛋白质大约为2mg(10ml中)。将该抗体在Centricon30微量浓缩器中浓缩到0.7mg/ml。按下面所述将2ml这种纯化的抗体与锁眼帽贝血蓝蛋白(KLH)联结。(c)与KLH的联结
使用戊二醛作为交联剂，将纯化的抗个体基因型抗体(Ab2)(一种IgMk，2ml中含1.4mg0与KLH偶联。与KLH联结的抗体从Sepharose C1—2B柱的第一央中洗脱出来，它是柱总床体积的65—78％。合并含有第一峰的馏分并浓缩到原始体积。
2mg无关IgMk MAb(以商品的形式从Sigma买到)，500μg 24—1 LOS和500μg C型脑膜炎球菌荚膜多糖(C—MCP)与KLH偶联，用作免疫试验中的对照。在Sepharose C1—2B凝胶柱上可见到相似洗脱情况。IV抗—抗个体基因型(Ab3)的形成(a)同源小鼠(BALB/c)的免疫
免疫点和ELISA(竞争和置换)试验明：mAb CA1(Ab2)是一种与大多数淋球菌菌株LOS上的2C7抗原决定基相似的分子。为证实这一点，我们鉴定了使用Ab2作为免疫原是否能诱导识别2C7抗原决定基的抗—LOS抗体(Ab3)。我们首先对相同品系的小鼠进行免疫，用于制备Ab2(BALB/c[同源品种])。
用各种剂量(1，10，100或200μg)的纯化的mAb1 CA1(Ab2)经腹膜内(ip)免疫12周龄的BALB/c小鼠。10μg剂量用于免疫4只小鼠且每种其余的剂量只免疫一只动物。用无关鼠IgMkmAb，24—1淋球菌LOS和PBS进行对照免疫。每只小鼠在免疫前和免疫后的每周进行抽血以分析Ab3抗体水平(由在ELISA中与LOS的结合来测定)。在第14天使用相同剂量的原始抗原进行加强免疫。
经ELISA检测到10和100μg剂量的mAb CA1(Ab2)在小鼠中引起Ab3(IgG，抗LOS抗体)反应(图1)。图中每点代表2—4次实验的平均值。在用1或200μg mAb CA1(Ab2)免疫的小鼠中无Ab3反应。
用10μg CA1免疫的小鼠在第14天抗体产物水平比免疫前水平提高2.5倍，在第21天(加强剂量免疫后一周)，由于加强免疫而诱导抗体产物水平迅速提高到免疫前的12倍。用100μg CA1免疫和加强的小鼠在第21天抗体水平提高11.7倍(图1)。
用LOS免疫的小鼠在第21天抗—LOS IgG抗体提高4.5倍。用无关IgMk mAb或PBS免疫的对照小鼠抗LOS IgG不升高，这显示了抗CA1 Ab3反应的特异性(图2)。图中每点代表2次实验的平均值。
还测定了免疫后的IgM反应。在小鼠中对CA1不发生抗LOSIgM反应。正如所预料的，接受LOS的小鼠发生4倍的IgM抗体反应，它在初次免疫后第14天达到高峰并随后下降，尽管随后接受加强剂量的免疫。用无关IgMk mAb或PBS免疫不能诱导IgM反应(图3)。图中各点代表2次实验的平均值。
这些结果表明CA1(Ab2)能诱导抗LOS Ab3抗体。加强免疫后IgG抗体产物的迅速增加(图2)表明这是一种T细胞依赖性抗体反应。(b)免(异源性)的免疫
为进一步证实CA1是一种与第一抗原LOS抗原决定基相似的分子(即，CA1代表Ab2B)，我们在异源性系统(兔)中进行了免疫。用各种剂量(5，10，50或100μg)的CA1，或100μg LOS，100μg C型脑膜炎球菌荚膜多糖(C—MCP)，100μg无关单克隆鼠IgMk(均在完全Freund佐剂[CFA]中与KCH偶联用于皮下免疫)的对照免疫原免疫和加强(在第14天)免疫6周龄的新西兰白兔。在静脉内(iv)加强免疫中，所用的CA1无KLH和CFA。初次和加强免疫使用相同剂量的原始抗原。兔在初次免疫前和7周内的每周进行抽血。7周后，在每次加强免疫前抽血。用ELISA测定抗LOS(Ab3)IgG和IgM抗体水平。
每一种剂量免疫一只动物。用5μg CA1免疫的兔在第35天抗LOS IgG抗体水平提高2.25倍在加强免疫后第48天再提高2倍(图4)。用10μg剂量免疫的兔，开始上升缓慢，在第48天上升到基线上的1.5倍。用50μg剂量免疫的兔，在第14天上升到2.8倍并在48天后稳定在基线上的2倍。尽管随后进行加强免疫，但抗体水平仍然下降，直到第32周，兔在第58周死亡(资料未显示)。兔的死亡与皮下施用mAb CA1(Ab2)无关，因为最后一次剂量在第26周前注射。用100μg剂量免疫的兔不发生Ab3 IgG反应(图4)。图4中各点代表2次实验的平均值。
最初用10μg CA1免疫的兔在第60周用50μg相同抗原(无KLH)经iv途径加强免疫，加强5天后抗体水平迅速上升4倍(图5)，这表明它是一种T细胞依赖性抗体反应。图5中各点代表2次实验的平均值。
每种抗原免疫一只动物。比较CA1(50μg)与对照免疫原LOS，C—MCP和无关IgMk的IgG Ab3反应发现、50μg CA1的抗LOS反应(上升2.8倍)与接受LOS—KLH28天后兔的反应(上升2.6倍)相似(图6)。因此，到第5周为止，用LOS免疫和在第14天加强免疫的兔LOS抗体水平比免疫前水平高12倍。在图6中、每点代表2次实验的平均值。
每种免疫原免疫一只动物。接受过5μg剂量的CA1兔中到第48天为止形成最大IgM Ab3抗体反应(上升3.3倍)(图7)。接受过50μg CA1的兔子到第28天上升2.5倍。接受10或100μg剂量的兔不产生IgM Ab3反应(图7)。接受C—MCP—KLH和无关IgM—KLH的兔观察不到反应(IgG或IgM抗体)。图7中各点代表2次实验的平均值。
用LOS免疫的对照兔IgM抗体水平到第28天上升6.7倍，到第5周上升27.5倍(图8)。这只兔在第6周经iv加强注射100μg LOS(无KLH)后死亡。随后在这只动物中的抗体检测表明存在大量的循环抗LOS抗体(IgG和IgM)。当经静脉内途径用药时，发生的抗原—抗体反应引起全身性Arthus反应(或血清疾病)，这激活补体并杀死动物。图8中各点代表2次实验的平均值。
综合这些结果证实Ab3与CA1的反应诱导抗第一LOS抗原，这表明CA1代表一种与LOS抗原决定基相似的Ab2β抗个体基因型。V.Ab1和Ab3的功能活性(a)杀菌活性
使用已知的杀菌试验程序(15，24，41)测定Ab1(mAb 2C7)和Ab3(在小鼠和兔中与CA1和LOS都反应)的补体依赖性杀菌抗体活性。用淋球菌吸附同源补体源，该淋球菌为以含2C7抗原决定基的SS(24—1)和SR(WG)为代表的并用戊二醛固定的淋球菌和抗原决定基缺陷型SR(7IH)淋球菌，在本试验中在使用这些补体源前用它们去掉抗淋球菌抗体。
反应混合物中的45μg mAb 2C7(Ab1)(所用的最高浓度)介导杀死100％的SS淋球菌24—1，杀死36％的唾液酸化(SR表型)淋球菌24—1，杀死29％的SR淋球菌WG(都携带2C7抗原决定基)。Ab1(以所用的任一浓度)不能杀死缺乏2C7 LOS抗原决定基的SR淋球菌(7IH)(图9)。
用CA1免疫诱导的Ab3抗体对小鼠和兔中淋球菌24—1的杀伤力均比用LOS免疫诱导的Ab3抗体高10倍。CA1免疫在小鼠和兔中均能引起对SR淋球菌WG的杀菌反应(图10)，但不能杀死淋球菌7IH(缺乏2C7抗原决定基的对照SR淋球菌，资料未显示)。
接受对照免疫原(无关鼠mAb IgMk和N，脑膜炎C型荚膜多糖[C—MCP])的动物免疫后的血清不含对任何SS或SR淋球菌的杀菌活性。(b)：调理吞噬活性(i)细菌的染色
未染色的淋球菌具有较低的荧光平均值(＜40)。用荧光黄染色同源细菌后，在FL1波道上的平均荧光值增加大约5倍，在FL3被道上大约增加3.5倍。当经生物素标记mAb 2C3用抗生蛋白链菌素藻红素(PE)—德克萨斯红(SAPETR)复染细菌后，FL3波道的荧光再示加1.5倍，而FL1波道不增加(图11)。这些结果表明，用SAPETR复染细菌不能使绿荧光饱和。换一种说法，尽管用SAPETR复染，荧光黄仍维持其在FL1波道中的平均荧光值。(ii)调理抗体Ab1(mAb 2C7)的效力
SS和SR淋球菌附着到PMN上
在0时，存在的细菌附着到PMN上但还未被吞噬。因此，所有存在的细菌经生物素标记的mAb 2C3被SAP ETR复染。0时显示的平均荧光值与荧光强度直接相关(例如，PMN的平均荧光值越高，附着到PMN上的细菌数目越大)。
在缺乏调理抗体的情况下，附着到PMN上和SS淋球菌(24—1)比SR淋球菌要多(比WG多34.91％，比7IH多38.10％。
用3种菌株测定了mAb 2C7(Ab1)调理对附着的影响。在实验中加入小鼠补体和SR和SS淋球菌来检查调理吞噬依赖于补体和抗体的能力。C5缺陷型补体在SS细菌中用于阻止膜攻击复合物(C56—9或MAC)的插入影响，但仍允许C3b和其衍生片段用作调理素。在用于本试验前用戊二醛固定的淋球菌吸附补体源以去掉特异性抗体。在对照实验中，用前将两种补体源加热到56℃处理30分钟。
mAb 2C7(Ab1)抗体对细菌附着到PMN上的影响如图12所示。用mAb 2C7调理的SS 24—1淋球菌与未调理的细菌相比吸附率提高40.2％。用mAb 2C7调理的SR淋球菌(WG)附着到PMN上的附着力与未调理的WG淋球菌相比提高了83.9％。缺乏2C7抗原决定基的SR淋球菌(7IH)对PMN的附着不受mAb2C7加入的影响。
补体仅仅少量增加携带2C7抗原决定基的调理的细菌对PMN的附着。C5缺陷型补体的加入导致SS淋球菌(24—1)的平均荧光值再增加7.89％SR淋球菌(WG)的平均荧光值再增加11.05％。然而，向SR淋球菌(WG)中加入全部补体与加入C5缺陷型补体相比，其对PMN附着效力的提高效率要高7.3％。
这些资料表明：i)mAb 2C7(Ab1)能单独提高携带2C7抗原决定基的细菌对PMN的附着力，ii)，补体的加入进一步提高附着力。
PMN对SS和SR淋球菌的吞噬作用
附着有细菌的PMN 37℃培养10，20，和30分钟。培养期间荧光黄产生的平均荧光值保持恒定，这表明细菌总数保持恒定且细菌的吞入并不影响荧光的发射。红色荧光的减少表明细菌被同化，因为它们未经生物素标记的2C3而被SAPETR标记(图13)。
未调理的SS淋球菌(24—1)在37℃下开始被迅速吞噬(在10分钟内吞噬10.17％)。但在30分钟的培养期间不发生进一步的吞噬。未调理的SR淋球菌(WG和7IH)在37℃下最补20分钟的培养期间不被吞噬。在20到30分钟之间，16.30％的WG淋球菌和22.02％的7IH淋球菌被吞噬。
当用Ab1调理时，SS淋球菌24—1最初比SR淋球菌WG以较快的速率被吞噬(37℃10分钟后24—1为12.95％，WG为7.07％)。到20分钟，吞噬相等(分别为28.64％和32.34％)。在30分钟时，24—1的吞噬增加到37.57％，而WG不再被吞噬。
当向试验混物中加入10％的C5缺陷型补体后，20分钟时对SS(24—1)和SR(WG)淋球菌的吞噬相当(分别为43.53％和40.01％)。30分钟时，对SS淋球菌的吞噬比SR淋球菌要多(分别为53.22％和39.43％)。然而，当向SR淋球菌中加入全部补体时，30分钟时的吞噬增加到53.94％。
为测定Ab1单独对吞噬的影响比较了调理的和未调理的细菌吞噬率的差别。37℃培养30分钟后，用Ab1调理对SS淋球菌的同化增加26.92％，对SR淋球菌(WG)的同化增加16.21％。活性补体源的加入进一步增强了对细菌的同化。用Ab1调理和加入补体都不能增强对缺乏2C7抗原决定基的SR淋球菌(7IH)的同化。(iii)调理抗体Ab3(免疫后的兔血清)的影响
SS和SR淋球菌对PMN的附着
当用免疫前的兔血清调理时，PMN对SS淋球菌(24—1)的附着力比对SR淋球菌WG和7IH要高(分别为51.67％和23.59％，图14)。当免疫后的免血清(Ab3)用作调理素时，与SR淋球菌WG和7IH相比，SS淋球菌(24—1)仍表现出对PMN更高的附着力(分别高出17.48％和27.91％)。比较免疫前和免疫后的免血清(Ab3)，用Ab3调理对SS淋球菌(24—1)的吞噬增加14.3％，对SR淋球菌增加47.56％。不管是否使用调理素，缺乏2C7抗原决定基的SR淋球菌(7IH)附着力无差别。
人PMN对SS和SR淋球菌的吞噬作用
调理过并附着到PMN上的细菌37℃培养10，20和30分钟(图15)。当免疫前的兔血清用作调理素时，SS淋球菌(24—1)仅被少量吞噬(9.13％)。当用免疫前兔血清调理时，两种SR淋球菌菌株均不被吞噬。
当Ab3(Ab2免疫后的兔血清)用作调理素时，37℃培养30分钟后，34.98％的SS淋球菌24—1和35.25％的SR淋球菌WG被吞噬。调理素不能诱导缺乏2C7抗原决定基的SR淋球菌(7IH)被吞噬。
这些资料表明：Ab2免疫诱导的外源性Ab3对2C7 OS抗原决定基的特异性导致推喧2C7抗原决定基的淋球菌的结合和同化增强。而且，吞噬率与在淋球菌用Ab1(mAb 2C7)调理后所见的相似或更好。单独用Ab1调理SS淋球菌(24—1)引起的吞噬率的增加为26.92％，而且Ab3增加34.98％(即，吞噬率大1.3倍)。单独用Ab1调理SR淋球菌(WG)引起的吞噬率的增加为16.21％，而用Ab3增加35.25％(增大2倍)。综合这些资料表明：对Ab2免疫的外源性Ab3反应对2C7 OS抗原决定基具有功能特性。因此，mAb CA1(Ab2)代表一种与名义上的淋球菌OS抗原决定基相似的Ab2β。
根据本发明生产抗个体基因型抗体的杂交瘤以培养物的形式于1993年3月26日保存在美国典型培养物收集中心(Rockville，Mary-land，U.S.A.)并命名为CAI。
这些培养物指定的ATCC保存号为HB11311。
尽管上文描述了本发明的一些实施方案，但很明显可使用本发明的方法和组合物改变我们的基本解释以提供其他的实施方案。因此，应意识到本发明的范围由后面附加的权利要求来限定而不是以上文提供的具体实施方案来限定。
引用的文献
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INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
(PCT Rule 13bis)
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
(PCT Rule 13bis)
Claims (19)
1.一种抗个体基因型单克隆抗体，或其片段，其特征为具有一个与第二抗体的个体基因型发生免疫特异性结合的抗原结合位点，而第二抗体与淋病奈瑟氏球菌的寡糖抗原决定基结合，该寡糖抗原决定基在人血型抗原中不存在。
2.根据权利要求1的抗个体基因型单克隆抗体，或其片段，其中的第二抗体与被单克隆抗体2C7识别的寡糖抗原决定基结合。
3.根据权利要求1的抗个体基因型单克隆抗体，或其片段，其中的第二抗体与被单克隆抗体识别的寡糖抗原决定基结合，该单克隆抗体由抗个体基因型单克隆抗体或其片段免疫哺乳动物来生产，该抗个体基因型单克隆抗体由具有保存于ATCC的HB 11311之特征的杂交瘤细胞系来生产。
4.一种抗个体基因型单克隆抗体，或其片段，由具有保存于ATCC的HB11311之特征的杂交瘤细胞系来生产。
5.根据权利要求1—4任一项的抗个体基因型单克隆抗体或其片段，其中的抗个体基因型单克隆抗体是一种重组抗体。
6.根据权利要求1—4中任一项的抗个体基因型单克隆抗体，或其片段，其中的抗个体基因型单克隆抗体是一种嵌合的重组抗体。
7.根据权利要求1—4中任一项的抗个体基因型单克隆抗体或其片段，其中的抗个体基因型单克隆抗体是一种人类化的重组抗体。
8.一种细胞、生产根据权利要求1—7中任一项的抗个体基因型单克隆抗体或其片段。
9.根据权利要求8的细胞，它是一种杂交瘤细胞。
10.根据权利要求9的细胞，它是保存于ATCC中的HB11311。
11.一种生产选自根据权利要求1—7中任一项的抗个体基因型单克隆抗体和片段的抗个体基因型单克隆抗体或其片段的方法，包括培养选自根据权利要求8—10的细胞。
12.根据权利要求11的方法，其中的细胞具有ATCC保存号HB11311。
13.一种预防淋病奈瑟氏球菌感染的组合物，包含免疫预防上有效量的根据权利要求1—7任一项的抗个体基因型单克隆抗体或其片段。
14.一种治疗淋病奈瑟氏球菌感染的组合物，包含免疫治疗上有效量的与根据权利要求1—7中任一项的抗个体基因型单克隆抗体或其片段发生反应的抗—抗个体基因型单克隆抗体或其片段。
15.一种诊断淋病奈瑟氏球菌感染的组合物，包含诊断上有效量的根据权利要求1—7任一项的抗个体基因型单克隆抗体，或其片段。
16.一种预防淋病奈瑟氏球菌感染的方法，包括给病人施用一种免疫预防上有效量的根据权利要求1—7中任一项的抗个体基因型单克隆抗体或其片段和一种药物上可接受的载体。
17.一种治疗淋病奈瑟氏球菌感染的方法，包括给病人施用一种免疫治疗上有效量的与根据权利要求1—7中任一项的抗个体基因型单克隆抗体或其片段发生反应的抗—抗个体基因型单克隆抗体或其片段以及一种药物上有活性的载体。
18.一种诊断淋病奈瑟氏球菌感染的方法，包括将病人的体液或组织样品与根据权利要求15的组合物相接触的步骤。
19.一种诊断淋病奈瑟氏球菌的方法，包括以下步骤：
(a)用可检测的标记物标记根据权利要求1—7中任一项的抗个体基因型单克隆抗体，或其片段；
(b)将抗免疫球蛋白抗体结合到固相支持物上；
(c)将生物学样品结合到固相支持物上；
(d)从固相支持物上去掉剩余的生物学样品；
(e)将可检测标记的抗体或其片段结合到固相支持物上；
(f)洗涤固相支持物；和
(g)测定固相支持物上标记物的存在。
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