CN101167901A - 当归芍药方提取物、其制备方法及医药用途 - Google Patents
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Abstract
当归芍药方糖苷提取物DSS-A-N-30,其包括,以提取物重量计,36.0-44.0重量%的总苷(芍药苷和白芍苷),其中当归芍药方是由当归、芍药、茯苓、白术、泽泻、川芎按3∶16∶4∶4∶8∶8重量比例配伍组成;含有该提取物的产品或药物组合物及其作为治疗与疼痛、衰老及生殖内分泌功能低下或紊乱相关疾病(特别是痛经、月经不调、流产、更年期综合征、老年痴呆、卵巢功能低下等)的产品或药物用途。
Description
技术领域
本发明涉及当归芍药方提取物(今后简称为:DSS-A-N-30),其制备方法,含有该提取物的产品或药物组合物及其作为治疗与疼痛、衰老及生殖内分泌功能低下或紊乱相关的多种疾病(特别是痛经、月经不调、流产、更年期综合征、痴呆、卵巢功能低下等)的产品或药物用途。
技术背景
当归芍药散出自《金匮要略》,全方由当归、芍药、茯苓、白术、泽泻、川芎6味药组成,用量为当归三两、芍药一斤、茯苓四两、白术四两、泽泻半斤、川芎半斤,原为治疗妇女妊娠病而设。
当归芍药散已有上千年的应用历史,该方经历代的发展,在不同医籍中的组成剂量、功能主治均有差异,临床运用十分广泛,临床新用也很多,可用于40余种疾病的治疗,其中治疗痛经是该方的一个主要用途。近代中国和日本学者对该方进行了更加全面深入的研究,主要集中在对该方药理及临床方面的研究,而对该方剂治疗痛经的药理和药效作用的物质基础方面的研究尚没有报道。该方在实际应用中,无论作为汤剂、丸剂、胶囊剂或其它剂型,都存在明显不足,主要表现在以下几个方面:一是剂量大,用药不方便,难以作成现代方便使用的药物剂型;二是有效成分不明确,没有以有效成分作为质量控制指标,难以保证产品质量的稳定和可控;三是当各种原因导致药材中有效成分含量出现大的变化时,没有有效的手段保证产品中有效成分含量的稳定,从而无法保证临床用药的有效性。
发明内容
本发明人经研究,通过对当归芍药方的进一步改进,获得了当归芍药方的提取物DSS-A-N-30。该提取物与其它以当归芍药方为基础的产品不同点在于:DSS-A-N-30是该复方的一个活性部位,为水易溶粉末,可以方便地作成适宜的药物剂型,方便用药;DSS-A-N-30的活性成分明确,其重量仅为生药量的2.2%,且可以对其中主要有效成分进行质量控制;当由于各种原因导致药材中有效成分含量出现大的变化时,可以适当调节提取物重量,使得各个有效成分含量符合正常含量,从而保证了有效成分含量的稳定,进而保证了临床用药的有效性。药效学研究结果表明,该提取物具有镇痛、改善或调节学习记忆功能低下、改善或调节子宫平滑肌的收缩功能紊乱、改善或调节衰老所致性腺轴功能低下或平衡紊乱等作用,显示了治疗与疼痛、生殖内分泌功能低下或紊乱相关的多种疾病(特别是痛经、月经不调、流产、更年期综合征、老年痴呆、卵巢功能低下等)等疾病的广阔应用前景。其在常温下水中溶解度为≥1.2g/ml。本发明基于以上发现得以完成。
因此,本发明第一方面涉及当归芍药方提取物DSS-A-N-30,其包括,以提取物重量计,36.0-44.0重量%的总苷(芍药苷与白芍苷之和),其中当归芍药方是当归、芍药、茯苓、白术、泽泻、川芎6味药中药以3∶16∶4∶4∶8∶8的重量比例配伍组成。该提取物有明显的镇痛、改善或调节学习记忆功能低下、改善或调节子宫平滑肌的收缩功能紊乱、改善或调节衰老所致性腺轴功能低下或平衡紊乱等作用,对与疼痛、衰老及生殖内分泌功能低下或紊乱相关的多种疾病(特别是痛经、月经不调、流产、更年期综合征、老年痴呆、卵巢功能低下等)具有治疗作用。
本发明另一方面涉及产品或药物组合物,其包括作为活性成分的本发明当归芍药方提取物DSS-A-N-30及一种或多种药用载体或赋形剂。
本发明还涉及当归芍药方提取物DSS-A-N-30用于制备治疗与疼痛、衰老及生殖内分泌功能低下或紊乱相关的疾病(特别是痛经、月经不调、流产、更年期综合征、老年痴呆、卵巢功能低下等)的产品或药物的用途。
根据本发明,本发明的当归芍药方提取物DSS-A-N-30中的主要成分为芍药苷和白芍苷,两部分加和,在该提取物中的含量范围在36.0-44.0%之间。
根据本发明,本发明当归芍药方提取物DSS-A-N-30可单独或以药物组合物形式使用,其给药方式可根据具体情况而定,可通过口服、非肠道或局部给药,给药剂型可以是例如片剂,胶囊,膏剂,贴剂,注射剂等。
本发明再一方面涉及制备含36.0-44.0重量%总苷的当归芍药方提取物DSS-A-N-30的方法,其包括:
i)将由当归、芍药、茯苓、白术、泽泻、川芎按3∶16∶4∶4∶8∶8组成的混合物用沸水蒸煮三次,过滤,得到提取液,然后浓缩至比重1.2;
ii)浓缩液进行柱层析,用水和极性有机溶剂洗脱,有机溶剂洗脱液浓缩后得提取物DSS-A-N-30。
根据本发明,该提取物可按下面工艺流程得到:
在上面工艺流程中,具体讲,按经典当归芍药方中各单味药的配比,组成生药。药材粉碎后加沸水煎煮,过滤,得提取液。提取液浓缩至适当体积,进行大孔吸附树脂柱层析,依次用水和极性有机溶剂洗脱,极性有机溶剂洗脱部位浓缩除去溶剂后冷冻干燥,得到棕黄色粉末,即为当归芍药方的糖苷类提取物DSS-A-N-30。
所用大孔吸附树脂可为所有型号的弱极性大孔吸附树脂;大孔吸附树脂层析洗脱所用的极性有机溶剂为所有大孔树脂所能允许使用的有机溶剂(如:甲醇、乙醇、丙醇和丙酮或它们的混合物等),浓度范围为5%-95%。
根据本发明,本发明提取物中36.0-44.0重量%糖苷是基于提取物重量计算得到的百分比。
根据本发明,术语“产品”指保健食品或药物组合物或它们的使用形式,如口服或非口服形式。
根据本发明,本发明的提取物可按如下方法定性鉴别:
(1)α-萘酚反应(Molish反应):
提取物以适量水溶解,加10%α-萘酚乙醇溶液三滴,然后沿试管壁缓缓加入浓硫酸,使形成上下两层,稍后在两层界面处可见紫色环。表示有苷类成分存在。
(2)提取物中以芍药苷和白芍苷为代表的糖苷类成分的定性检查:
提取物适量,乙醇溶解为待测液。芍药苷和白芍苷对照品加乙醇溶解,成1mL含1mg的溶液作为对照溶液。吸取待测液和对照液各1μL分别点样于同一硅胶G薄层板上,以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(45∶5∶10∶0.2)为展开剂,展开,适当时取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的紫色斑点。
(3)当归芍药方提取物的HPLC指纹图谱:
DSS-A-N-30提取物中主要有效成分芍药苷和白芍苷在230nm处为特征紫外吸收波长。
仪器:Agilent 1100化学工作站(G1322A Degasser,G1311A QuatPump,G1316A Colcom,G1315B DAD,G1328A Man.Inj)
试剂:甲醇为色谱纯,水为二次重蒸水
色谱条件:色谱柱:DiamonsilTM C18150×4.6mm,5μm
流动相:甲醇-水(含0.1%甲酸)0∶100(25min)-25∶75(50min)-90∶10,流速:0.6ml/min
检测波长:230nm、260nm、280nm;柱温:25℃
结果见附图1:
(3)当归芍药方提取物DSS-A-N-30的HPLC/MS分析:
仪器:API 3000 LC/MS/MS联用仪(美国ABI公司)配有TurboIonspray离子源及Analyst 1.1数据处理系统;Agilent 1100四元梯度泵和自动进样器(美国安捷伦公司)
色谱条件:色谱柱:DiamonsilTM C18(150×4.6mm,5μm)
流动相:甲醇-水(含0.1%甲酸)0∶100(25min)-25∶75(50min)-90∶10,流速:0.6ml/min
质谱条件:离子源为Turbo Ionspray离子源,正/负离子检测方式喷射电压为4000V/-3800V,离子源温度为300℃。NEB为7Units,CUR为11 Units
分析结果表明,在负离子检测模式下,从DSS-A-N-30提取物的总离子流色谱图中可以看到芍药苷和白芍苷两个主要有效成分,通过选择离子扫描可以清楚地看到这对同分异构体。芍药苷和白芍苷的相对保留时间分别为42.5~43.5min,44.2~44.8min。HPLC-MS分析表明,样品中的主要成分芍药苷主要有479.5[M-H]-、449.5[M-H-30]-、525.5[M-H+HCOOH]-和543.5[M-H+64]-等碎片峰;白芍苷主要有479.5[M-H]-、525.5[M-H+HCOOH]-和543.5[M-H+64]-等碎片峰。见图.2-5。
根据本发明,本发明的当归芍药方糖苷提取物按如下方法定量鉴别:
芍药苷与白芍苷互为同分异构体,结构极其相似,而且芍药苷与白芍苷两者的最大紫外吸收均为230nm,因此可以通过以芍药苷为标准品同时对芍药苷与白芍苷进行含量测定。
仪器与试药
HITACHI L-2100系列高效液相色谱仪色谱工作站(L-2130 Pump,L-2420 UV-VIS Detector,CO-201 Column oven)。
芍药苷对照品(批号110736-200423)由中国药品生物制品检定所提供;甲醇为色谱纯,水为二次重蒸水。
方法和结果
A.供试品溶液的制备
精密称取DSS-A-N-30样品0.679g,用流动相精确稀释1000倍,摇匀,0.45μm微孔滤膜滤过,即得。
B.对照品溶液的制备
精密称取芍药苷标准品6.3mg,置于5mL的容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配成1260μg/mL的溶液。用甲醇经过一系列稀释,得到252μg/mL、100.8μg/mL、80.64μg/mL、50.4μg/mL、25.2μg/mL、12.6μg/mL系列标准溶液,0.45μm微孔滤膜滤过,即得,作为对照品溶液。
C.色谱条件
色谱柱:Diamonsil TM C18(4.6×250mm,5μm),迪马公司;流动相:甲醇-水(40∶60);流速:0.6ml/min;检测波长:230nm;分析时间:30min;柱温:25℃。
D.标准曲线的绘制
分别精密吸取系列对照品溶液20μL进样,在上述色谱条件下进行分析,以对照品的浓度(Y)为纵坐标,峰面积(X)为横坐标进行线性回归,得到回归方程Y=2.27×10-5 X-5.64,r=0.9996。结果表明,芍药苷在12.6μg/mL~252μg/mL浓度与其色谱峰面积呈良好的线性关系。标准曲线如图6所示:
E.稳定性实验
分别在0、4、8、16、24h取DSS-A-N-30供试品溶液在上述色谱条件下进行分析,测定结果表明,芍药苷和白芍苷在24h内稳定性良好,RSD分别为2.2%和2.7%。
F.精密度实验
精密平行制备DSS-A-N-30样品溶液5份,在上述色谱条件下进行含量测定,5次重复测定结果如下:
7.回收率实验
采用加样回收法,取DSS-A-N-30样品(已知浓度)9份,分别置于10mL容量瓶中,3份为一组,每组分别精密加入100μg/mL的芍药苷标准溶液液1.6mL、2.5mL、3mL,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液分别进样,计算回收率,结果见下表:
8.样品测定:
按标准品测定方法测定DSS-A-N-30样品,进样20μL,得积分面积值,带入回归方程,测得结果见表:
样品含量测定结果表明,样品中白芍苷和芍药苷含量范围分别为7.8-9.4%和28.33-33.53%,二者加和,在该活性部位DSS-A-N-30中的含量范围在36.0-44.0%。
附图说明
图1.当归芍药方提取物DSS-A-N-30在不同波长检测时的HPLC指纹图谱
图2.(-)ESI方式下DSS-A-N-30的总离子流色谱图
图3.m/z 479.5的选择离子扫描色谱图(-Q1)
图4.DSS-A-N-30中芍药苷的质谱图
图5.DSS-A-N-30中白芍苷的质谱图
图6.芍药苷的标准曲线图
图7.DSS-A-N-30对去卵巢大鼠垂体LH水平的影响
图8.DSS-A-N-30对SAMP8逃避潜伏期的影响
图9.DSS-A-N-30对SAMP8被动回避潜伏期的影响
图10.DSS-A-N-30对雌性SAMP8血清雌二醇浓度的影响
图11.DSS-A-N-30对PC12细胞存活率的影响
图12.DSS-A-N-30对Na2S2O4预处理PC12细胞存活率的影响
具体实施方式
下面的实施例和生物活性实验,是对本发明的进一步详细说明,但不意味着对本发明的任何限制。
实施例1:当归芍药方提取物DSS-A-N-30的制备
将当归芍药方各单味药按常用配比,当归∶芍药∶茯苓∶白术∶泽泻∶川芎(3∶16∶4∶4∶8∶8)或对部分药味加、减量后,组成生药1500克,加六倍生药重量的沸水煎煮三次,每次1.5小时,过滤,减压浓缩适当体积。
水溶解后进行HP-20大孔吸附树脂柱层析,树脂柱床体积(毫升)与上样量(克)比为5∶1,然后用水和30%乙醇依次洗脱,30%乙醇洗脱部位浓缩除醇后冻干,得到棕黄色粉末为DSS-A-N-30(33.0克)。其具有前述的定性反应特征。
按前述所给方法测定本实施例所得提取物DSS-A-N-30中总苷含量为40.03%。
实施例2:当归芍药方提取物DSS-A-N-30的制备
将当归芍药方各单味药按常用配比,当归∶芍药∶茯苓∶白术∶泽泻∶川芎(3∶16∶4∶4∶8∶8)或对部分药味加、减量后,组成生药1500克,加六倍生药重量的沸水煎煮三次,每次1.5小时,过滤,减压浓缩适当体积。
水溶解后进行HP-20大孔吸附树脂柱层析,树脂柱床体积(毫升)与上样量(克)比为5∶1,然后用水和40%乙醇依次洗脱,40%乙醇洗脱部位浓缩除醇后冻干,得到棕黄色粉末为DSS-A-N-30(35.0克)。其具有前述的定性反应特征。
按前述所给方法测定本实施例所得提取物DSS-A-N-30中总苷含量为38.05%。
实施例3:当归芍药方提取物的生物活性实验
除非另有说明,实施例3中所用DSS-A-N-30是指实施例1中制备的DSS-A-N-30。
一、DSS-A-N-30的镇痛作用
1.口服DSS-A-N-30对醋酸致小鼠扭体反应次数的影响
雄性昆明种小鼠,22-26g,口服相应药物40min后以10ml/kg的剂量腹腔注射0.6%醋酸水溶液,注射醋酸溶液5min后,观察并记录15min内动物扭体次数。结果表明,口服给予DSS-A-N-30可明显减少醋酸致小鼠扭体反应次数(表1)。
表1.DSS-A-N-30对醋酸致小鼠扭体反应次数的影响
注:*P<0.05,**P<0.01,与醋酸模型组比较;Mean±SD,n=15
2.口服DSS-A-N-30对缩宫素致小鼠扭体反应次数的影响
雌性昆明种小鼠,22-26g,,每日皮下注射己烯雌酚0.2mg/只,连续3天,第4天口服相应中药,口服中药40min后各组动物腹腔注射2U/ml缩宫素生理盐水溶液20U/kg,5min后记录30min内小鼠扭体次数。结果表明,口服给予DSS-A-N-30可明显减少缩宫素致小鼠扭体反应次数(表2)。
表2.DSS-A-N-30对缩宫素致小鼠扭体反应次数的影响
注:*P<0.05,**P<0.01,与痛经模型组比较;Mean±SD,n=15
3.口服DSS-A-N-30对前列腺素致小鼠扭体反应次数的影响
雌性昆明种小鼠,22-26g,每日皮下注射己烯雌酚0.2mg/只,连续3天,第4天口服相应中药,口服中药40min后各组动物腹腔注射前列腺素生理盐水溶液12.5μg/kg,5min后记录30min内小鼠扭体次数。结果表明,口服给予DSS-A-N-30可明显减少前列腺素致小鼠扭体反应次数(表3)。
表3.DSS-A-N-30对前列腺素致小鼠扭体反应次数的影响
注:*P<0.05,**P<0.01,与前列腺素模型组比较;Mean±SD,n=15
以上实验结果表明,口服给予DSS-A-N-30可明显减少醋酸、缩宫素、前列腺素引起的小鼠扭体反应次数。表明DSS-A-N-30对化学刺激、子宫收缩、致炎物质释放所致的疼痛具有明显改善或缓解作用。上述结果提示,DSS-A-N-30对多种因素导致的疼痛具有改善或缓解作用,临床可用于外伤、感染、炎症等因素所致疼痛的相关疾病如痛经、子宫内膜异位症、盆腔炎、子宫颈炎、子宫内膜炎、子宫附件炎、输卵管炎症、阴道炎、卵巢囊肿、子宫肌瘤等预防和治疗。
二、DSS-A-N-30对子宫平滑肌的作用
1.DSS-A-N-30对大鼠离体子宫平滑肌正常收缩功能的影响
雌性SD大鼠,体重340-360g,皮下注射己烯雌酚注射液2mg/kg,24h后颈部脱臼处死大鼠,迅速剖开腹腔,剖取子宫,悬挂于盛有乐式液并通有氧气的培养皿中,剪去子宫周围脂肪和结缔组织,然后从两个子宫角各剪取长约2cm的肌条,每根肌条沿肌肉束方向纵向剖为两半。将剖好的子宫肌条悬挂于盛有37℃恒温并通有氧气的乐氏液的麦氏浴槽中,并与肌力换能器相连,肌条平衡40min后记录子宫肌条自发性收缩30min。结果表明,DSS-A-N-30对大鼠离体子宫平滑肌收缩频率、平滑肌张力及子宫活动力增强均具有明显的抑制作用(表4)。
表4.DSS-A-N-30对大鼠离体子宫平滑肌自发收缩的影响
注:“-”表示频率、收缩力及活动力降低;*p<0.05,**p<0.01;与空白对照组比较;Mean±SD,n=8-9
2.DSS-A-N-30对缩宫素诱导的大鼠离体子宫平滑肌收缩功能的影响
子宫肌条制备过程同上所述,待肌条自发性收缩10min后,加缩宫素(终浓度10U/l)导致子宫肌条剧烈收缩,15min后加药物,观察加药后15min内肌条的变化。结果表明,DSS-A-N-30对缩宫素诱导的大鼠离体子宫平滑肌收缩频率、平滑肌张力及子宫活动力增强均具有明显的抑制作用(表5)。
表5.DSS-A-N-30对缩宫素诱导大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响
注:“-”表示频率、收缩力及活动力降低;**p<0.01,与蒸馏水组比较;##p<0.01,与缩宫素处理组比较;Mean±SD,n=8-9
本实验结果表明,口服给予DSS-A-N-30对大鼠离体子宫平滑肌的自然收缩和缩宫素诱导的收缩均具有明显的抑制或缓解作用。表明DSS-A-N-30对大鼠离体子宫平滑肌的收缩功能具有明显的调节作用。上述结果提示,DSS-A-N-30对多种因素所致的子宫平滑肌的收缩功能紊乱具有改善或调节作用,临床可用于子宫平滑肌的收缩功能紊乱相关疾病如痛经、子宫内膜炎、子宫内膜异位症、不孕症、习惯性流产等预防和治疗。
三、DSS-A-N-30对去卵巢大鼠生殖内分泌功能的调节作用
1.口服DSS-A-N-30对去卵巢大鼠尾皮温的影响
去卵巢更年期模型大鼠制备按下述方法进行:雌性SD大鼠,180-220g,腹腔注射氯胺酮62.5mg/kg麻醉,分别用碘酒和75%酒精消毒腹部,于下腹部正中线做2cm切口,分别取出双侧卵巢并切除结扎,用注射器滴入适量庆大霉素,缝合肌层及腹部皮肤,手术后恢复5天,然后连续观察动情周期5天,均表现为动情间期者为造模成功动物,设立正常对照组和假手术组手术组。确定造模成功后,各组每日给予相应中药,每5日记录动物体重,并隔日记录动物肛温、尾皮温的变化。结果表明,去卵巢大鼠肛温无明显变化,尾皮温明显升高,口服DSS-A-N-30可明显降低去卵巢大鼠尾皮温(表6)。
表6.DSS-A-N-30对去卵巢大鼠尾皮温的影响
注:**p<0.01,与正常对照组比较;#p<0.05,##p<0.01,与去卵巢组比较;Mcan±SD,n=8
2.口服DSS-A-N-30对去卵巢大鼠血清雌二醇浓度的影响
去卵巢更年期模型大鼠制备按前述方法进行,确定造模成功后,各组每日给予相应中药,记录动物体重及体温,口服药物60天后处死动物,分离血清,应用放射免疫分析检测试剂盒(天津协和生物技术研究所产品)检测雌二醇浓度。具体操作过程按试剂盒说明进行,操作程序及加样量(μl)如下表所示,标准品、NSB、T均为双管。
小鼠血清雌二醇检测操作程序
结果表明,去卵巢大鼠血清雌二醇浓度明显下降,口服DSS-A-N-30可明显升高去卵巢大鼠血清雌二醇浓度,提示SAMP8学习记忆功能的低下可能与其血清雌二醇水平异常有关,DSS-A-N-30改善SAMP8学习记忆功能低下的作用可能与其升高血清雌二醇水平相关(表7)。
表7.DSS-A-N-30对去卵巢大鼠血清雌二醇水平的影响
注:**p<0.01,与正常对照组比较;#p<0.05,##p<0.01,与去卵巢组比较;Mean±SD,n=8
3.口服DSS-A-N-30对去卵巢大鼠垂体促黄体生成素(LH)含量的影响
去卵巢更年期模型大鼠制备按前述方法进行,确定造模成功后,各组每日给予相应中药,每5日记录动物体重,并隔日记录动物肛温、尾皮温的变化,口服药物60天后股动脉放血处死动物,冰浴剥离垂体,采用western-blot法检测垂体LH含量。结果表明,去卵巢大鼠垂体LH含量明显升高,口服DSS-A-N-30对可明显降低去卵巢大鼠垂体LH含量(图7)。
3.口服DSS-A-N-30对去卵巢大鼠下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)含量的影响
去卵巢更年期模型大鼠制备按前述方法进行,确定造模成功后,各组每日给予相应中药,口服药物60天后股动脉放血处死动物,冰浴剥离下丘脑,采用放射免疫分析法测定GnRH含量。结果表明,去卵巢大鼠下丘脑GnRH含量明显升高,口服DSS-A-N-30可明显降低去卵巢大鼠下丘脑GnRH含量(表8)。
表8.DSS-A-N-30对去卵巢大鼠下丘脑GnRH水平的影响
注:*p<0.05,与正常对照组比较;#p<0.05,与去卵巢组比较;Mean±SD,n=8
4.口服DSS-A-N-30对去卵巢大鼠骨密度及骨矿盐含量的影响
去卵巢更年期模型大鼠制备按前述方法进行,确定造模成功后,各组每日给予相应中药,口服药物60天后股动脉放血处死动物,剥离右侧股骨,双能X射线骨扫描仪扫描单侧股骨密度及骨矿盐含量。结果表明,去卵巢大鼠骨密度及骨矿盐含量明显降低,口服DSS-A-N-30对去卵巢大鼠骨密度及骨矿盐含量具有明显的恢复作用(表9)。
表9.DSS-A-N-30对去卵巢大鼠骨密度及矿盐含量的影响
注:*p<0.05,与正常对照组比较;#p<0.05,##p<0.01,与去卵巢组比较;Mean±SD,n=8
本实验结果表明,口服给予DSS-A-N-30对去卵巢更年期综合征模型大鼠尾皮温升高、血清雌二醇水平的降低、垂体LH和下丘脑GnRH水平的升高均具有明显改善作用,并能明显改善去卵巢大鼠骨密度的降低及骨矿盐含量的减少。表明DSS-A-N-30对去卵巢更年期综合征模型大鼠所表现的生殖内分泌功能低下或性腺轴平衡失调具有明显改善或调节作用,并对其所引起的骨密度下降和骨矿盐丢失均有改善作用。上述结果提示,DSS-A-N-30对衰老所致生殖内分泌功能低下或性腺轴平衡紊乱均具有改善或调节作用,临床可用于生殖内分泌功能低下或性腺轴平衡紊乱的相关疾病如更年期综合症、内分泌失调所致黄褐斑、卵巢功能低下、不孕症、习惯性流产、植物神经紊乱、老年性功能衰退、骨质疏松等预防和治疗。
四、DSS-A-N-30对神经系统的作用
SAMR1(SAM-Resistance1)为抗快速老化亚系,其生理指标及平均生存期均与正常动物相似。SAMP8(SAM-Prone8)是SAMP系的一个亚系,以病理学习记忆功能呈增龄性加速衰退,中枢神经系统如皮层、海马等部位发生病理学改变为主要特征。本实验室于1994年10月由日本京都大学引进SAMR1和SAMP8,饲养繁殖并用于相关研究。以下实验选用6-7月龄SAMR1和SAMP8,雌雄各半,分别灌胃给予DSS-A-N-30(0.005、0.01、0.02g/kg)和0.05mg/kg的石衫碱甲(HupA),给药3个月后进行学习记忆功能评价。
1.口服DSS-A-N-30对快速老化模型小鼠(SAMP8)空间学习记忆行为的影响
空间辨识实验-Morris水迷宫实验(Morris Water Maze,MWM):每只动物经过训练后开始实验。动物自入水到爬到站台上所需的时间作为潜伏期。动物在爬上站台后,让动物在站台上站立;若动物在60s内未找到水池中的站台或未能爬上站台,则将动物引领置站台上站立,之后将动物从站台上取下,共进行5个训练日。将每只动物每天四个象限入水的潜伏期作一平均值(未爬上站台者潜伏期以60s计),6日做波动曲线以观察趋势。将站台从其所在位置移走,将动物分别从第一象限入水放入水池中,记录60s内动物游泳探索轨迹,记录动物60s内探索游过原站台所在位置区域的次数(即穿环次数),并记录动物的游泳总距离和目标象限停留的时间和探索过的距离。
实验结果表明,与同龄SAMR1相比,SAMP8潜伏期显著延长,灌胃给予DSS-A-N-30和石衫碱甲(HupA)可明显缩短SAMP8的潜伏期,增加SAMP8的探索总距离,显著提高SAMP8 1min内穿环次数,表明DSS-A-N-30能改善SAMP8低下的学习记忆能力,并可以增强SAMP8的体能。(图8)。
2.口服DSS-A-N-30对SAMP8被动回避学习记忆行为的影响
被动回避实验-跳台实验(Step Down,SD):实验连续进行2天,第一天为学习阶段,将小鼠面向墙角轻轻放置于站台上,首先让动物适应环境3min,然后通以36伏交流电。若动物跳下站台则受电击,其正常反应应该是跳回站台以躲避伤害性刺激,多数动物可能会再次或多次跳至网栅上,受到电击后又迅速跳回站台。观察10min并记录后5min内小鼠跳下站台的潜伏期和次数,称为“错误数”。第2天为测试阶段,将小鼠放置于站台上,观察并记录3min内小鼠跳下站台而遭受电击的次数和潜伏期。
SAMR1及SAMP8在给药3个月后进行跳台实验。结果表明,SAMP8的记忆潜伏期比SAMR1显著降低,而给予石衫碱甲(HupA)及DSS-A-N-30后可延长学习和记忆潜伏期的作用。随记忆测试天数的增加,SAMP8的记忆保持率快速下降,与SAMR1比较差异愈为明显,而给予DSS-A-N-30后有显著的改善作用。同样,在这5天的测试中SAMP8的错误总次数远远高于SAMR1,给予HupA和DSS-A-N-30可明显减少错误总次数(图9)。
从以上结果可以看出,SAMP8的被动回避学习记忆功能与SAMR1相比明显衰退,口服DSS-A-N-30具有明显的改善作用。
3.口服DSS-A-N-30对SAMP8血清雌二醇浓度的影响
应用放射免疫分析检测试剂盒(天津协和生物技术研究所产品)检测雌二醇浓度。具体操作过程按试剂盒说明进行,操作程序及加样量(μl)如下表所示,标准品、NSB、T均为双管。
小鼠血清雌二醇检测操作程序
结果表明,SAMP8血清雌二醇水平明显低于SAMR1,口服DSS-A-N-30可明显升高雌性SAMP8的血清雌二醇浓度(图10)。
4.DSS-A-N-30含药血清对PC12细胞存活率的影响
大鼠含药血清的制备:SD大鼠,雌雄各半,按体重随机分组,每组4只。每日一次,连续三天灌胃给予蒸馏水及DSS-A-N-30。于末次给药1h后无菌条件下取股动脉血。全血于4℃放置6h后离心(2500rpm,25min),分离血清,经56℃ 30min灭活,0.45μm滤膜过滤除菌后分装-20℃冻存备用。
取生长状态良好的PC12细胞,一般传代方法进行消化,制成细胞悬液,离心(1000rpm,5min),倾去上清液,计数后将细胞稀释为约3×105个/ml,接种于96孔培养板,加入10%的空白血清及不同剂量的含药血清,每孔共100μl,37℃5%CO2孵箱培养24h后,吸去培养液,以用1640液洗2遍,每孔加入含5mg/ml的MTT20μl,培养4h后吸去培养液,每孔加入10%SDS100μl,孵育16h后用多孔扫描分光光度计测定样品在570nm波长处的吸光度值(OD570)。
结果显示,DSS-A-N-30含药血清(DSS-A-N-30CS)具有显著提高正常PC12细胞存活率的作用,并且表现出一定的促进增殖作用(图11)。
5.DSS-A-N-30含药血清对PC12细胞Na2S2O4缺氧损伤的影响
MTT法检测DSS-A-N-30含药血清对PC12细胞Na2S2O4缺氧损伤的保护作用:取生长状态良好的PC12细胞,一般传代方法进行消化,制成细胞悬液,离心(1000rpm,5min),倾去上清液,计数后将细胞稀释为约3×105个/ml,接种于96孔培养板,每孔100μl,每组复5孔。37℃5%CO2孵箱培养24h后,吸去培养液,以不同剂量的含药血清(10%)与5mM的Na2S2O4共同孵育,培养16h后,MTT法检测OD570值(同上)。
与空白血清组相比,5mM Na2S2O4处理能使细胞存活率显著降低,DSS-A-N-30CS可以明显抑制Na2S2O4所致的细胞缺氧损伤,提高细胞存活率(图12)。
本实验结果表明,口服给予DSS-A-N-30可明显缩短水迷宫实验中SAMP8的逃避潜伏期,增加SAMP8的探索总距离,显著提高SAMP8 1min内穿环次数;延长被动回避实验中SAMP8的学习和记忆潜伏期和记忆保持率;升高雌性SAMP8的血清雌二醇浓度;显著提高正常PC12细胞存活率的作用,并且表现出一定的促进增殖作用;明显抑制Na2S2O4所致的细胞缺氧损伤,提高细胞存活率。表明DSS-A-N-30对SAMP8学习记忆功能低下具有明显改善作用,且具有一定的神经保护和神经营养作用。
上述结果提示,DSS-A-N-30对衰老、性腺功能低下等因素相关的学习记忆功能低下具有改善或调节作用,对缺氧等因素引起的神经细胞损伤具有明显的保护作用。临床可用于衰老相关学习记忆功能低下、老年性痴呆等及性腺功能低下相关疾病如更年期综合征、植物神经紊乱等的预防和治疗。
Claims (9)
1.当归芍药方提取物DSS-A-N-30,其包括,以提取物重量计,36.0-44.0重量%的总苷(芍药苷、白芍苷等)。
2.一种产品或药物组合物,其包括含有36.0-44.0重量%的总苷(芍药苷、白芍苷等)当归芍药方提取物DSS-A-N-30及药用载体。
3.当归芍药方提取物DSS-A-N-30的制备方法,其包括:
i)将由当归、芍药、茯苓、白术、泽泻、川芎按3∶16∶4∶4∶8∶8组成的混合物用沸水蒸煮三次,过滤,得到提取液,然后浓缩至比重1.2;
ii)浓缩液进行柱层析,用水和极性有机溶剂洗脱,有机溶剂洗脱液浓缩后得部位DSS-A-N-30。
4.权利要求3所述方法,其中所用大孔吸附树脂可为所有型号的弱极性大孔吸附树脂;大孔吸附树脂层析洗脱所用的极性有机溶剂为所有大孔树脂所能允许使用的有机溶剂(如:甲醇、乙醇、丙醇和丙酮等)浓度范围为5%-95%。
5.根据权利要求1的提取物,其中所述提取物是用于治疗与疼痛、衰老及生殖内分泌功能低下或紊乱相关的疾病(特别是痛经、月经不调、流产、更年期综合征、老年痴呆、卵巢功能低下等)的提取物。
6.权利要求2的产品或药物组合物,其中所述产品或药物组合物是用于治疗与疼痛、衰老及生殖内分泌功能低下或紊乱相关的疾病(特别是痛经、月经不调、流产、更年期综合征、老年痴呆、卵巢功能低下等)的产品或药物组合物。
7.权利要求1的提取物在制备用于治疗与疼痛、衰老及生殖内分泌功能低下或紊乱相关的疾病(特别是痛经、月经不调、流产、更年期综合征、老年痴呆、卵巢功能低下等)的产品中用途。
8.权利要求1的提取物,以提取物重量计,其含有7.8-9.4%重量%白芍苷。
9.权利要求1的提取物,以提取物重量计,其含有28.33-33.53%重量%芍药苷。
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