CN112322685B - 液态发酵盾叶薯蓣制备薯蓣皂苷元的方法 - Google Patents

液态发酵盾叶薯蓣制备薯蓣皂苷元的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了液态发酵盾叶薯蓣制备薯蓣皂苷元的方法。该制备薯蓣皂苷元的方法包括用含有盾叶薯蓣的液态培养基培养镰孢属真菌，得到薯蓣皂苷元；所述镰孢属真菌为镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226。实验证明，采用本发明的液态发酵培养基，在28℃下液态发酵培养镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226 11天，薯蓣皂苷元的得率为2.48±0.21％。本发明可用于清洁生产薯蓣皂苷元。

Description

液态发酵盾叶薯蓣制备薯蓣皂苷元的方法
技术领域
本发明涉及液态发酵盾叶薯蓣制备薯蓣皂苷元的方法。
背景技术
薯蓣皂苷元(diosgenin，工业上称之为薯蓣皂素)是合成甾体激素药物的重要中间体，被誉为“药用黄金”，市场需求巨大。同时，薯蓣皂苷元具有抗癌、抗炎、抗病毒、抗皮肤老化、抗凝血和抗血栓等生理功能。我国是薯蓣皂苷元的出口大国，约占全球总产量的50％以上。我国特有药用植物——盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright，又名黄姜)是生产薯蓣皂苷元最主要的药源植物，薯蓣皂苷元也是盾叶薯蓣中最关键的活性物质，主要以C-3位糖基化的甾体皂苷的形式存在，含量最高的根状茎部位以薯蓣皂苷元计最高可达16％。盾叶薯蓣中95％以上的甾体皂苷被大量淀粉和纤维素包裹而存在于植物的细胞壁中，理论上彻底水解这些甾体皂苷即可得到薯蓣皂苷元。但是，植物细胞壁比较坚韧，以及甾体皂苷C-3位糖链的位阻效应，使薯蓣皂苷元的制备比较困难。
目前，工业上采用化学酸水解法生产薯蓣皂苷元，即：先用硫酸或盐酸水解，水解产物再经饱和碳酸钠溶液洗涤至中性，最后用汽油提取薯蓣皂苷元。酸水解法存在的主要问题是：大量的淀粉及纤维素没有得到综合利用，其水解导致滤液的化学需氧量(COD)显著增高，所得水解产物直接用水反复洗涤至中性，从而导致严重的环境污染和水污染。近年来，研究人员进行了一系列的技术改进，主要包括预发酵法、淀粉- 纤维素分离法、酶解发酵法、阶梯生物催化协同提取法、糖化-膜回收法、酶解与二氧化碳超临界萃取偶联法等。然而，这些方法依然无法摆脱酸水解，其造成的大量废水、废酸及副产物对环境的污染不可避免，应用前景有限。因此，国家和地方政府积极支持攻克薯蓣皂苷元可持续洁净生产的难题，如何从源头根治污染是薯蓣皂苷元产业化持续发展亟待解决的问题，寻找零污染、无酸化生产薯蓣皂苷元的方法将是今后薯蓣皂苷元生产工艺改进的一个必然方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何通过液态发酵高效地制备薯蓣皂苷元，即如何提高液态发酵制备薯蓣皂苷元的得率。
为了解决以上技术问题，本发明提供了制备薯蓣皂苷元的方法。
本发明所提供的制备薯蓣皂苷元的方法，包括用含有盾叶薯蓣的液态培养基培养镰孢属真菌，得到薯蓣皂苷元；所述镰孢属真菌为镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC400226。
上述方法中，所述液态培养基由麸皮、KH2PO4、Na2HPO4、盾叶薯蓣、Tween-80和水组成。
上述方法中，所述麸皮可为小麦麸皮。
所述液态培养基中，小麦麸皮的含量可为16-24g/L、Na2HPO4的含量可为1.6-2.4g/L、KH2PO4的含量可为6.4-9.6g/L、盾叶薯蓣的含量可为25-35g/L、Tween-80的含量可为1.5-2.5g/L。
所述液态培养基中，小麦麸皮的含量具体可为21g/L，Na2HPO4的含量具体可为2.1g/L、KH2PO4的含量具体可为8.4g/L，盾叶薯蓣的含量具体可为26.5g/L、Tween-80 的含量具体可为1.9g/L。
上述方法中，所述盾叶薯蓣可为盾叶薯蓣根状茎。所述液态培养基中，除水以外的其它成分的质量均是以干重计。所述液态培养基中的水可为蒸馏水。所述液态培养基的pH自然即可。
上述方法中，所述培养可为在19-37℃、培养1-16天。
上述方法中，所述培养具体可为在28℃、培养11天。
上述方法中，所述培养可为振荡培养，所述振荡培养的转速可为200rpm，所述振荡培养的旋转力臂半径可为5cm。
为了解决以上技术问题，本发明提供了用于生产薯蓣皂苷元的培养基。
本发明所提供的用于生产薯蓣皂苷元的培养基为上述液态培养基。
为了解决以上技术问题，本发明提供了用于生产薯蓣皂苷元的液态发酵条件。
本发明所提供的用于生产薯蓣皂苷元的液态发酵条件为上述液态发酵条件。
为了解决以上技术问题，本发明提供了镰孢属真菌的应用。
本发明所提供的镰孢属真菌的应用为镰孢属真菌在液态发酵生产薯蓣皂苷元中的应用，所述镰孢属真菌为镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226。
为了产业化，对液态发酵培养基和发酵条件进行优化，得到了可以产业化的液态发酵培养基和最佳液态发酵条件。本发明运用响应面优化法，对7种因素进行 Plackett-Burman设计筛选得到3个显著因素，并对其进行Box-Behnken设计实验，利用Design-Expert8分析软件进行回归分析得到液态培养基的最优组合。同时对发酵条件进行了优化，对8种因素进行Plackett-Burman设计筛选得到3个显著因素，并对其进行中心复合设计(CentralComposite Design)实验，利用Design-Expert 8 分析软件进行回归分析得到液态发酵条件的最优组合。得到了薯蓣皂苷元得率高的液态发酵镰孢菌制备薯蓣皂苷元的方法。实验证明，采用本发明的液态发酵培养基，在 28℃、液态发酵培养镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226 11天薯蓣皂苷元的得率为2.48±0.21％。本发明可用于清洁生产薯蓣皂苷元。
附图说明
图1为HPLC鉴定薯蓣皂苷元的图谱。
图中，A为薯蓣皂苷元标准品图谱，B为实施例1中2.1的镰孢属菌种(Fusariumsp.) CPCC 400226发酵液的HPLC图谱，C为2.2的镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400709发酵液的HPLC图谱，D为2.3的镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400712发酵液的 HPLC图谱。薯蓣皂苷元的色谱峰如箭头所示，横坐标为保留时间(min)。
图2为培养基优化的响应面图。
图中，A是小麦麸皮(WHB)和KH2PO4-Na2HPO4(PS)的3-D响应面图，B是小麦麸皮(WHB)和Tween-80的3-D响应面图，C是KH2PO4-Na2HPO4(PS)和Tween-80的3-D 响应面图。
图3为发酵条件优化的响应面图。
图中，A是发酵温度和发酵周期的3-D响应面图，B是发酵温度和盾叶薯蓣浓度的3-D响应面图，C是发酵周期和发酵周期的3-D响应面图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400709已于2015年7月6日收藏于中国医学科学院医药生物技术研究所的中国药学微生物菌种保藏管理中心 (ChinaPharmaceutical Culture Collection，简称CPCC，地址：北京天坛西里1 号，中国医学科学院医药生物技术研究所，邮政编码：100050)，自该收藏日起公众可从CPCC获得该菌株。
下述实施例中的镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400712已于2015年7月6日收藏于中国医学科学院医药生物技术研究所的中国药学微生物菌种保藏管理中心 (ChinaPharmaceutical Culture Collection，简称CPCC，地址：北京天坛西里1 号，中国医学科学院医药生物技术研究所，邮政编码：100050)，自该收藏日起公众可从CPCC获得该菌株。
下述实施例中的镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226已于2007年2月1日收藏于中国医学科学院医药生物技术研究所的中国药学微生物菌种保藏管理中心(ChinaPharmaceutical Culture Collection，简称CPCC，地址：北京天坛西里1 号，中国医学科学院医药生物技术研究所，邮政编码：100050)，自该收藏日起公众可从CPCC获得该菌株。
下述实施例中的薯蓣皂苷元标准品为中国食品药品检定研究院产品，产品编号：111539；Tween-80为北京索莱宝科技有限公司产品，其它试剂均为分析纯国产市售试剂。
实施例1、液态发酵镰孢属菌种制备薯蓣皂苷元
1、本实施例所用的培养基的配制
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)：马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，煮沸混匀，121℃条件下灭菌20min，得到PDA培养基。
种子液培养基：种子液培养基(PDB培养基)：马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，蒸馏水定容到1000mL，煮沸混匀， 121℃条件下灭菌20min，得到PDB培养基。
液态发酵培养基(含有盾叶薯蓣的培养基)：将21g小麦麸皮，2.1g Na2HPO4， 8.4gKH2PO4，26.5g盾叶薯蓣根状茎，1.9g Tween-80，pH自然，蒸馏水定容到1000 mL。121℃灭菌20min，得到液态发酵培养基。其中，盾叶薯蓣根状茎是将干燥的盾叶薯根状茎，粉碎后过60目筛得到的粉状物，常温密封保存备用。
2、液态发酵制备薯蓣皂苷元
本发明的发明人在实验过程中发现，镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226、镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400709和镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400712 在液态发酵培养基中28℃、200rpm的恒温振荡培养器中培养11天的薯蓣皂苷元的得率最高，所以下述三种液态发酵制备薯蓣皂苷元的方法中，发酵的时间均设为11天。下述三种液态发酵制备薯蓣皂苷元的方法为平行实验，这些平行实验的区别仅在于所用的镰孢属菌种不同。这三种液态发酵制备薯蓣皂苷元的方法具体如下：
2.1利用镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226液态发酵制备薯蓣皂苷元(CPCC400226处理)
实验重复3次，每次重复的方法如下：将镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226悬浮液均匀涂布于PDA斜面培养基上，于30℃生化培养箱中静置培养7天，无菌环境中用无菌水从PDA斜面上洗下菌种，接种到已灭菌装有25mL PDB培养基的125mL 三角瓶中，于30℃、200rpm的恒温振荡培养器中培养48h得到镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226种子液。将镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226种子液以5％(v/v) 的接种量接种到已灭菌装有25mL液态发酵培养基的125mL三角瓶中，于28℃、200 rpm的恒温振荡培养器(旋转力臂半径为5cm)中培养11天，得到镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226发酵液。共得到9瓶镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226发酵液。
2.2利用镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400709液态发酵制备薯蓣皂苷元(CPCC400709处理)
实验重复3次，每次重复的方法如下：将镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400709悬浮液均匀涂布于PDA斜面培养基上，于30℃生化培养箱中静置培养7天，无菌环境中用无菌水从PDA斜面上洗下菌种，接种到已灭菌装有25mL PDB培养基的125mL 三角瓶中，于30℃、200rpm的恒温振荡培养器中培养48h得到镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400709种子液。将镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400709种子液以5％(v/v) 的接种量接种到已灭菌装有25mL液态发酵培养基的125mL三角瓶中，于28℃、200 rpm的恒温振荡培养器(旋转力臂半径为5cm)中培养11天，得到镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400709发酵液。共得到9瓶镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400709发酵液。
2.3利用镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400712液态发酵制备薯蓣皂苷元(CPCC400712处理)
实验重复3次，每次重复的方法如下：将镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400712悬浮液均匀涂布于PDA斜面培养基上，于30℃生化培养箱中静置培养7天，无菌环境中用无菌水从PDA斜面上洗下菌种，接种到已灭菌装有25mL PDB培养基的125mL 三角瓶中，于30℃、200rpm的恒温振荡培养器中培养48h得到镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400712种子液。将镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400712种子液以5％(v/v) 的接种量接种到已灭菌装有25mL液态发酵培养基的125mL三角瓶中，于28℃、200 rpm的恒温振荡培养器(旋转力臂半径为5cm)中培养11天，得到镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400712发酵液。共得到9瓶镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400712发酵液。
3.测定薯蓣皂苷元的得率
3.1发酵液的预处理
将发酵液经4,000g离心30min，沉淀于80℃下干燥至恒重后，分别用100mL、 80mL和50mL乙酸乙酯在93℃恒温水浴条件下提取3h，每次1h，合并乙酸乙酯并离心浓缩回收，所得残渣用100mL甲醇溶解，得到待测样品溶液。
3.2转化产物中薯蓣皂苷元的含量分析
采用HPLC法测定分析待测样品溶液中薯蓣皂苷元的含量。取薯蓣皂苷元标准品，用甲醇溶解定容，得到标准品溶液。根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法 (外标法)进行定量分析薯蓣皂苷元。具体方法如下：待测样品溶液和标准品溶液过0.22μm滤膜，进行HPLC分析，计算薯蓣皂苷元的得率：薯蓣皂苷元的得率＝发酵液中薯蓣皂苷元的含量(g/L)/液态发酵培养基中盾叶薯蓣根状茎的含量(g/L)× 100％。
HPLC色谱条件如下：安捷伦Agilent 1290高效液相色谱仪，配有ELSD检测器和Chemstation色谱工作站；安捷伦XDB-C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；用乙腈水溶液(由乙腈和水组成的液体)梯度洗脱，流速1mL/min；柱温30℃；进样量10μL。洗脱程序0-14min(30-60％乙腈)→14-20min(60-91％乙腈)→20-32min(91％乙腈)。也就是用乙腈水溶液进行三步洗脱，第一步洗脱的乙腈水溶液中乙腈的浓度在 14分钟内由30％线性升至60％，第二步洗脱的乙腈水溶液中乙腈的浓度在6分钟内由 60％线性升至91％，第三步洗脱的乙腈水溶液中乙腈的浓度为91％，洗脱12分钟。
4.统计分析
数据以平均值±SEMs表示，并通过单因素方差分析进行分析。具体为采用Office2016和Design-Expert 8以确定差异，P<0.05被认为差异显著。
结果表明，2.1-2.3这3个处理中均有薯蓣皂苷元的产生(图1)，镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226液态发酵所得薯蓣皂苷元的得率为2.48±0.21％；镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400709液态发酵所得薯蓣皂苷元的得率为2.16±0.37％；镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400712液态发酵所得薯蓣皂苷元的得率为0.85± 0.18％(表1)；在薯蓣皂苷元的得率上，利用镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226 液态发酵制备薯蓣皂苷元的得率最高，显著高于其它两个处理。
表1、各处理薯蓣皂苷元的得率
Figure BDA0002769776910000061
注：CPCC 400226处理组和其它处理组进行统计学分析，**示P<0.01。
实施例2、微生物转化黄姜制备薯蓣皂苷元液态发酵培养基的优化
上述实施1例采用的液态发酵培养基是通过以下优化实验得到的。
本研究以镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226为实验菌株，以薯蓣皂苷元的得率为指标，通过活性微生物介导的生物转化，运用响应面优化法，对7种因素进行Plackett-Burman设计筛选得到3个显著因素，并对其进行Box-Behnken设计实验，利用Design-Expert 8分析软件进行回归分析得到最优组合。
具体如下：
1实验材料与方法所涉及实验材料、培养方法和分析方法同实施例1。
2实验设计方法
2.1Plackett-Burman设计实验以薯蓣皂苷元得率为响应值，采用 Plackett-Burman两水平法对Tween-80、复合维生素、复合氨基酸、微量元素PTM4、酵母提取粉、小麦麸皮和KH2PO4-Na2HPO4等7个因素进行考察，筛选出对薯蓣皂苷元得率有显著作用的因素
2.2响应面设计实验采用三因素三水平实验，对显著性因素的中心点进行 Box-Behnken设计，实验因素水平及编码如表2所示。
表2.Box-Behnken设计实验因素水平及编码
Figure BDA0002769776910000071
2.3数据分析采用Design-Expert 8(试用版)统计分析软件进行多元二次回归模型方程的建立及方差分析，P<0.05被认为差异显著，通过响应值优化程序获得当响应面值最大时发酵培养基中各关键营养成分的最优水平。
3结果与分析
3.1显著性营养成分Plackett-Burman设计结果和分析选取实验次数为12(n＝12)的Plackett-Burman设计，每个因素取高(+)和低(-)两个水平，响应值为薯蓣皂苷元得率(Y)。Plackett-Burman设计矩阵与实验结果显示，薯蓣皂苷元的得率介于0.13％-2.34％。各因素的显著性分析(ANOVA)结果表明，总模型的F值和P值分别是47.11和0.0011，说明模型具有极显著性(P<0.01)，可对本研究模拟进行较好地解释；模型方差分析的可信度判定系数R2和校正判定系数R2分别为0.9880和 0.9670，说明该模型与实验数据的拟合程度高，测量值与真实值具有较高的相关性，应用于实际预测后误差也较小。其中，小麦麸皮、KH2PO4-Na2HPO4和Tween-80这3个因素对薯蓣皂苷元得率具有显著影响，结果显示，小麦麸皮和KH2PO4-Na2HPO4对镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226液态发酵盾叶薯蓣制备薯蓣皂苷元具有极显著性影响，Tween-80呈现显著性影响，
3.2显著性营养成分Box-Behnken设计结果和分析以薯蓣皂苷元得率为响应值(Y)，以小麦麸皮(X1)、KH2PO4-Na2HPO4(X2)和Tween-80(X3)为影响因素，进行3 个中心点、实验次数为15(n＝15)的Box-Behnken设计实验，每个因素取高(+1)、中(0)和低(-1)三个水平。Box-Behnken设计矩阵与实验结果表明，薯蓣皂苷元的得率介于0.46％-2.45％。回归模型显著性检验和方差分析结果表明，发酵培养基组成优化模型的F值为972.05，P值<0.001，说明该模型是极显著的，可靠性高。可信度判定系数R2和校正判定系数R2均大于75％，分别达到0.9994和0.9984，这表明99.94％实验数据可用此模型解释，只有0.0016％的变化不能由该模型解释。失拟项P值为 0.6016，不显著，说明该模型不存在失拟因素，能够很好地模拟发酵情况。在各模型参数中，X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X12和X22对薯蓣皂苷元得率的影响显著，其余各自的交互项和二次方项对薯蓣皂苷元得率的影响不显著。
3.3显著性因素的交互作用及分析以两两交互的三维响应面图和二维等高线图分析和评价对影响CPCC 400226液态发酵盾叶薯蓣制备薯蓣皂苷元的任何两种因素的交互效应，并确定最佳因素水平范围。如图2所示，小麦麸皮与Tween-80交互影响最为显著，其次为小麦麸皮与KH2PO4-Na2HPO4，KH2PO4-Na2HPO4与Tween-80的交互作用 不显著。随着发酵培养基中小麦麸皮浓度的增加，薯蓣皂苷元的得率先快速增加然后缓慢降低；随着发酵培养基中KH2PO4-Na2HPO4浓度的增加，薯蓣皂苷元的得率缓慢增加；随着发酵培养基中Tween-80浓度的增加，薯蓣皂苷元的得率先缓慢增加然后缓慢降低。预测得最佳发酵培养基组成是20.9g/L小麦麸皮、8.4g/L KH2PO4-Na2HPO4和1.9 g/L Tween-80。
实施例3、微生物转化黄姜制备薯蓣皂苷元液态发酵条件的优化
上述实施例1采用的液态发酵条件是通过以下优化实验得到的。
本研究以镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226为实验菌株，以薯蓣皂苷元的得率为指标，通过活性微生物介导的生物转化，运用响应面优化法对8种因素进行Plackett-Burman设计筛选得到3个显著因素，并对其进行中心复合设计实验，利用Design-Expert 8(试用版)分析软件进行回归分析得到最优组合。
具体如下：
1实验材料与方法所涉及实验材料、培养方法和分析方法同实施例1.
2实验设计方法
2.1Plackett-Burman设计实验以薯蓣皂苷元得率为响应值，采用 Plackett-Burman两水平法对小麦麸皮、黄姜、KH2PO4、转速、pH、发酵温度、发酵周期和接种量等8个因素进行考察，筛选出对薯蓣皂苷元得率有显著作用的因素
2.2响应面设计实验采用三因素三水平实验，对显著性因素的中心点进行中心组合设计，实验因素水平及编码如表3所示。
表3.中心复合设计实验因素水平及编码
Figure BDA0002769776910000091
2.3数据分析采用Design-Expert 8(试用版)统计分析软件进行多元二次回归模型方程的建立及方差分析，P<0.05被认为差异显著，通过响应值优化程序获得当响应面值最大时液态发酵条件的最优水平。
3结果与分析
3.1显著性营养成分Plackett-Burman设计结果和分析选取实验次数为12(n＝12)的Plackett-Burman设计，每个因素取高(+)和低(-)两个水平，响应值为薯蓣皂苷元得率(Y)。Plackett-Burman设计矩阵与实验结果显示，薯蓣皂苷元的得率介于 0.12％-2.15％。各因素的显著性分析(ANOVA)表明，模型具有极显著性(P<0.01)，模型与实验数据的拟合程度高，测量值与真实值具有较高的相关性，应用于实际预测后误差也较小。其中，发酵温度、发酵周期和盾叶薯蓣浓度对薯蓣皂苷元得率具有显著影响。结果显示，发酵温度对镰孢属菌种(Fusarium sp.)CPCC 400226液态发酵盾叶薯蓣制备薯蓣皂苷元具有极显著性影响，发酵周期和盾叶薯蓣浓度呈现显著性影响，
3.2显著性营养成分中心复合设计结果和分析以薯蓣皂苷元得率为响应值(Y)，以发酵温度(X1)、发酵时间(X2)和盾叶薯蓣浓度(X3)为影响因素，进行实验次数为20(n＝20)的中心复合设计实验，每个因素取高(+1)、中(0)和低(-1)三个水平。中心复合设计矩阵与实验结果表明，薯蓣皂苷元的得率介于0.02％到2.42％。回归模型显著性检验和方差分析结果表明，该模型是极显著的，可靠性高，可信度判定系数R2和校正判定系数R2均大于75％，这表明实验数据可用此模型解释，失拟项P值不显著，说明该模型不存在失拟因素，能够很好地模拟发酵情况。在各模型参数中，线性系数(X1，X2，X3)，交互系数(X1X2，X1X3，X2X3)，二次方系数(X12，X22，X32) 具有显著性差异。
3.3显著性因素的交互作用及分析以两两交互的三维响应面图和二维等高线图分析和评价对影响CPCC 400226液态发酵盾叶薯蓣制备薯蓣皂苷元的任何两种因素的交互效应，并确定最佳因素水平范围。如图3所示，两两之间的交互作用显著。随着发酵温度的增加，薯蓣皂苷元的得率先增加然后降低；周期的增加，薯蓣皂苷元的得率先快速增加然后缓慢降低；随着发酵培养基中黄姜浓度的降低，薯蓣皂苷元的得率先缓慢增加然后趋于恒定。最佳液态发酵条件为：发酵温度28.2℃，发酵周期10.9 天，盾叶薯蓣浓度26.5g/L。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (2)

1.制备薯蓣皂苷元的方法，其特征在于：所述方法包括用含有盾叶薯蓣的液态培养基培养镰孢属真菌，得到薯蓣皂苷元；所述镰孢属真菌为镰孢属菌种(Fusarium sp.) CPCC400226；所述液态培养基由麸皮、Na2HPO4、KH2PO4、盾叶薯蓣、Tween-80和水组成，所述麸皮为小麦麸皮；所述液态培养基中，小麦麸皮的含量为16-24 g/L、Na2HPO4 1.6-2.4 g/L、KH2PO4的含量为6.4-9.6 g/L、盾叶薯蓣的含量为25-35 g/L、Tween-80的含量为1.5-2.5g/；所述培养为在28 ℃、培养11天。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液态培养基中，小麦麸皮的含量为21g/L、Na2HPO4的含量为2.1 g/L、KH2PO4的含量为8.4 g/L、盾叶薯蓣的含量为26.5 g/L、Tween-80的含量为1.9 g/L。
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