CN115590859B - 健脾生血颗粒中的薯蓣皂苷元在制备铁吸收促进剂中的用途 - Google Patents

健脾生血颗粒中的薯蓣皂苷元在制备铁吸收促进剂中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了薯蓣皂苷元在制备铁吸收促进剂中的用途，属于制药领域。薯蓣皂苷元是健脾生血颗粒中的活性成份之一，通过建立低铁贫血动物模型，考察不同给药剂量的薯蓣皂苷元对大鼠肠粘膜DMT1蛋白表达量的影响，结果发现低、中、高剂量试验组DMT1表达量较模型组均显著增加，肠粘膜中DMT1蛋白的表达量与薯蓣皂苷元的给药剂量存在量效关系。鉴于铁在肠道的吸收主要通过肠粘膜上的DMT1蛋白进行转运，以上试验结果表明薯蓣皂苷元可通过上调肠道上的DMT1蛋白表达而促进人体对铁的吸收。

Description

健脾生血颗粒中的薯蓣皂苷元在制备铁吸收促进剂中的用途
技术领域
本发明属于制药领域，涉及一种从健脾生血颗粒中分离鉴定的化合物制药新用途，尤其是在制备铁吸收促进剂中的新用途。
背景技术
铁是人体必须的营养元素，当铁摄入不足会诱发缺铁性贫血。食物中的铁主要通过十二指肠和空肠上端黏膜吸收。乳铁蛋白是一种能与铁结合的糖蛋白，它参与铁的转运并提高人体对铁的生物利用率；酪蛋白磷酸肽可通过提高无机铁在肠道中的溶解性而促进铁的吸收和利用；维生素C、果糖、氨基酸等有助于铁的还原，可以将铁元素还原为更容易被人体吸收的二价铁。乳铁蛋白、维生素C、酪蛋白磷酸肽、果糖、氨基酸等这一类能够促进人体吸收铁的物质被统称为铁吸收促进剂。近年来，越来越多的铁吸收促进剂被发现并用于临床。
二价金属转运蛋白1(Divalent metal transporter1，DMT1)是一种跨膜糖蛋白，其主要功能是介导小肠上皮细胞的铁吸收以及参与铁从内吞小体移位到胞浆的过程，是细胞中最重要的铁转运蛋白。已有研究表明，DMT1编码基因的突变导致动物由于铁吸收不足而出现贫血症状，而遗传性血色病患者DMT1 mRNA过度表达，促进肠黏膜对铁的吸收而导致铁负荷过量。另据报道，DMT1 mRNA水平在铁缺乏动物的十二指肠中补偿性升高。
CN1554386A公开了一种防治贫血病的药物及制备方法，该药物属于中西药复方制剂，采用补气补血、健脾和胃的中药与西药铁剂进行配伍，用于治疗小儿脾胃虚弱及心脾两虚型缺铁性贫血，成人气血两虚型缺铁性贫血等。该药物已应用于临床近30年，是健民药业集团股份有限公司的独家品种，也是国家基本药物和中药保护品种，商品名为健脾生血颗粒，收载于《中国药典》。本品是将党参、茯苓、白术、黄芪、大枣、山药、鸡内金、龟甲、麦冬、南五味子用水煎煮提取，然后将提取液浓缩成浸膏并与硫酸亚铁、维生素C等混合而成。
健脾生血颗粒的中药部分具有健脾和胃功效，大量临床数据指向其能促进铁的吸收，为了探明中药复方配伍规律，揭示其治疗缺铁性贫血的物质基础，我们在前期研究的基础上对健脾生血颗粒进行了效应物质和作用机理研究，其中包括采用现代提取分离技术对药物中的成份进行提取分离，高通量筛选有效成份，同时还开展血清药理学研究，观察了进入体内的有效成分及其代谢产物以及一些经药物作用后机体所产生的内生性活性成分的药理作用。在研究过程中我们发现了一系列具有生理活性的化合物，从而为完成本发明奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种从健脾生血颗粒中分离鉴定的化合物在制备铁吸收促进剂中的新用途。
为实现上述目的，申请人以健脾生血颗粒的中药浸膏为原料，通过使用有机溶剂萃取、大孔树脂纯化、柱层析分离和半制备HPLC色谱分离等技术手段，从中药浸膏中分离出一种具有生理活性的化合物，经鉴定，该化合物为已知化合物薯蓣皂苷元(CAS号512-04-9)，目前主要用于合成甾体激素类药物的前体，但在抗肿瘤、抗高血脂、抗炎等方面也具有一定活性。
进一步地，为考察该化合物是否参与促进健脾生血颗粒中铁的吸收，申请人通过建立低铁贫血动物模型，考察不同给药剂量的薯蓣皂苷元对大鼠肠粘膜DMT1蛋白表达量的影响，结果发现低、中、高剂量试验组DMT1表达量较模型组均显著增加，肠粘膜中DMT1蛋白的表达量与薯蓣皂苷元的给药剂量存在量效关系。
鉴于铁在肠道的吸收主要通过肠粘膜上的DMT1蛋白进行转运，以上试验结果表明，薯蓣皂苷元可通过上调肠道上的DMT1蛋白表达而促进人体对铁的吸收。
综上，薯蓣皂苷元可用于制备铁吸收促进剂，并单独用于人体补铁或治疗贫血症，也能与铁剂联合用于人体补铁或治疗贫血症。当与铁剂联合使用时，薯蓣皂苷元能上调肠道上的DMT1蛋白表达而促进人体对铁的吸收，进而提高疗效。
更详尽的技术方案参见具体实施例。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1健脾生血颗粒中有效成份的分离鉴定
主要材料与仪器：
HP-20型大孔树脂：北京绿百草科技发展有限公司；柱层析硅胶：青岛海洋化工厂；高效液相色谱仪：安捷伦科技公司；数字熔点仪：WRS-1A，上海精密科学仪器有限公司；超导核磁共振仪：DRX500，布鲁克科技有限公司；电子天平：FA2004，上海方瑞仪器有限公司；三用紫外分析仪：WFH-203，上海精科实业有限公司；离子阱液质联用仪：安捷伦科技公司；半制备高效液相色谱仪：U-3000，美国戴安公司。
1.有效成份的提取
(1)取健脾生血颗粒处方中的中药材，党参45g、茯苓45g、白术(炒)27g、甘草13.5g、黄芪22.5g、山药54g、鸡内金22.5g、龟甲(醋制)13.5g、麦冬45g、南五味子(醋制)27g，以上十味加水煎煮并将煎煮液浓缩成浸膏。
(2)将浸膏用水饱和正丁醇萃取三次，合并有机相并回收有机溶剂，浓缩成浸膏。
2.大孔树脂分离
取HP-20型大孔树脂，加入适量无水乙醇浸泡过夜；将浸泡过夜后的大孔树脂装填于玻璃柱中，后用5倍柱体积的蒸馏水冲洗，接着用95％乙醇同样5个柱体积冲洗，使大孔树脂再生活化。
向装有大孔树脂的玻璃柱中加入少量蒸馏水，然后将水饱和正丁醇部位浸膏用适量水溶解后上柱，静置过夜。
依次用纯水、30％乙醇对样品进行洗脱，每个溶剂洗脱4个柱体积，收集30％乙醇洗脱液，浓缩备用。
3.柱层析分离
将步骤2得到的浓缩液与硅胶拌匀，然后上层析柱进行层析分离，使用甲醇-二氯甲烷系统进行洗脱，收集含有目标物的洗脱流份，减压浓缩。
4.半制备HPLC色谱分离
柱温：25℃；流速：1ml/min(分析)，3ml/min(半制备)；流动相：甲醇-水(或乙腈-水)；色谱柱：150×4.6mm(分析)，250×10.0mm(半制备)，粒径：5μm。收集含有目标峰的洗脱液并旋干。
5.结构确证
制备得到的化合物纯度为98.34％，白色粉末，mp：202-204℃；Liebermann-Burchard反应呈阳性，推测该化合物可能为甾体、皂苷或三萜类化合物，但Molish反应呈阴性，表明该化合物不可能为皂苷类化合物，Ehrlich反应呈阴性，而香草醛-浓硫酸反应显黄色，这些显色反应现象提示，该化合物为甾体苷元类化合物。1H NMR(500MHz，CDCl3)给出了四个甲基氢的信号：δH：1.00(3H，s)、δH：0.98(3H，d，J＝6.5Hz，)、δH：0.81(3H，s)、δH：0.80(3H，d，J＝3.1Hz)；同时给出δH：5.36(1H，m)的烯氢质子信号，与13C NMR(126MHz，CDCl3)给出的δC：140.82及δC：121.41推测出该皂苷元存在双键；核磁碳谱信号给出的δC：109.29为螺甾烷醇皂苷类化合物中典型的季碳信号，δC：66.85为链接氧的一个亚甲基碳信号，δC：80.83和δC：71.73为两个连接氧的季碳信号；结合H谱、C谱信号推测该化合物为薯蓣皂苷元，与文献对照后，数据信息基本一致，故确定该化合物为薯蓣皂苷元，分子量414，结构式如下：
实施例2薯蓣皂苷元对DMT1蛋白表达的影响
1.实验动物
SD大鼠(SPF级)，体重为180-220g，湖北省实验动物研究中心提供，雌雄各半，分笼饲养于动物实验室，造模前饲养三天以适应动物实验室环境。控制日光灯以保证动物房每天大约12小时的光照时间；控制动物房的温度和相对湿度，分别保持温度在19-22℃，湿度在40-70％。
2.实验试剂
3实验仪器
仪器 来源
酶标仪 SUNRISE，USA
Heraeus Fresco台式高速冷冻离心机 德国Heraeus公司
组织匀浆机 Mettler Toledo Ltd
水浴锅 上海医疗器械七厂
DK-8A型电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司
INPAucell 55型温箱 INPAucell Ltd
ABl04-N精密电子天平 Met-tier Toledo Ltd
凝胶成像仪 美国Gene公司
Bio Rad转膜仪 美国Bio Rad公司
可调式微量移液器 美国Gene公司
Bio Rad电泳仪 美国Bio Rad公司
恒温摇床 上海医疗器械七厂
4.实验方法
4.1建立低铁贫血模型及给药
所有大鼠经过适应性饲养3天后，每只大鼠进行编号，雌雄各半，随机分为4组：模型组，低、中、高剂量试验组，每组10只。
所有大鼠均用低铁饲料(元素铁<8mg/kg)喂养，喂养4周后，眼眶取血测定血常规，血红蛋白低于正常值则造模成功，制作缺铁性贫血大鼠模型。
造模成功后，试验组每天上午灌胃低、中、高剂量薯蓣皂苷元(0.5、1.0、2.0mg/kg)，模型组灌胃生理盐水，灌胃体积均为10mL/kg，灌胃给药连续2周。
饲养及给药情况
组别 饮食 灌胃样品 给药量
模型组 低铁饲料 生理盐水 0
低剂量试验组 低铁饲料 薯蓣皂苷元 0.5mg/kg
中剂量试验组 低铁饲料 薯蓣皂苷元 1.0mg/kg
高剂量试验组 低铁饲料 薯蓣皂苷元 2.0mg/kg
4.2样本采集与指标测定
4.2.1取大鼠肠粘膜
连续灌胃给药2周后进行取样。首先将实验台用酒精擦拭消毒干净，然后处死大鼠，迅速取出十二指肠和空肠(从距幽门25cm处开始取10cm长肠段)，用剪刀剪开，用生理盐水洗净，玻璃板下面放冰块保持低温，再用载玻片轻轻刮取粘膜上皮的组织，不能用力过猛，刮取肠黏膜组织放入普通管中，并迅速放入氮罐中，隔日，取出放入-80℃冰箱冻存备用。
4.2.2考察薯蓣皂苷元对DMT1蛋白表达的影响
从冰箱中取出大鼠肠粘膜，放入加入裂解液的离心管中进行破碎，使用超声破碎仪3次，每次10s，过程中离心管放入冰水，防止温度过高。将破碎后的组织置于4℃冰浴中，加入蛋白酶抑制剂(PMSF)进行匀浆，4℃下将匀浆液置于离心机中高速离心10min，转速为12000r/min，取出上清液，测量蛋白浓度。
制作SDS-PAGE电泳胶，凝固后每孔加入running buffer 8uL。恒压80V下跑电泳浓缩胶，约30分钟蛋白样压齐，Marker跑出红带，继续加恒压130V，直至溴酚蓝跑到最低端结束电泳，转膜，丽春红染色，按照标记Marker指示分离相应蛋白，6％的脱脂奶粉37℃下封闭1h。使用缓冲溶液TBST(Tris-HCL，pH7.4,NaCl，tween-20)清洗，再加入对应的一抗兔抗大鼠DMT1多克隆IgG，置于4℃环境中放置过夜。再用TBST清洗一抗，清洗3次，每次15min，加入二抗(HRP标记的山羊抗兔IgG)，加入ECL Plus免疫荧光试剂盒溶液，将以上混合溶液滴加于硝酸纤维素膜显色，曝光并得到蛋白条带，最后经Quantity One分析得到DMT1蛋白灰度值。
5.实验结果
采用蛋白印迹杂交方法，分析各组大鼠肠粘膜中DMT1蛋白的表达量，不同处理组大鼠肠粘膜DMT1表达量见下表。由表可知，低、中、高剂量试验组DMT1表达量较模型组均明显增加(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，试验组肠粘膜中DMT1蛋白的表达量随给药剂量的升高而增加。
各组大鼠给药后DMT1表达量
与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01
6.结论
试验结果表明，低、中、高剂量的薯蓣皂苷元能显著增加肠粘膜中DMT1蛋白的表达量，而亚铁离子的吸收主要经肠粘膜上的DMT1蛋白转运进入肠系膜静脉。因此，薯蓣皂苷元可能通过上调肠道上的DMT1蛋白表达而促进铁的吸收。

Claims (3)

1.薯蓣皂苷元在制备铁吸收促进剂中的用途，所述薯蓣皂苷元是健脾生血颗粒中的活性成分之一，能通过上调肠道上的DMT1蛋白表达而促进对铁的吸收。
2.薯蓣皂苷元在制备治疗缺铁性贫血药物中的用途，所述薯蓣皂苷元是健脾生血颗粒中的活性成分之一，能通过上调肠道上的DMT1蛋白表达而促进对铁的吸收，进而治疗缺铁性贫血。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述药物是由薯蓣皂苷元与铁剂组成的复合物。
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