CN112094842A

CN112094842A - 一种环形阻滞探针、含有所述环形阻滞探针的扩增阻碍突变系统及其应用

Info

Publication number: CN112094842A
Application number: CN202011228392.9A
Authority: CN
Inventors: 程雪涛; 王洁; 焦柔; 张亚飞
Original assignee: Meijie Transformation Medical Research Suzhou Co ltd
Current assignee: Meijie Transformation Medical Research Suzhou Co ltd
Priority date: 2020-11-06
Filing date: 2020-11-06
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2040-11-06
Also published as: CN112094842B

Abstract

本发明提供了一种环形阻滞探针、含有所述环形阻滞探针的扩增阻碍突变系统及其应用，所述环形阻滞探针按照5’‑3’方向为第一结合序列、环状序列和第二结合序列，所述第一结合序列和第二结合序列互为反向重复序列；所述环形阻滞探针的3’端末1位碱基与模板的野生型位点互补；所述环形阻滞探针的3’末端修饰有阻滞基团；所述环形阻滞探针的环状序列与模板互补。本发明向扩增阻碍突变系统中加入环形阻滞探针，在PCR开始前环形阻滞探针优先结合在野生型模板上，对野生型模板进行封闭，随后采用特异性引物对突变模板进行PCR扩增，显著提高了PCR扩增的特异性，扩大了线性范围，实现了低频率突变样本的精确定量。

Description

一种环形阻滞探针、含有所述环形阻滞探针的扩增阻碍突变系统及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种环形阻滞探针、含有所述环形阻滞探针的扩增阻碍突变系统及其应用。

背景技术

骨髓增殖性肿瘤（MPN）通常伴有JAK2基因1849位（G/T）突变，导致该蛋白第617位的缬氨酸（V）突变为苯丙氨酸（F），从而引起一系列病变。在真性红细胞增多症（PV）患者中，JAK2-V617F突变率约为90%~95%，而在原发性血小板增多症（ET）和原发性骨髓纤维化（PMF）中，JAK2-V617F的突变率约为50%~60%。世界卫生组织（WHO）明确将JAK2-V617F突变作为MPN主要诊断指标之一。随着新药芦可替尼（捷恪卫）的上市，市场上也逐渐有了定量检测JAK2-V617F的需求，通过对该基因突变频率进行定量监测，能够判断药效并建立用药方案，且能够用于监测微小残留病（MRD），具有新的临床意义。

扩增阻碍突变系统（ARMS）是指采用3’末端对应于突变位点的引物进行扩增的技术，当引物3’末端与突变位点匹配时，扩增反应发生，当不匹配时，扩增反应受到阻碍；同时，引物的倒数第2或第3位常设计有错配碱基，以进一步提高扩增特异性。ARMS常与荧光定量PCR技术相结合，利用荧光标记的特异性探针对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程：只有当ARMS引物3’末端碱基与对应的基因型模板完全互补配对时，PCR扩增反应才得以正常进行，得到特定扩增产物，并产生荧光信号；反之则不进行PCR扩增反应，不产生荧光信号（或Ct值非常高）。扩增结束后根据扩增曲线的荧光信号达到特定阈值时的循环数（Ct值），来判断样本是否携带某种突变基因型，并通过标准曲线法对待测样品的突变基因型进行定量分析。

然而，对于点突变检测，由于野生型与突变型只有一个碱基的区别，即使采用ARMS技术也会产生非特异性扩增，当突变频率很低时，突变型和野生型的Ct值无差别。荧光定量PCR基于标准曲线法进行定量，当模板突变频率较低时，线性表现差，整个反应的线性范围受到影响，不能实现对低频率突变样本的精确定量。

基于阻滞探针（Blocker）技术的ARMS-qPCR已得到广泛应用，Blocker的3’末端修饰有阻止PCR反应的基团，当Blocker与野生型模板结合时，扩增受阻，减少了非特异性扩增。然而，由于模板序列的差异，传统的Blocker往往不能有效减少非特异性扩增，并且也不能显著提高线性表现。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种环形阻滞探针、含有所述环形阻滞探针的扩增阻碍突变系统及其应用，所述环形阻滞探针在常温条件下处于环形结构的封闭状态，在高温条件下环形结构打开、互补结合在野生型模板上，抑制了PCR引物与野生型模板的结合，实现了对野生型模板的阻滞作用。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种环形阻滞探针，所述环形阻滞探针按照5’-3’方向为第一结合序列、环状序列和第二结合序列，所述第一结合序列和第二结合序列互为反向重复序列；

所述环形阻滞探针的3’端末1位碱基与模板的野生型位点互补；

所述环形阻滞探针的3’末端修饰有阻滞基团；

所述环形阻滞探针的环状序列与模板互补。

本发明中，环形阻滞探针的第一结合序列和第二结合序列在非变性条件下互补结合，形成环形结构不与模板结合，一定程度上减少了对PCR反应的干扰，在高温变性条件下环形结构打开、结合在点突变对应的野生型位点及其下游，阻碍了野生型模板的扩增。

优选地，所述环形阻滞探针的3’末端采用Spacer C3修饰。

优选地，所述环形阻滞探针的3’端末2~末5位含有1~2个错配碱基。

本发明中，在环形阻滞探针的3’端引入错配碱基，使得环形阻滞探针仅结合在野生型模板上，避免结合在点突变模板上，显著降低了非特异性扩增，提高了点突变模板的扩增特异性和线性范围。

优选地，所述第一结合序列的长度为3~5 bp，例如可以是3 bp、4 bp或5 bp。

优选地，所述第二结合序列的长度为3~5 bp，例如可以是3 bp、4 bp或5 bp。

第二方面，本发明提供了一种扩增阻碍突变系统，所述扩增阻碍突变系统包括第一方面所述的环形阻滞探针。

优选地，所述扩增阻碍突变系统还包括PCR上游引物和PCR下游引物，所述PCR下游引物的3’端末1位碱基与模板的突变型位点互补。

优选地，所述PCR下游引物的3’端末2~末5位含有1~2个错配碱基。

本发明中，将PCR下游引物设计为3’端末1位碱基与模板的突变型位点互补、3’端末2~末5位含有1~2个错配碱基的序列，提高了PCR下游引物对点突变模板的特异性，避免了非特异性扩增。

优选地，所述环形阻滞探针的Tm值高于所述PCR下游引物的Tm值5~8℃。

本发明中，环形阻滞探针的Tm值高于PCR下游引物的Tm值，环形阻滞探针优先结合在野生型模板上，实现对野生型模板的封闭作用。

优选地，所述扩增阻碍突变系统还包括荧光探针。

本发明中，构建含有第一方面所述的环形阻滞探针的荧光定量扩增阻碍突变系统，在荧光定量PCR开始前，环形阻滞探针变性并打开环形结构，优先结合在野生型模板上，阻碍了野生型模板的扩增反应，在荧光定量PCR过程中，扩增阻碍突变系统的特异性引物完成对点突变模板的扩增反应，产生的扩增产物与荧光探针结合，实现了对点突变模板的定量检测。

第三方面，本发明提供了一种核酸检测试剂盒，所述核酸检测试剂盒包括第二方面所述的扩增阻碍突变系统。

优选地，所述核酸检测试剂盒还包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、UDG酶、dNTP和dUTP。

第四方面，本发明提供了一种核酸检测体系，所述核酸检测体系包括第一方面所述的环形阻滞探针；

所述核酸检测体系还包括PCR引物对、荧光探针、PCR缓冲液、DNA聚合酶、UDG酶、dNTP和dUTP。

优选地，所述核酸检测体系中环形阻滞探针的终浓度为500~800 nM，例如可以是500 nM、600 nM、700 nM或800 nM，优选为600 nM。

优选地，所述核酸检测体系中PCR引物对的终浓度为500~800 nM，例如可以是500nM、600 nM、700 nM或800 nM，优选为600 nM。

优选地，所述核酸检测体系中荧光探针的终浓度为100~300 nM，例如可以是100nM、200 nM或300 nM，优选为200 nM。

优选地，所述核酸检测体系中DNA聚合酶的终浓度为0.1~0.3 U/μL，例如可以是0.1 U/μL、0.2 U/μL或0.3 U/μL，优选为0.14 U/μL。

优选地，所述核酸检测体系中UDG酶的终浓度为0.01~0.02 U/μL，优选为0.012 U/μL。

优选地，所述核酸检测体系中dNTP的终浓度为100~300 μM，例如可以是100 μM、200 μM或300 μM，优选为200 μM。

优选地，所述核酸检测体系中dUTP的终浓度为200~500 μM，例如可以是200 μM、300 μM、400 μM或500 μM，优选为400 μM。

第五方面，本发明提供了一种核酸检测方法，所述核酸检测方法包括：

将待测DNA模板加入第四方面所述的核酸检测体系中，40~60℃预处理1~5 min；92~98℃预变性1~5 min；92~98℃变性10~30 s，55~65℃退火延伸0.5~2 min，45~55个循环。

优选地，所述待测DNA模板来源于细胞、囊泡或组织切片中。

优选地，所述细胞包括真核细胞和/或原核细胞。

优选地，所述囊泡包括微囊泡、外泌体、凋亡小体、人工囊泡或颗粒中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述组织切片包括冰冻切片和/或石蜡切片。

第六方面，本发明提供了第一方面所述的环形阻滞探针、第二方面所述的扩增阻碍突变系统、第三方面所述的核酸检测试剂盒或第四方面所述的核酸检测体系在制备基因检测试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明的环形阻滞探针在非变性条件下，形成环形结构不与模板结合，在高温变性条件下环形结构打开、结合在点突变对应的野生型位点及其下游，所述环形阻滞探针的3’端具有阻滞基团和错配碱基，使得环形阻滞探针仅结合在野生型模板上并阻滞野生型模板扩增；

（2）本发明的含有环形阻滞探针的扩增阻碍突变系统，环形阻滞探针首先打开环形结构并优先结合在野生型模板上，实现对野生型模板的封闭作用，在荧光定量PCR过程中，扩增阻碍突变系统的特异性引物完成对点突变模板的扩增反应，产生的扩增产物与荧光探针结合，实现对点突变模板的定量检测；

（3）本发明采用含有环形阻滞探针的扩增阻碍突变系统特异性高，线性范围覆盖0.04%至100%（50 ng DNA上样量），实现了低频率突变样本的精确定量检测。

附图说明

图1为环形阻滞探针的阻滞原理示意图；

图2为标准品的荧光定量PCR曲线对比图；

图3为标准品（最低频率为0.05%）的标准曲线对比图；

图4为标准品（最低频率为0.04%）的标准曲线图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1 含有环形阻滞探针的扩增阻碍突变系统的检测原理

环形阻滞探针的阻滞原理如图1所示，在非变性条件下，环形阻滞探针的第一结合序列和第二结合序列互补结合，形成环形结构，不与模板结合，一定程度上减少了对PCR反应的干扰；在高温变性条件下，环形阻滞探针的第一结合序列和第二结合序列解链、环形结构打开，阻滞探针特异性结合在点突变对应的野生型位点及其下游，阻碍野生型模板的扩增。

含有上述环形阻滞探针的荧光定量扩增阻碍突变系统的检测原理如下：在荧光定量PCR开始前，环形阻滞探针变性并打开环形结构，优先结合在野生型模板上，阻碍野生型模板的扩增反应；在荧光定量PCR过程中，扩增阻碍突变系统的特异性下游引物与上游引物相互配合，完成对点突变模板的扩增反应，产生的扩增产物与荧光探针结合，实现对点突变模板的定量检测。

实施例2 JAK2-1849G/T突变的定量检测

本实施例以人类JAK2基因组DNA（NCBI：NG_009904.1）为模板，针对1849G/T突变位点，设计PCR引物对、荧光探针和环形阻滞探针。

其中，特异性下游引物的3’末端位于该突变位点，与突变型（T）互补，考虑到下游引物的3’末端与野生型模板为A/G强错配，则在下游引物的3’端倒数第3位引入一个A/C弱错配；环形阻滞探针的3’末端位于该突变位点，与野生型（G）互补，考虑到环形阻滞探针的3’末端与突变型模板为C/T强错配，则在环形阻滞探针的3’端倒数第3位引入一个A/C弱错配，引入该错配后，环形阻滞探针的5’端前4位碱基与3’端倒数4位碱基互补（GTTT-AAAC）。

具体序列如下：

特异性下游引物如SEQ ID NO: 2所示，Tm值为51.1℃，GC含量43%；

SEQ ID NO: 2：5’-CTTACTCTCGTCTCCACAaAA-3’；

根据特异性下游引物位置，设计上游引物，序列如SEQ ID NO: 1所示，Tm值为57.7℃，GC含量38%，扩增片段长度为140 bp；

SEQ ID NO: 1：5’-TGGACAACAGTCAAACAACAATTC-3’；

荧光探针如SEQ ID NO: 3所示，Tm值为68.8℃，GC含量41%，5’端修饰FAM荧光基团，3’端修饰BHQ1淬灭基团；

SEQ ID NO: 3：

5’-FAM-AAGCTTGCTCATCATACTTGCTGCTTCAAAGA-BHQ1-3’；

环形阻滞探针如SEQ ID NO: 4所示，Tm值为57℃（高于特异性下游引物5-6℃），GC含量41%，3’端修饰Spacer C3；

SEQ ID NO: 4：

5’-GTTTTACTTACTCTCGTCTCCACAaAC-spacer C3-3’。

基因组DNA模板采用Horizon公司JAK2-V617F基因组DNA标准品（HD649）和JAK2野生型基因组DNA标准品（HD652）混合制备而成。

配制如表1所示的反应体系，分装至8联管中，使用ABI 7500荧光定量PCR仪进行PCR扩增，扩增条件如表2所示。

表1

表2

实施例3 结果分析

实验结果的荧光定量PCR曲线如图2所示，与未加入阻滞探针的反应体系相比，加入阻滞探针后，野生型非特异性扩增明显降低；而加入了环形阻滞探针的反应体系，其特异性好于加入非环形阻滞探针的反应体系。另外，从扩增曲线上看，加入了环形阻滞探针后，低频率样本的重复性好，不同频率的样本的扩增曲线区别明显，说明Ct值方差小，检测结果更准确。

实验结果的标准曲线如图3所示，在样本突变频率低至0.05%的情况下，加入了环形阻滞探针的反应体系，其标准曲线的线性（R²=0.991，Eff%=97.648）明显优于未加入阻滞探针（R²=0.928，Eff%=91.499）和加入非环形阻滞探针（R²=0.94，Eff%=106.68）的反应体系。关于JAK2-V617F定量，本领域普遍认为，R²≥0.98的标准曲线，其斜率可用于未知样品的定量，因此，只有本发明的加入了环形阻滞探针的反应体系构建的标准曲线可以用于低突变频率样本的准确定量检测。

加入了环形阻滞探针的反应体系的最大线性范围如图4所示，线性范围覆盖0.04%至100%的突变频率（R²=0.98，Eff%=95.764）。

综上所述，向扩增阻碍突变系统中加入环形阻滞探针，在PCR开始前环形阻滞探针优先结合在野生型模板上，显著提高了PCR扩增的特异性，并且扩大了线性范围，实现了低频率突变样本的精确定量。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 迈杰转化医学研究（苏州）有限公司

<120> 一种环形阻滞探针、含有所述环形阻滞探针的扩增阻碍突变系统及其应用

<130> 20201026

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggacaacag tcaaacaaca attc 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cttactctcg tctccacaaa a 21

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagcttgctc atcatacttg ctgcttcaaa ga 32

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttttactta ctctcgtctc cacaaac 27

Claims

1.一种环形阻滞探针，其特征在于，所述环形阻滞探针按照5’-3’方向为第一结合序列、环状序列和第二结合序列，所述第一结合序列和第二结合序列互为反向重复序列；

所述环形阻滞探针的环状序列与模板互补；

所述环形阻滞探针的3’末端修饰有阻滞基团；

所述环形阻滞探针的3’端末2~末5位含有1~2个错配碱基；

所述第一结合序列的长度为3~5 bp；

所述第二结合序列的长度为3~5 bp。

2.一种扩增阻碍突变系统，其特征在于，所述扩增阻碍突变系统包括权利要求1所述的环形阻滞探针；

所述扩增阻碍突变系统还包括PCR上游引物和PCR下游引物，所述PCR下游引物的3’端末1位碱基与模板的突变型位点互补；

所述PCR下游引物的3’端末2~末5位含有1~2个错配碱基；

所述环形阻滞探针的Tm值高于所述PCR下游引物的Tm值5~8℃。

3.根据权利要求2所述的扩增阻碍突变系统，其特征在于，所述扩增阻碍突变系统还包括荧光探针。

4.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒包括权利要求2或3所述的扩增阻碍突变系统；

所述核酸检测试剂盒还包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、UDG酶、dNTP和dUTP。

5.一种核酸检测体系，其特征在于，所述核酸检测体系包括权利要求1所述的环形阻滞探针；

6.根据权利要求5所述的核酸检测体系，其特征在于，所述核酸检测体系中环形阻滞探针的终浓度为500~800 nM；

所述核酸检测体系中PCR引物对的终浓度为500~800 nM；

所述核酸检测体系中荧光探针的终浓度为100~300 nM；

所述核酸检测体系中DNA聚合酶的终浓度为0.1~0.3 U/μL；

所述核酸检测体系中UDG酶的终浓度为0.01~0.02 U/μL；

所述核酸检测体系中dNTP的终浓度为100~300 μM；

所述核酸检测体系中dUTP的终浓度为200~500 μM。

7.一种核酸检测方法，其特征在于，所述核酸检测方法包括：

将待测DNA模板加入权利要求5或6所述的核酸检测体系中，40~60℃预处理1~5 min；92~98℃预变性1~5 min；92~98℃变性10~30 s，55~65℃退火延伸0.5~2 min，45~55个循环。

8.根据权利要求7所述的核酸检测方法，其特征在于，所述待测DNA模板来源于细胞、囊泡或组织切片中；

所述细胞包括真核细胞和/或原核细胞；

所述囊泡包括微囊泡、外泌体、凋亡小体、人工囊泡或颗粒中的任意一种或至少两种的组合；

所述组织切片包括冰冻切片和/或石蜡切片。

9.权利要求1所述的环形阻滞探针、权利要求2或3所述的扩增阻碍突变系统、权利要求4所述的核酸检测试剂盒或权利要求5或6所述的核酸检测体系在制备基因检测试剂中的应用。