CN116218778B - 一种在体外抑制人胰腺癌细胞上皮间质转化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物及医药领域，具体而言，涉及一种在体外抑制人胰腺癌细胞上皮间质转化的方法。经过体外细胞实验发现，大黄蛰虫丸可以抑制对TGFβ1诱导的人胰腺癌细胞Panc1的细胞上皮间质转化，其具体表现是大黄蛰虫丸能够显著的抑制细胞上皮间质转化标志物vimentin和N‑Cadherin的表达，同时促进E‑Cadherin的表达。

Description

一种在体外抑制人胰腺癌细胞上皮间质转化的方法
技术领域
本发明涉及生物及医药领域，具体而言，涉及一种在体外抑制人胰腺癌细胞上皮间质转化的方法。
背景技术
大黄蛰虫丸源于汉·张仲景《金匮要略》，其功能祛瘀生新、缓中补虚，主治内有干血、肌肤甲错、两目黯黑的淤血内阻症。有文献报道其能减轻肝纤维化，减轻肺纤维化大鼠初期肺泡炎症程度并抑制肺组织中TNFα的表达。
研究表明，上皮间质转化（EMT）在许多恶性肿瘤的侵袭和转移过程中起到重要的作用。肿瘤的增殖、凋亡、侵袭、转移是肿瘤发生发展的重要环节，其过程受到多种因素的调控和影响，其中上皮间质转化对肿瘤的各个发展期均有不同的影响。
目前尚未有报道大黄蛰虫丸与上皮间质转化之间的关联。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种在体外抑制人胰腺癌细胞上皮间质转化的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种在体外抑制人胰腺癌细胞上皮间质转化的方法，采用含有大黄蛰虫丸制剂的培养基，对TGFβ1诱导的人胰腺癌细胞Panc1进行培养，所述TGFβ1诱导的人胰腺癌细胞Panc1为对数生长期的Panc1细胞，培养的细胞密度为5×104/ml。
进一步，所述大黄蛰虫丸制剂为大黄蛰虫含药血清；所述培养基中，所述大黄蛰虫含药血清的质量百分数为5%~20%。
进一步，所述培养基中还包括含有质量百分数为10%FBS的DMEM 培养基。
进一步，所述大黄蛰虫含药血清的制备方法包括以下步骤：取SD大鼠15只，给予大黄蛰虫丸0.45 g·kg-1·d-1，每日1次，持续7 d；末次给药1 h后，进行腹腔内麻醉，并在无菌条件下进行腹主动脉取血；将取出的血液在常温静置2h，之后以3000r/min离心，离心半径为13.5 cm；离心15 min后，取上清液；将所述上清液在56℃下灭活30 min，再用0.22μm无菌滤器过滤除菌。
进一步，还包括检测培养后的细胞活力的步骤。
进一步，还包括检测培养后的细胞中细胞上皮间质转化标志物的mRNA表达和/或蛋白表达的步骤。
进一步，所述细胞上皮间质转化标志物为E-cadherin、vimentin和N-cadherin。
本发明的有益效果是：通过含有大黄蛰虫含药血清对人胰腺癌细胞Panc1细胞活力的影响、对Panc1细胞上皮间质转化标志物E-cadherin、vimentin和N-cadherin mRNA表达的影响以及对Panc1细胞上皮间质转化标志物E-cadherin、vimentin和N-cadherin 蛋白表达的影响，考察大黄蛰虫丸对胰腺癌细胞上皮间质转化的作用机理，以期发现大黄蛰虫丸的新用途。经实验发现，含有大黄蛰虫丸成分的血清对于对TGFβ1诱导的Panc1细胞上皮间质转化（EMT）具有明显抑制作用，其表现为明显抑制EMT标志物vimentin和N-Cadherin的表达和促进E-Cadherin的表达。
附图说明
图1为本发明的实施例中，各实验组的大黄蛰虫含药血清（DHZC）对Panc1细胞活力的影响对比图；
图2为本发明的实施例中，大黄蛰虫含药血清（DHZC）对各个Panc1细胞上皮间质转化标志物mRNA表达的对比图；图2中A为各实验组中Panc1细胞上皮间质转化标志物E-cadherin的mRNA表达的对比图，图2中B为各实验组中Panc1细胞上皮间质转化标志物vimentin的mRNA表达的对比图，图2中C为各实验组中Panc1细胞上皮间质转化标志物N-cadherin 的mRNA表达的对比图；
图3为本发明的实施例中，大黄蛰虫含药血清（DHZC）对Panc1细胞上皮间质转化标志物E-cadherin蛋白表达的对比图；图3中A为各实验组中E-cadherin蛋白表达的荧光检测图，图3中B为各实验组中E-cadherin蛋白表达量的对比图；
图4为本发明的实施例中，大黄蛰虫含药血清（DHZC）对Panc1细胞上皮间质转化标志物vimentin蛋白表达的影响图；图4中A为各实验组中vimentin蛋白表达的荧光检测图，图4中B为各实验组中vimentin蛋白表达量的对比图；
图5为本发明的实施例中，大黄蛰虫含药血清（DHZC）对Panc1细胞上皮间质转化标志物N-cadherin蛋白表达的影响图；图5中A为各实验组中N-cadherin蛋白表达的荧光检测图，图5中B为各实验组中N-cadherin蛋白表达量的对比图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明采用大黄蛰虫含药血清对Panc1细胞的活力影响进行测试，发现采用含有大黄蛰虫含药血清浓度为20%的培养基培养的Panc1细胞活力明显降低；同时，经过检测细胞上皮间质转化标志物E-cadherin、vimentin和N-cadherin的mRNA以及蛋白表达的影响，得到了基因水平和蛋白水平上，大黄蛰虫含药血清均对TGFβ1诱导的胰腺癌Panc1细胞上皮间质转化（EMT）具有抑制作用的结果，说明采用含有大黄蛰虫丸制剂的培养基在体外对Panc1细胞培养时，能够有效抑制细胞上皮间质转化的方法。
本发明通过使用含有大黄蛰虫丸的制剂，实现在体外抑制人胰腺癌细胞上皮间质转化，不仅为抑制人胰腺癌细胞上皮间质转化提供了新的制剂，而且拓展了大黄蛰虫丸的应用领域。
另外，由于胰腺癌的上皮间质转化与胰腺癌细胞的侵袭和转移过程中起到重要的作用，本发明的方法还对未来将大黄蛰虫丸应用于治疗胰腺癌的新方法奠定了基础。
以下通过具体的实施例对本发明进行具体说明。
实施例
本实施例采用的大黄蛰虫丸（DHZC）购买自北京同仁堂，其具体的成分为，熟大黄，土鳖虫（炒），水蛭（制），虻虫（去翅足.炒），蛴螬（炒），干漆（煅），桃仁，炒苦杏仁，黄芩，地黄，白芍，甘草。
优选的，大黄蛰虫丸的具体配方为，熟大黄300g，土鳖虫（炒）30g，水蛭（制）60g，虻虫（去翅足，炒）45g，济螬（炒）45g，干漆（煅）30g，桃仁120g，苦杏仁（炒）120g，黄芩60g，地黄300g，白芍120g，甘草90g。 制发：以上十二味，粉碎成细粉，过筛，混匀。每100g粉末用炼蜜30-15g加适量的水泛丸．干燥．制成水蜜丸；或加炼蜜80-100g制成小蜜丸或大蜜丸．即得。
本实施例采用的人胰腺癌细胞Panc1，购自上海盖宁生物科技有限公司。
（1）大黄蛰虫含药血清制备
取SD大鼠15只，每只给予大黄蛰虫丸0.45 g·kg-1·d-1，每日1次，持续7 d。末次给药1 h后，进行腹腔内麻醉，并在无菌条件下进行腹主动脉取血。将取出的血液在常温静置2h，之后以3000r/min离心，离心半径为13.5 cm。离心15 min后，取上清液，分装并标记。将得到的各分装的上清在56℃下灭活30 min，再用0.22μm无菌滤器过滤除菌，除菌后在-80℃的条件下快速冻固保存，待用。
（2）空白血清制备
取SD大鼠15只，对每只大鼠进行腹腔内麻醉，在无菌条件下进行腹主动脉取血，常温静置2 h，之后以3 000r/min离心，离心半径13.5 cm。离心15 min后，取上清液，分装并标记。将得到的各分装的上清在56℃灭活30 min，再用0.22μm无菌滤器过滤除菌，除菌后在-80℃的条件下快速冻固保存，待用。
（3）大黄蛰虫含药血清（DHZC）对Panc1细胞活力的影响：
取对数生长期的Panc1细胞，用含10%FBS的DMEM 培养基调整细胞密度至5×104/ml，取100ul接种于96孔板中过夜。
分别设置正常组（Control组）、5%DHZC浓度组、10%DHZC浓度组、15%DHZC浓度组以及20%DHZC浓度组。
其中，正常组含有20%空白血清与基础培养基的混合物；5%DHZC浓度组含有为5%含药血清、15%空白血清和基础培养基；10%DHZC浓度组含有10%含药血清、10%空白血清和基础培养基；15%DHZC浓度组含有15%含药血清、5%空白血清和基础培养基；20%DHZC浓度组含有20%含药血清和基础培养基。
将上述每个实验组的溶液分别加入6个复孔中进行培养。分别在培养24h、48h、72h后，向每孔加入10ul CCK8溶液，继续孵育4h后检测细胞活力，检测的结果如图1所示。
根据图1可知，与Control组比，不同浓度DHZC作用Panc1 24、48、72h后，Panc1细胞活力均明显降低（P<0.05）。其中20% DHZC组在48h作用效果最明显（P<0.01），且72h与48h效果相当，故后续实验选择20% DHZC作用48h。
（4）大黄蛰虫含药血清（DHZC）对Panc1细胞上皮间质转化标志物E-cadherin、vimentin和N-cadherin mRNA表达的影响：
取对数生长期Panc1细胞，用含10%FBS的DMEM 培养基调整细胞密度至2×105/ml。取2ml细胞溶液接种于6孔板中，待细胞贴壁后，用PBS清洗细胞，之后加入新鲜无血清培养基饥饿过夜。
分别设置正常组（Control组）、10ng/mL TGFβ1组（TGFβ1组）以及20%大黄蛰虫含药血清组（DHZC组），DHZC组中也含有10ng/mLTGFβ1。
继续培养48h后，收集细胞，按照Total RNA Extraction Kit (DNase Ⅰ) 试剂盒(GenePool，Cat# GPQ1801)说明书提取总RNA，按照mRNA cDNA Synthesis Kit (GenePool，Cat# GPQ1803)说明书合成cDNA后，再按照mRNA/lncRNA qPCR Kit (GenePool，Cat#GPQ1808)说明书进行荧光定量PCR反应，以GAPDH为内参。
采用2-ΔΔCt方法计算E-cadherin、vimentin和N-cadherin的相对表达量，结果如图2所示。
由图2可知，与Control组比，TGFβ1组细胞中E-Cadherin mRNA表达明显降低（P<0.01），vimentin和N-Cadherin mRNA表达明显升高（P<0.01），表明在10ng/mL TGFβ1作用48h时，Panc1细胞发生上皮间质转化。
与TGFβ1组比，DHZC组细胞中E-Cadherin mRNA表达明显升高（P<0.01），vimentin和N-Cadherin mRNA表达则明显降低（P<0.01），表明DHZC对TGFβ1诱导的胰腺癌Panc1细胞具有抑制其上皮间质转化（EMT）的作用。
（5）大黄蛰虫含药血清（DHZC）对Panc1细胞上皮间质转化标志物E-cadherin、vimentin和N-cadherin 蛋白表达的影响：
取对数生长期Panc1细胞，用含10%FBS的DMEM 培养基调整细胞密度至5×104/ml，取500ul接种于24孔板中，待细胞贴壁后，用PBS清洗细胞后加入新鲜无血清培养基饥饿过夜。
分别设置正常组（Control组）、10ng/mL TGFβ1组（TGFβ1组）以及20%大黄蛰虫含药血清组（DHZC组），DHZC组中也含有10ng/mLTGFβ1。继续培养48h后，用1ml 4%多聚甲醛固定细胞，再采用免疫荧光方法检测E-cadherin、vimentin和N-cadherin 蛋白表达情况，并用Image J软件对细胞E-cadherin、vimentin和N-cadherin表达量进行分析，结果如图3~5所示。
其中，免疫荧光方法检测的具体过程为：
4％多聚甲醛固定细胞15min，PBS洗3次，0.5％Triton X-100透化20min，PBS清洗3次，3％牛血清白蛋白（BSA）室温封闭30min，加入标志物一抗，4℃孵育过夜，PBS清洗3次（5min/次），加入对应的二抗（1：200），室温避光孵育2h，PBS清洗3次（5min/次），用含有4＇6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂进行封片，荧光显微镜观察并拍照。
需要说明的是，DAPI是染细胞核的，其余的颜色是二抗的颜色。如果一抗是兔来源的，二抗用Goat anti Rabbit IgG FITC，FITC是绿色荧光；如果一抗是小鼠来源的，二抗用Goat anti Mouse IgG Cy3，Cy3是红色荧光。免疫荧光染色拍照是在同一视野下不同颜色通道分别拍照，merge是利用软件将所有通道叠加在一起的结果。
由图3~5可知，与Control组比，TGFβ1组细胞中E-Cadherin 蛋白表达明显降低（P<0.01），vimentin和N-Cadherin mRNA表达明显升高（P<0.01），表明在10ng/mL TGFβ1作用48h时，Panc1细胞发生上皮间质转化。与TGFβ1组比，DHZCW组细胞中E-Cadherin 蛋白表达明显升高（P<0.01），vimentin和N-Cadherin 表达表达则明显降低（P<0.01），从蛋白水平上，进一步说明DHZC对TGFβ1诱导的胰腺癌Panc1细胞上皮间质转化（EMT）具有抑制作用。
在本发明的描述中，需要说明的是，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种在体外抑制人胰腺癌细胞上皮间质转化的方法，其特征在于，采用含有大黄蛰虫丸制剂的培养基对TGFβ1诱导的人胰腺癌细胞Panc1进行培养；所述TGFβ1诱导的人胰腺癌细胞Panc1为对数生长期的Panc1细胞；
所述大黄蛰虫丸制剂为大黄蛰虫含药血清；所述培养基中，所述大黄蛰虫含药血清的质量百分数为20%，作用时间为48h；
所述大黄蛰虫含药血清的制备方法包括以下步骤：取SD大鼠15只，给予大黄蛰虫丸0.45 g·kg-1·d-1，每日1次，持续7 d；末次给药1 h后，进行腹腔内麻醉，并在无菌条件下进行腹主动脉取血；将取出的血液在常温静置2h，之后以3000r/min离心，离心半径为13.5cm；离心15 min后，取上清液；将所述上清液在56℃下灭活30 min，再用0.22μm无菌滤器过滤除菌。
2.根据权利要求1所述一种在体外抑制人胰腺癌细胞上皮间质转化的方法，其特征在于，采用含有质量百分数为10%FBS的DMEM 培养基将接种的细胞密度调至5×104/ml~2×105/ml。
3.根据权利要求2所述一种在体外抑制人胰腺癌细胞上皮间质转化的方法，其特征在于，还包括检测培养后的细胞活力的步骤。
4.根据权利要求3所述一种在体外抑制人胰腺癌细胞上皮间质转化的方法，其特征在于，还包括检测培养后的细胞中细胞上皮间质转化标志物的mRNA表达和/或蛋白表达的步骤。
5.根据权利要求4所述一种在体外抑制人胰腺癌细胞上皮间质转化的方法，其特征在于，所述细胞上皮间质转化标志物为E-cadherin、vimentin和N-cadherin。
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