CN112121049B - 顺式阿曲库铵在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及性功能药物技术领域，为开发新的治疗男性性腺功能减退症的途径，公开了顺式阿曲库铵在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用，并且同时公开了顺式阿曲库铵在制备对抗尼古丁引起的男性性腺功能低下副作用的药物中的应用、顺式阿曲库铵在制备提高体内睾酮含量的药物中的应用。本发明中，顺式阿曲库铵具有刺激生物体睾丸间质细胞睾酮合成的能力，对血清和/或睾丸中睾酮偏低具有改善或治疗作用，同时对尼古丁引起的男性性腺功能低下副作用具有保护作用，同时顺式阿曲库铵经过临床麻醉使用已经被证明是安全、低副作用的，因此与现有睾酮注射法相同，提供了新的改善男性性腺功能减退症的途径。

Description

顺式阿曲库铵在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的 应用

技术领域

本发明涉及性功能药物技术领域，具体涉及顺式阿曲库铵在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用。

背景技术

男性性腺功能减退症是由于雄性激素缺乏、减少或其作用不能发挥所导致的性功能减退性疾病。睾丸间质细胞主要功能是合成睾酮，是雄性体内雄激素的最主要来源。成年睾丸间质细胞激素合成分泌功能减退会导致体内雄激素缺乏。目前，临床上治疗性腺功能减退症主要通过睾酮补充疗法，然而，该疗法除了需要定期注射睾酮以外，还存在显著的安全性问题。首先，长期定量补充睾酮会使患者易生痤疮并患红细胞增多症；其次，容易造成血清睾酮浓度的大幅度波动，进而引起患者情绪和迟发性性腺功能低下综合征症状的明显起伏；再次，患者容易出现水、钠潴留及阴茎异常勃起、排尿困难等不良反应，甚至肝肾功能受损及引发前列腺癌等疾病。因此非常有必要研究开发新的治疗男性性腺功能减退症的途径。

发明内容

为开发新的治疗男性性腺功能减退症的途径，本发明公开了顺式阿曲库铵在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用，可以有效改善男性性腺功能减退症，且保证安全性。

本发明的另一目的在于提供顺式阿曲库铵在制备对抗尼古丁引起的男性性腺功能低下副作用的药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供顺式阿曲库铵在制备提高体内睾酮含量的药物中的应用。

本发明提供如下的技术方案：

顺式阿曲库铵在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用。

顺式阿曲库铵目前在临床上主要作为麻醉辅助剂使用，放松骨骼肌，获得外科手术所需的肌肉松弛度，在体内可经霍夫曼消除快速代谢，并肾脏排出代谢产物，作用时间不受肝肾功能的影响，重复给药无明显蓄积作用，因此安全性能高，在大剂量给药后不会引起血浆组胺浓度变化和心血管副作用。睾丸间质细胞是睾丸合成雄性激素的主要场合。发明人在研究中发现，睾丸间质细胞的表面具有α4型的烟碱乙酰胆碱受体，该受体可通过与乙酰胆碱的结合抑制睾丸间质细胞合成雄性激素，从而使睾丸以及体内的雄性激素水平含量降低，引发男性性腺功能减退症。而顺式阿曲库铵可与α4型的烟碱乙酰胆碱受体nAChR结合，抑制α4型的烟碱乙酰胆碱受体去极化，避免烟碱乙酰胆碱受体与乙酰胆碱结合，从而切断下游级联反应，提高患者睾丸和血清中睾酮含量，达到显著治疗男性性腺功能减退症的作用。

同时对于本申请中所说的药物，进一步的解释说明如下：

在本发明中，所称的“药物”是指可以用于预防或治疗某种疾病的单一化合物、多种化合物形成的组合物、中药材及其提取物，或指以单一化合物为主要活性成分的组合物或制剂，还指由多种化合物为活性成分的组合物或制剂。“药物”应理解为不仅指根据一国之法律规定，通过其设立的行政机构审批并准予生产的产品，还指在为了获得通过审批和准予生产的过程中，所形成的含单一化合物为活性成分的各类物质形态。“形成”应理解为通过化学合成、生物转化或购买等途径获得。

所述药物包括各种与所含化合物相适应的药物辅料，以制成有利于给药的剂型，如：但不仅限于水溶液注射剂、粉针剂、丸剂、散剂、片剂、贴剂、栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂和控释剂等。这些药用辅料既可以是各种制剂中常规使用的，如：但不仅限于等渗剂、缓冲液、矫味剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂等；也可以是为了与所述物质相适应而选择使用的，如：乳化剂、增溶剂、抑菌剂、止痛剂和抗氧剂等，这类辅料能有效提高组合物所含化合物的稳定性和溶解性或改变化合物的释放速率和吸收速率等，从而改善各种化合物在生物体内的代谢，进而增强组合物的给药效果。此外，还可以为实现特定的给药目的或方式，如：缓释给药、控释给药和脉冲给药等，而使用的辅料，如：但不仅限于明胶、白蛋白、壳聚糖、聚醚和聚酯类高分子材料，如：但不仅限于聚乙二醇、聚氨酯、聚碳酸酯及其共聚物等。所称“有利于给药”的主要表现有：但不仅限于提高治疗效果、提高生物利用度、降低毒副作用和提高患者顺应性等。

在水溶液注射剂中，辅料一般包括等渗剂和缓冲液，以及必要的乳化剂(如：Tweeen-80、Pluronic和Poloxamer等)、增溶剂和抑菌剂等。此外，还包括含有药学上可接受的其它药用辅料，如：抗氧剂、pH调节剂和止痛剂等。用于制取口服液体制剂的辅料一般包括溶剂，以及必要的矫味剂、抑菌剂、乳化剂和着色剂等。用于制取片剂的辅料一般包括填充剂(如：淀粉、糖粉、糊精、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙和甘露醇等)、粘合剂(如：乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶溶液、蔗糖溶液和聚乙烯吡咯烷酮的水溶液或醇溶液等)、崩解剂(如：干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠)和润滑剂(如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇4，000、聚乙二醇6，000和月桂醇硫酸镁等)等。用于制取乳剂的辅料一般为水、油(如：脂肪酸)、乳化剂，以及必要的防腐剂和矫味剂等。用于制取颗粒剂的辅料与片剂类似，但造粒过程不同。根据需要，将制得的颗粒剂与助流剂混合后装入胶囊即得胶囊剂。

作为本发明的优选，所述男性性腺功能减退症是由于雄性激素缺乏、减少或作用不能发挥所导致的性功能减退性疾病。

作为本发明的优选，所述雄性激素至少为睾酮、雄烯二酮和去氢表雄酮中的一种。

作为本发明的优选，所述雄性激素为睾酮。

作为本发明的优选，所述雄性激素缺乏、减少或作用不能发挥由包括但不限于可使睾丸间质细胞表面的烟碱乙酰胆碱受体特异性结合乙酰胆碱的尼古丁或洛贝林引起。尼古丁或者洛贝林等可与α4型的烟碱乙酰胆碱受体nAChR特异性结合，使烟碱乙酰胆碱受体去极化，强化烟碱乙酰胆碱受体与乙酰胆碱的结合作用，从而加剧男性性腺功能减退症。而顺式阿曲库铵可以与尼古丁竞争性结合α4型的烟碱乙酰胆碱受体，避免尼古丁引起的烟碱乙酰胆碱受体去极化，削弱α4型烟碱乙酰胆碱受体与乙酰胆碱的结合，从而改善男性性腺功能减退症。

作为本发明的优选，顺式阿曲库铵在睾丸内的浓度≥睾丸内的尼古丁的浓度。

顺式阿曲库铵在制备对抗尼古丁引起的男性性腺功能低下副作用的药物中的应用。顺式阿曲库铵不仅能够有效防止α4型烟碱乙酰胆碱受体与乙酰胆碱的结合，同时还能够逆转尼古丁对睾丸间质细胞雄性激素合成的抑制作用，从而增加睾丸和/或血清中睾酮含量，最终改善或者治愈因尼古丁引起的男性性腺功能低下。

作为本发明的优选，顺式阿曲库铵在睾丸内的浓度≥睾丸内的尼古丁的浓度。当顺式阿曲库铵在睾丸内的浓度不低于睾丸内的尼古丁的浓度，且尼古丁的浓度≥50μM时，顺式阿曲库铵对尼古丁引起的男性性腺功能低下副作用的对抗效果明显增强。

顺式阿曲库铵在制备提高体内睾酮含量的药物中的应用。顺阿曲库铵通过结合α4型烟碱乙酰胆碱受体避免睾丸间质细胞合成雄性激素的作用受抑制，从而提高体内睾酮等雄性激素的量，需要说明的是，这里所说的体内包括睾丸内和血清内。

作为本发明的优选，所述顺式阿曲库铵在睾丸内的浓度≥5uM。

本发明的有益效果如下：

本发发明提供了顺式阿曲库铵在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用，不仅可以提高体内睾酮含量，而且能够逆转尼古丁等引起的男性性腺功能低下副作用，同时顺式阿曲库铵经过临床麻醉使用已经被证明是安全、低副作用的，因此与现有睾酮注射法相同，提供了新的改善男性性腺功能减退症的途径。

附图说明

图1是实施例1中顺式阿曲库铵与尼古丁不同用药方式下的大鼠成年睾丸间质细胞分泌睾酮的结果。

图2是实施例2中顺式阿曲库铵与洛贝林不同用药方式下的大鼠成年睾丸间质细胞分泌睾酮的结果。

图3是实施例3～4中不同顺式阿曲库铵用药量时的睾丸间质细胞分泌睾酮的结果，

图4是睾丸间质细胞表面存在烟碱乙酰胆碱受体的验证结果。

具体实施方式

下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。

如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。

实施例1

顺式阿曲库铵在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用，以顺式阿曲库铵对抗尼古丁对大鼠成年睾丸间质细胞合成睾酮的抑制作用为例说明。

取雄性Sprague-Dawley大鼠(90日龄)7只，二氧化碳处死后，将睾丸取出，提取并纯化大鼠成年睾丸间质细胞置于LCM培养基中培养，并如下分组：

1)以生理盐水处理为空白对照组；

2)以50μM顺式阿曲库铵的生理盐水溶液处理为顺式阿曲库铵组；

3)以50μM尼古丁的生理盐水溶液处理为尼古丁组；

4)以50μM尼古丁和50μM顺式阿曲库铵的生理盐水溶液处理为联合组1，测定上述各组药物治疗12小时后培养基中的睾酮水平，结果见图1所示。

图1中，数据均用平均值±标准误表示，样本量为4；相似的字母表示两组之间在P＜0.05时无差异。

从图1可以看出，通过尼古丁组(c)与空白对照组(a)对比可知，尼古丁可以显著抑制睾丸间质细胞分泌睾酮的水平；通过顺式阿曲库铵组(b)与空白对照组(a)对比可知，顺式阿曲库铵可以提高睾丸间质细胞分泌睾酮的水平；通过联合组1(ac)与尼古丁组(c)对比可知，顺式阿曲库铵可以逆转尼古丁引起的睾酮水平分泌低下，从而明显改善男性性腺功能减退症以及对抗尼古丁引起的男性性腺功能低下副作用。

所以，该实施例也可证明顺式阿曲库铵在制备对抗抗尼古丁引起的男性性腺功能低下副作用的药物中的应用。

实施例2

顺式阿曲库铵在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用，以顺式阿曲库铵对抗洛贝林对大鼠成年睾丸间质细胞合成睾酮的抑制作用为例说明。

取雄性Sprague-Dawley大鼠(90日龄)7只，二氧化碳处死后，将睾丸取出，提取并纯化大鼠成年睾丸间质细胞置于LCM培养基中培养，并如下分组：

1)以生理盐水处理为空白对照组；

2)以50μM顺式阿曲库铵的生理盐水溶液处理为顺式阿曲库铵组；

3)以50μM洛贝林的生理盐水溶液处理为洛贝林组；

4)以50μM洛贝林和50μM顺式阿曲库铵的生理盐水溶液处理为联合组2，

测定上述各组药物治疗12小时后培养基中的睾酮水平，结果见图2所示。

图2中，数据均用平均值±标准误表示，样本量为4；相似的字母表示两组之间在P＜0.05时无差异。

从图2可知，通过洛贝林组(c)与空白对照组(a)对比可知，洛贝林可以显著抑制睾丸间质细胞分泌睾酮的水平；通过顺式阿曲库铵组(b)与空白对照组(a)对比可知，顺式阿曲库铵可以提高睾丸间质细胞分泌睾酮的水平；通过联合组2(c)与洛贝林组(c)对比可知，顺式阿曲库铵可以一定程度的改善洛贝林引起的男性性腺功能减退症，但是在测试浓度下显著性不高。

实施例3

顺式阿曲库铵在制备提高体内睾酮含量的药物中的应用，以顺式阿曲库铵提高大鼠成年睾丸间质细胞合成睾酮的作用为例说明。

取雄性Sprague-Dawley大鼠(90日龄)7只，二氧化碳处死后，将睾丸取出，提取并纯化大鼠成年睾丸间质细胞置于LCM培养基中培养，并如下分组：

1)以生理盐水处理为空白对照组；

2)以5μM顺式阿曲库铵的生理盐水溶液处理；

3)以10μM顺式阿曲库铵的生理盐水溶液处理；

4)以50μM顺式阿曲库铵的生理盐水溶液处理；

测定上述各组药物治疗12小时后培养基中的睾酮水平，结果见图3(a)所示。

图3(a)中，数据均用平均值±标准误表示，样本量为4。“*，**，***”分别表示P＜0.05、0.01、0.001。

从图3(a)可知，与空白对照组相比，当顺式阿曲库铵浓度为5μM时，可以一定程度的促进大鼠成年睾丸间质细胞的睾酮分泌，但是显著性不高，而当顺式阿曲库铵铵浓度≥10μM时，能够明显促进大鼠成年睾丸间质细胞的睾酮分泌。

实施例4

顺式阿曲库铵在制备提高体内睾酮含量的药物中的应用，以顺式阿曲库铵提高小鼠睾丸间质瘤细胞合成睾酮的作用为例说明。

取雄性小鼠(90日龄)7只，二氧化碳处死后，将睾丸取出，提取并纯化小鼠睾丸间质瘤细胞置于LCM培养基中培养，并如下分组：

1)以生理盐水处理为空白对照组；

2)以5μM顺式阿曲库铵的生理盐水溶液处理；

3)以10μM顺式阿曲库铵的生理盐水溶液处理；

4)以50μM顺式阿曲库铵的生理盐水溶液处理；

测定上述各组药物治疗12小时后培养基中的睾酮水平，结果见图3(b)所示。

图3(b)中，数据均用平均值±标准误差表示，样本量为4。“*，**，***”分别表示P＜0.05、0.01、0.001。

从图3(b)可知，与空白对照组相比，当顺式阿曲库铵铵浓度≥5μM时，能够明显促进小鼠睾丸间质瘤细胞的睾酮分泌。

实验部分

1、睾丸间质细胞提取和纯化具体步骤如下：

1.1试剂的准备：

1.1.1DB混合液的配制步骤(1L含1％的BSA)

【1】用规格为1L的量筒量取1L的双蒸水，在规格为1L的烧杯中倒入约500ml的双蒸水；

【2】分别称取碳酸氢钠(NaBicarb)0.71g、HEPES 2.1g、BSA 1.0g、M199 9.5g和胰蛋白酶抑制剂/胰酶抑制剂(SBTI)25mg加入烧杯中，磁力搅拌器搅拌；

【3】将量筒内剩余双蒸水加入烧杯中，剩余少许；

【4】制备1MHCL和1MNaOH备用，待烧杯内粉剂溶解后，调整PH至7.2；

【5】取另一1L量筒，将烧杯中的混合液倒入，用量筒中剩余双蒸水定容至1L；

【6】取一干净的1L玻璃瓶，将配好的DB混合液倒入，并于超净台中用500ml培养基过滤器负压过滤，并放入4℃冰箱备用。

1.1.2PB混合液的配制步骤(1L含2.5％的BSA)

【1】用规格为1L的量筒量取1L的双蒸水，在规格为1L的烧杯中倒入约500ml的双蒸水；

【2】分别称取碳酸氢钠(NaBicarb)0.25g、HEPES 2.1g、BSA 2.5g和胰蛋白酶抑制剂/胰酶抑制剂(SBTI)25mg加入烧杯中，磁力搅拌器搅拌；

【3】将量筒内剩余双蒸水加入烧杯中，剩余约150ml，加入50ml 10×HBSS；

【4】制备1MHCL和1MNaOH备用，待烧杯内粉剂溶解后，调整PH至7.2；

【5】取另一1L量筒，将烧杯中的混合液倒入，用量筒中剩余双蒸水定容至1L；

【6】取一干净的1L玻璃瓶，将配好的PB混合液倒入，并于超净台中用500ml培养基过滤器负压过滤，并放入4℃冰箱备用。

1.1.3PB混合液的配制步骤(1L含10％的BSA)

【1】用规格为1L的量筒量取1L的双蒸水，在规格为1L的烧杯中倒入约500ml的双蒸水；

【2】分别称取碳酸氢钠(NaBicarb)0.35g、HEPES 2.1g、BSA 10g和胰蛋白酶抑制剂/胰酶抑制剂(SBTI)25mg加入烧杯中，磁力搅拌器搅拌；

【3】将量筒内剩余双蒸水加入烧杯中，剩余约150ml，加入100ml 10×HBSS；

【4】制备1MHCL和1MNaOH备用，待烧杯内粉剂溶解后，调整PH至7.2；

【5】取另一1L量筒，将烧杯中的混合液倒入，用量筒中剩余双蒸水定容至1L；

【6】取一干净的1L玻璃瓶，将配好的PB混合液倒入，并于超净台中用500ml培养基过滤器负压过滤，并放入4℃冰箱备用。

1.1.4PB混合液的配制步骤(1L不含BSA)

【1】用规格为1L的量筒量取1L的双蒸水，在规格为1L的烧杯中倒入约500ml的双蒸水；

【2】分别称取碳酸氢钠(NaBicarb)0.35g、HEPES 2.1g和胰蛋白酶抑制剂/胰酶抑制剂(SBTI)25mg加入烧杯中，磁力搅拌器搅拌；

【3】将量筒内剩余双蒸水加入烧杯中，剩余约150ml，加入100ml 10×HBSS；

【4】制备1MHCL和1MNaOH备用，待烧杯内粉剂溶解后，调整PH至7.2；

【5】取另一1L量筒，将烧杯中的混合液倒入，用量筒中剩余双蒸水定容至1L；

【6】取一干净的1L玻璃瓶，将配好的PB混合液倒入，并于超净台中用500ml培养基过滤器负压过滤，并放入4℃冰箱备用。

1.1.5SB混合液的配制步骤(用于ALC分离)(1L含10％的BSA)

【1】用规格为1L的量筒量取1L的双蒸水，在规格为1L的烧杯中倒入约500ml的双蒸水；

【2】分别称取碳酸氢钠(NaBicarb)0.71g、HEPES 2.1g、BSA 10g、M199 9.5g和胰蛋白酶抑制剂/胰酶抑制剂(SBTI)25mg加入烧杯中，磁力搅拌器搅拌；

【3】将量筒内剩余双蒸水加入烧杯中，剩余少许；

【4】制备1M HCL和1M NaOH备用，待烧杯内粉剂溶解后，调整PH至7.2；

【5】取另一1L量筒，将烧杯中的混合液倒入，用量筒中剩余双蒸水定容至1L；

【6】取一干净的1L玻璃瓶，将配好的SB混合液倒入，并于超净台中用500ml培养基过滤器负压过滤，并放入4℃冰箱备用。

1.1.6LCM培养基的配置步骤(1L含1％BSA)

【1】用规格为1L的量筒量取1L的双蒸水，在规格为1L的烧杯中倒入约500ml的双蒸水；

【2】分别称取碳酸氢钠(NaBicarb)1.2g、BSA 1.0g和DMEM：F12一瓶(1L装)加入烧杯中，磁力搅拌器搅拌；

【3】将量筒内剩余双蒸水加入烧杯中，剩余约30ml，加入10ml青链霉素混合液(100×)；

【4】制备1MHCL和1MNaOH备用，待烧杯内粉剂溶解后，调整PH至7.2；

【5】取另一1L量筒，将烧杯中的混合液倒入，用量筒中剩余双蒸水定容至1L；

【6】取一干净的1L玻璃瓶，将配好的LCM培养基倒入，并于超净台中用500ml培养基过滤器负压过滤，并放入4℃冰箱备用。

1.2细胞提取和纯化：

1.2.1用4支50ml离心管装取DPBS各10ml并置于冰上，准备酒精喷壶一个，组织剪及弯镊若干，随机选取90日龄SD大鼠14只，二氧化碳窒息法处死后摘取出睾丸，分四管置于冰DPBS中暂时保存，以下操作均在无菌超净台中；

1.2.2去睾丸包膜：准备好75％酒精，在四管50ml无菌离心管中各加入5ml无菌DB，取睾丸，放入酒精中浸泡两分钟，用小剪刀破开睾丸包膜，用手轻轻挤出曲细精管至5ml DB中，分4管，每管7只睾丸；

1.2.3用DB配置浓度为1‰的I型胶原酶和0.25％中性蛋白酶(Dispase)消化液，用0.22m的过滤嘴过滤后，各取5ml上述外源性胶原酶至曲细精管中，在34℃、70-80频率水浴摇床10-20min(直至不再有团块)；加适量冰DB终止胶原酶的反应；

1.2.4上述管加SB至50ml，拧紧盖子，倒置几次混匀，直放静止1-2min，用5ml的巴氏管抽取上清液，转移至另一个50ml离心管内，避免吸到残渣，再加SB重复3-4次，收集，离心20min(4℃，800×g)，收集沉淀(细胞)；

1.2.5准备percoll梯度离心液：在一50ml离心管中，取2ml 10×的HBSS，加入22mlPercoll得到SIP，再加入20ml PB得到55％的Percoll梯度离心液，另取一50ml离心管，试剂较前一管均减半。取33ml 55％Percoll重悬沉淀，另一管取33ml加入密度标记珠，精确配平两管；

1.2.6高速离心40min(17690×g，4℃)，吸取相应层面，放入新50ml管内，加入DB至50ml；

1.2.7离心20min(800×g，4℃)，沉淀成年睾丸间质细胞；

1.2.8准备BSA多梯度离心：用10％BSA的PB和0％BSA的PB制备5％BSA的PB和2.5％BSA的PB各15ml，1％BSA的PB 2ml。用巴氏管将2.5％BSA的PB缓缓加入5％BSA的PB中，形成所需的梯度液。取1％BSA的PB 2ml，与细胞混匀，轻轻加入上管内，并离心10min(50×g，4℃)；

1.2.9取底层12ml加入0％BSA的PB混匀，离心15min(200×g，4℃)，弃上清后用4ml的LCM重悬细胞，并在计数板计数；

1.2.10以0.4mM乙胆酚酮为类固醇底物，通过组织化学染色的方法来评估3-HSD活性，以了解分离出的成年睾丸间质细胞纯度；

1.2.11根据实验需要将适量的细胞接种到培养孔板中。

2、睾丸间质细胞表面存在烟碱乙酰胆碱受体的验证实验

2.1蛋白印迹测试

实验具体过程如下：

2.1.1电泳缓冲液(1XRB)1L配制：

【1】Tris base 30.2g，Glycerin(甘氨酸)144g，SDS 10g，加二级水750ml左右搅拌混匀后加二级水定容至1000ml，即为10xRB；

【2】使用前取10XRB 100ml稀释到1000ml即为1xRB。

2.1.2电泳装置安装：

【1】用洗洁精和自来水洗净玻璃板后用纯水冲洗，烘干；

【2】玻璃板对齐后放入制胶器中并夹紧，然后垂直放置在架子上并夹紧。

2.1.3制胶：

【1】按下表比例配制分离胶和浓缩胶。

表1分离胶配置表

表2浓缩胶配置表

2.1.4将制好的PAGE胶取出，并放置于垂直槽固定架，然后放入电泳槽中，在板间倒满电泳液(1XRB)，垂直小心拔去梳子，不要使胶变歪，补充加入电泳缓冲液后观察是否漏液，漏液的需要重新安置胶板；

2.1.5加样：预电泳后依次加入标准品(Marker 5ul)和待分析样品20ul。

2.1.6加电泳液：电泳槽内倒入过半的1XRB电泳液。

2.1.7电泳：

【1】选择80V恒压进行电泳。(气泡出现提示电泳开始)；

【2】待蛋白样品电泳至下层分离胶时暂停电泳；

【3】更换电压至120V恒压电泳继续电泳；

【4】目的蛋白电泳至分离胶三分之二时停止电泳。

2.1.8转膜

【1】1L的转移缓冲液(1XTB)的制备：称取144g甘氨酸，30gTris碱，加二级水750ml搅拌混匀后加二级水定容至1L，即为10XTB。使用前稀释成1XTB＝700ml H2O+200ml甲醇+100ml 10XTB。冰箱预冷待用；

【2】转膜“三明治”制作：将转膜夹、海绵和滤纸完全浸入转膜液中，润湿。将凝胶置于滤纸上(不能有气泡)，PVDF膜置于凝胶上，PVDF膜的右上角对准凝胶的右上角，并赶除气泡。盖上滤纸、海绵，合上转膜夹；

【3】安装：将转膜夹对应正负极放入转膜槽，放入冰盒放入填充，倒满转膜液。盖上盖子，然后将转膜槽置于冰中。插上电源，设定恒流300mA转膜，1h。

2.1.9膜的封闭

【1】1L的TBST缓冲液的制备：12.11gTris，86.66gNaCl，39ml 1mol/L HCl，溶于500ml双蒸水，1mol/L HCl调pH至7.5，定容至1L，即为10XTBS。1X TBST＝100ml 10X TBS+1ml tueen定容至1L；

【2】封闭液的制备：在50ml离心管中加入2.5g脱脂奶粉，然后加入50ml 1X TBST，震荡，摇床130转/分钟，30-40分钟，直至混合均匀；

【3】将PVDF膜取出后放置于配制好的5％脱脂奶粉封闭液中，摇床震动，70转/分钟，室温封闭2h；

【4】从封闭液中取出PVDF膜并置于TBST中清洗5min*1-3次。

2.1.10一抗孵育

【1】在抗体孵育盒中加入一定量的CHRNA4(1∶1000稀释)或ACTINB(1∶1000稀释)一抗；

【2】将经TBST清洗过的PVDF膜取出，将膜贴角于滤纸吸干，并使正面(蛋白面)朝下置入相应的一抗液(孵育盒)中，并于4℃冰箱缓慢摇动过夜(16h左右)；

【3】用TBST于摇床上轻微摇晃洗涤PVDF膜10min*3次。

2.1.11二抗孵育

【1】将配制好的山羊抗兔二抗(1∶2000稀释)倒入CHRNA4条带的抗体孵育盒中。将配制好的山羊抗鼠二抗(1∶2000稀释)倒入ACTINB条带的抗体孵育盒中。将PVDF膜置于二抗中室温缓慢摇动2h；

【2】用TBST洗涤PVDF膜10min*3次。

2.1.122ECL显色，得到蛋白质印迹带A，结果如图4(A)所示。

从图4(A)的蛋白质印迹带可以看出，ACTINB为内参蛋白，CHRNA4显影说明大鼠成年睾丸间质细胞表达了CHRNA4蛋白。

2.2成年大鼠睾丸切片免疫组化

2.2.1烤片：石蜡切片置于60℃烤箱2h。

2.2.2脱蜡及复水：二甲苯I、II各10min，100％乙醇I、100％乙醇II，95％乙醇，85％乙醇，75％乙醇各5min，然后用PBS洗3*5min。

2.2.3内源性过氧化物酶阻断：滴加3％H2O2 10min，然后用PBS洗3*5min。

2.2.4高温热修复抗原：将盛有柠檬酸盐修复液的搪瓷缸置于盛有水的高压锅内，煮至沸腾，然后将玻片架置于柠檬酸盐中，盖紧锅盖，喷气后开始计时3min，关闭热源，自然冷却至室温，后放置在PBS浸泡10min。

2.2.5血清封闭：将玻片轻柔甩干后放入湿盒，快速滴加正常血清封闭液(10％山羊血清)，室温封闭30min。

2.2.6加一抗：轻柔甩去血清放入湿盒，CHRNA4+组滴加CHRNA4一抗(1∶250稀释)，CHRNA4-组滴加1％山羊血清。4℃过夜(12h)。

2.2.7复温：将湿盒置于37℃水浴箱复温30min，后用PBS洗3*5min。

2.2.8加二抗：在湿盒中用山羊抗兔二抗室温孵育20min，后PBS洗3*5min。

2.2.9显色：滴加DAB，显微镜下控制时间，显色后立刻水洗去DAB。

2.2.10复染：水中冲洗2min，苏木素染色，水冲洗5min，1％盐酸乙醇分化4s，水冲洗10min，氨水反蓝1-2s。

2.2.11脱水及透明：75％乙醇1min，85％乙醇2min，95％乙醇3min，100％乙醇I、II各3min，后用二甲苯I、II各10min。

2.2.12封片：中性树胶封片，结果如图4(B)所示。

图4B中，CHRNA4-是CHRNA4阴性对照(即用血清代替CHRNA4一抗)；CHRNA4+是CHRNA4阳性组(即经过CHRNA4一抗孵育)，棕色细胞是CHRNA4阳性的成年睾丸间质细胞。与阴性对照组相比CHRNA4特异性地标记了睾丸间质内的细胞(即睾丸间质细胞)，证明睾丸间质细胞上表达CHRNA4蛋白。

2.3细胞免疫荧光

2.3.1准备细胞爬片：在12孔板底部放置爬片，将分离和提纯的大鼠成年睾丸间质细胞以106个/孔将细胞种于12孔板中，过夜培养令细胞贴壁于爬片上；

2.3.2每孔加入500ul左右的4％多聚甲醛固定10分钟，结束后吸出多聚甲醛，加入1ml的1×PBS漂洗3次；

2.3.3加入500ul的0.5％曲通(Triton)穿孔15分钟，结束后吸出曲通，加入1ml的1×PBS漂洗3次；

2.3.4每孔加入500ul的1％驴血清封闭30分钟；

2.3.5加一抗：用1％驴血清以1∶200的比例稀释CHRNA4抗体，在阳性组每孔加入500ul的一抗，阴性对照组加入500ul的1％驴血清，37℃杂交2小时，结束后吸出抗体，加入1ml的1×PBS漂洗3次；

2.3.6(以下操作均需避光)加二抗：用1％驴血清以1∶500的比例稀释驴抗兔二抗，阴性和阳性组每孔加500ul二抗，37℃杂交1小时，结束后吸去二抗，加入1ml的1×PBS漂洗3次；

2.3.7每孔加入300ul DAPI(5ug/ml)染色5分钟；

2.3.8封片：滴加少许抗淬灭剂封片，避免产生气泡，结果如图4(C)所示。

图4(C)中，CHRNA4-是CHRNA4阴性对照(即用血清代替CHRNA4一抗)；CHRNA4+是CHRNA4阳性组(即经过CHRNA4一抗孵育)，第一列图中规则的灰色点迹是DAPI(原图中为蓝色)，第二列图中块带状是CHRNA4(原图中为绿色)，第三列图DAPI/CHRNA4为两者的合成图。与阴性对照组相比CHRNA4特异性地标记了纯化的睾丸间质细胞，证明睾丸间质细胞上表达CHRNA4蛋白。

Claims (3)

1.顺式阿曲库铵在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用，其特征在于，顺式阿曲库铵与睾丸间质细胞表面的α4型烟碱乙酰胆碱受体nAChR结合，抑制α4型烟碱乙酰胆碱受体与乙酰胆碱结合，提高睾丸和血清中睾酮含量；

所述男性性腺功能减退症是由于雄性激素缺乏、减少或作用不能发挥所导致的性功能减退性疾病；

所述雄性激素为睾酮。

2.根据权利要求1所述的顺式阿曲库铵在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用，其特征在于，所述雄性激素缺乏、减少或作用不能发挥由包括但不限于可使睾丸间质细胞表面的烟碱乙酰胆碱受体特异性结合乙酰胆碱的尼古丁或洛贝林引起。

3.根据权利要求2所述的顺式阿曲库铵在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用，其特征在于，顺式阿曲库铵在睾丸内的浓度≥睾丸内的尼古丁的浓度。

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