CN111961623B - 一种复方乳酸菌制剂及其应用、复方脱霉剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种复方乳酸菌制剂及其应用、复方脱霉剂及其应用，涉及饲料脱霉剂技术领域。本发明提供的复方乳酸菌制剂，包括发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种；所述复方乳酸菌制剂的总有效活菌数≥108cfu/g；所述发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的有效活菌数之比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)。本发明提供的复方乳酸菌制剂的总有效活菌数高，存活率高，胃肠液耐受性好，温度耐受性好，储存时间长，降解霉菌毒素的广谱性好，能够解决饲料中存在的多种霉菌毒素同时污染的问题。
Description
技术领域
本发明涉及饲料脱霉剂技术领域，具体涉及一种复方乳酸菌制剂及其应用、复方脱霉剂及其应用。
背景技术
微生物脱霉剂是利用微生物降解霉菌毒素，将霉菌毒素转化为低毒或无毒产物，减少消化道中霉菌毒素的含量，细胞壁也具有一定的吸附霉菌毒素的能力，具有高效性、特异性、无毒副作用等优点。乳酸菌是可以将碳水化合物转化成大量乳酸的一类革兰氏阳性菌的统称。在体外乳酸菌可降解(ZEN)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、呕吐毒素(DON)、烟曲霉毒素B1(FB1)；在体内可减轻或遏制霉菌毒素对动物健康的不利影响。但是，饲料中的霉菌毒素种类繁多，霉菌毒素多重污染的问题非常严重，由于微生物降解霉菌毒素具有特异性特点以及存在转化为弱毒并非无毒产物的现象存在，具有广谱吸附霉菌毒素作用的吸附剂可以弥补不足，尽量达到保护动物健康、减少大量毒素排放到环境而造成的环境破坏双重效果。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种复方乳酸菌制剂及其应用、复方脱霉剂及其应用，本发明提供的复方乳酸菌制剂和复方脱霉剂均降解和吸附饲料中霉菌毒素的广谱性好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种复方乳酸菌制剂，包括发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种；所述发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的有效活菌数之比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；所述复方乳酸菌制剂的总有效活菌数≥108cfu/g。
优选的，所述复方乳酸菌制剂的总有效活菌数≥109cfu/g
优选的，所述复方乳酸菌制剂还包括冷冻保护剂。
本发明提供了一种复方脱霉剂，包括上述技术方案所述复方乳酸菌制剂和葡甘露聚糖改性蒙脱石。
优选的，所述复方乳酸菌制剂、葡甘露聚糖改性蒙脱石的质量比为(0.5～1.5):4。
优选的，所述葡甘露聚糖改性蒙脱石的制备方法，包括以下步骤：
将钠基蒙脱石和葡甘露聚糖溶液混合，调节pH值至3～6，进行改性反应，得到葡甘露聚糖改性蒙脱石。
优选的，以葡甘露聚糖的量计，所述钠基蒙脱石和葡甘露聚糖溶液的质量比为4：1。
优选的，所述改性反应的温度为30～40℃，时间为4～20h。
本发明还提供了上述技术方案所述复方乳酸菌制剂或上述技术方案所述复方脱霉剂作为饲料添加剂的应用。
优选的，所述复方乳酸菌制剂和复方脱霉剂在饲料中的添加量独立地为0.05～0.5wt％。
本发明提供了一种复方乳酸菌制剂，包括发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种；所述发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的有效活菌数之比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；所述复方乳酸菌制剂的总有效活菌数≥108cfu/g。本发明提供的复方乳酸菌制剂总有效活菌数高，存活率高，胃肠液耐受性好，温度耐受性好，储存时间长，降解霉菌毒素的广谱性好，能够解决饲料中存在的多种霉菌毒素同时污染的问题。如本发明实施例结果所示，本发明提供的复方乳酸菌制剂中的发酵乳杆菌对AFB1、ZEN和DON降解率分别为79.53％、67.04％和49.01％；嗜热链球菌对AFB1和DON的降解率为79.57％和76.10％，德氏乳杆菌保加利亚亚种对AFB1、ZEN和DON的降解率分别为78.53％、56.25％和29.06％；复方乳酸菌制剂对AFB1、ZEN、DON和FB1降解率分别为76.55％、42.07％、51.73％；而且本发明提供的复方乳酸菌制剂在pH＝4模拟胃液中复方乳酸菌制剂的存活率为51.89％，在0.1％胆酸盐的模拟肠液中复方乳酸菌制剂的存活率为72.14％，常规包装的复方乳酸菌制剂在50℃热处理10min后有效活菌数4.63×1010cfu/g，真空包装的复方乳酸菌制剂在50℃热处理10min后有效活菌数4.97×1010cfu/g；常规包装复方乳酸菌制剂的存储时间为30天后的有效活菌数5.80×1010cfu/g，真空包装的复方乳酸菌制剂的储存时间为45天有效活菌数是6.13×1010cfu/g。
本发明提供了一种复方脱霉剂，包括上述技术方案所述复方乳酸菌制剂和葡甘露聚糖改性蒙脱石。本发明提供的复方脱霉剂中，葡甘露聚糖改性蒙脱石的层间距扩大、孔隙增多，对饲料中的多种霉菌毒素均具有优异好的吸附性能；复方乳酸菌制剂对于对饲料中的多种霉菌毒素均具有优异的降解性能。本发明提供的复方脱霉剂能够提高蛋雏鸡生长性能、抗氧化能力和免疫功能，并能减轻霉菌毒素对肝脏的损伤。
附图说明
图1为发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的生长曲线图；
图2为AFM1标准品的总离子流谱图；
图3为AFL标准品总离子流谱图；
图4为实施例1制备的复方乳酸菌制剂降解后AFB1降解产物的总离子流谱图；
图5为α-ZAL标准品的总离子流谱图；
图6为β-ZAL标准品的总离子流谱图；
图7为α-ZEL标准品的总离子流谱图；
图8为β-ZEL标准品的总离子流谱图；
图9为实施例1制备的复方乳酸菌制剂降解后ZEN降解产物的总离子流谱图；
图10为3-AC-DON标准品的总离子流谱图；
图11为15-AC-DON标准品的总离子流谱图；
图12为DOM-1标准品的总离子流谱图；
图13为实施例1制备的复方乳酸菌制剂降解后DON降解产物的总离子流谱图；
图14为实施例2制备的葡甘露聚糖改性蒙脱石的FT-IR谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种复方乳酸菌制剂，包括发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种；所述复方乳酸菌制剂的总有效活菌数≥108cfu/g；所述发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的有效活菌数之比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。在本发明实施例中，发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种购自北京北纳生物创联生物技术研究院。
在本发明中，所述总有效活菌数≥108cfu/g，优选≥109cfu/g，更优选为1×1010cfu/g～9×1010cfu/g，最优选为5×1010cfu/g～9×1010cfu/g。
在本发明中，所述发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的有效活菌数之比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)，优选为(0.6～1.2)：(0.6～1.2)：(0.6～1.2)，更优选为(0.9～1.1)：(0.9～1.1)：(0.9～1.1)，最优选为1:1:1。
在本发明中，所述复方乳酸菌制剂优选还包括冷冻保护剂。在本发明中，所述冷冻保护剂优选包括生理盐水、脱脂乳粉、海藻糖和甘油。在本发明中，所述脱脂乳粉、海藻糖和甘油的质量比优选为(7～15)：(5～11)：(1～3)，更优选为(10～14)：(8～10)：(1～2)，最优选为(11～12)：(8～9)：(1～1.5)。在本发明中，所述冷冻保护剂中脱脂乳粉的浓度优选为10～15g/mL，更优选为11～13g/mL。
在本发明中，所述冷冻保护剂的质量优选为发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种质量和的1～3倍，更优选为2～3倍。
在本发明中，所述复方乳酸菌制剂的制备方法，优选包括以下步骤：
分别将发酵乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种接种到活化培养基中活化培养，分别得到发酵乳杆菌活化液、嗜热链球菌活化液和德氏乳杆菌保加利亚亚种活化液；
分别将所述发酵乳杆菌活化液、嗜热链球菌活化液和德氏乳杆菌保加利亚亚种活化液接种到扩培培养基中进行扩繁培养，分别得到发酵乳杆菌培养液、嗜热链球菌培养液和德氏乳杆菌保加利亚亚种培养液；
将所述发酵乳杆菌种培养液、嗜热链球菌种培养液和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种培养液混合，得到复方乳酸菌制剂。
在本发明中，所述活化时接种的优选为菌种悬浮液，所述菌种悬浮液的制备方法优选包括：将发酵乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种或德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种分别置于无菌生理盐水中，振荡，分别得到发酵乳杆菌菌种悬浮液、嗜热链球菌菌种悬浮液或德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种悬浮液。在本发明的实施例中，所述发酵乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种均购买于北纳生物。在本发明中，所述菌种悬浮液的活菌数优选独立≥108cfu/g，更优选≥109cfu/g，最优选≥1010cfu/g。在本发明中，所述振荡的容器优选为菌种管。
在本发明中，所述活化培养基优选为MRS培养基，所述MRS培养基优选包括MRS液体培养基或MRS固体培养基。在本发明的实施例中，所述MRS培养基购买于青岛海博生物技术有限公司。
在本发明中，所述MRS液体培养基在使用前优选进行高温灭菌后降温；所述高温灭菌的温度优选为120～125℃，更优选为121℃，所述高温灭菌的时间优选12～18min，更优选为15min；所述降温后的温度优选≤45℃，本发明对于所述降温的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的降温方式即可。在本发明的实施例中，所述灭菌优选在高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)中进行。
在本发明中，所述活化培养优选包括依次进行的第一活化培养，得到第一活化液，将所述第一活化液进行第二活化培养，得到活化液。在本发明中，所述菌种悬浮液和培养基的体积比优选为(0.1～0.2):5，更优选为0.15:5。在本发明中，所述第一活化液和培养基的体积比优选为(0.5～0.7)：20，更优选为0.6:20。在本发明中，所述第一活化培养和第二活化培养的温度独立地优选为40～44℃，更优选为42℃；所述第一活化培养和第二活化培养的时间独立地优选为22～26h，更优选为24h。在本发明中，所述第一活化培养和第二活化培养优选在电热恒温培养箱中的气浴摇床中进行；所述气浴摇床的转速优选为90～110rpm，更优选为100rpm；在本发明的实施例中，所述电热恒温培养箱购买于山东龙口市先科仪器公司。
得到发酵乳杆菌活化液、嗜热链球菌活化液和德氏乳杆菌保加利亚亚种活化液后，本发明分别将所述发酵乳杆菌活化液、嗜热链球菌活化液和德氏乳杆菌保加利亚亚种活化液接种到扩培培养基中进行扩繁培养，得到分别得到发酵乳杆菌培养液、嗜热链球菌培养液和德氏乳杆菌保加利亚亚种培养液。
在本发明中，所述发酵乳杆菌活化液、嗜热链球菌活化液和德氏乳杆菌保加利亚亚种活化液与扩培培养基的体积比独立地优选为(0.2～0.4):10，更优选为0.3:10。在本发明中，所述扩培培养基优选为MRS培养基，所述MRS培养基优选包括MRS液体培养基或MRS固体培养基。在本发明的实施例中，所述MRS培养基购买于青岛海博生物技术有限公司。在本发明中，所述MRS培养基在使用前优选进行高温灭菌后降温；所述高温灭菌的温度优选为120～125℃，更优选为121℃，所述高温灭菌的时间优选12～18min，更优选为15min；所述降温后的温度优选≤45℃，本发明对于所述降温的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的降温方式即可。在本发明的实施例中，所述灭菌优选在高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)中进行。
在本发明中，所述扩繁培养的温度优选为40～44℃，更优选为42℃；时间优选为7～9h，更优选为8h。在本发明中，所述扩繁培养优选在电热恒温培养箱中的气浴摇床中进行；所述气浴摇床的转速优选为90～110rpm，更优选为100rpm；在本发明的实施例中，所述电热恒温培养箱购买于山东龙口市先科仪器公司。
得到发酵乳杆菌培养液、嗜热链球菌培养液和德氏乳杆菌保加利亚亚种培养液后，本发明将所述发酵乳杆菌培养液、嗜热链球菌培养液和德氏乳杆菌保加利亚亚种培养液混合，得到复方乳酸菌制剂。
在本发明中，所述发酵乳杆菌培养液、嗜热链球菌培养液和德氏乳杆菌保加利亚亚种培养液的体积比优选为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)，更优选为(0.6～1.2)：(0.6～1.2)：(0.6～1.2)，最优选为(0.9～1)：(0.9～1)：(0.9～1)。
在本发明中，所述复方乳酸菌制剂的保存方式优选为冷冻保存。在本发明中，所述冷冻保存前，本发明优选还包括将所述复方乳酸菌制剂和冷冻保护剂混合。在本发明中，所述冷冻保存的温度优选为-20～-80℃，更优选为-20～-40℃；时间优选为30～70h，更优选为40～50h。在本发明的实施例中，所述冷冻保存的容器优选为冻存管，标明菌名、编号及冻存日期，置-20℃冰箱内保存。
在本发明中，所述复方乳酸菌制剂优选以复方乳酸菌冻存液或复方乳酸菌冻干粉形式存在。在本发明中，所述混合过程中优选还加入冷冻保护剂。在本发明中，所述冷冻保护剂在使用前优选进行高温灭菌后降温，所述高温灭菌的温度优选为120～125℃，更优选为121℃；时间优选12～18min，更优选为15min；所述降温后的温度优选≤45℃，本发明对于所述降温的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的降温方式即可。在本发明的实施例中，所述高温灭菌优选在高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)中进行。在本发明中，所述冷冻保护剂优选与上述技术方案中的冷冻保存剂相同，在此不再赘述。
当所述复方乳酸菌制剂优选以复方乳酸菌冻存液存在时，所述混合优选包括以下步骤：将发酵乳杆菌培养液、嗜热链球菌培养液、德氏乳杆菌保加利亚亚种培养液和冷冻保护剂混合，得到复方乳酸菌制剂。在本发明中，所述复方乳酸菌制剂与冷冻保护剂的体积比优选为1：(2～3)，更优选为1:3。
当所述复方乳酸菌制剂以复方乳酸菌冻干粉形式存在时，所述混合前优选还包括分别将发酵乳杆菌培养液、嗜热链球菌培养液和德氏乳杆菌保加利亚亚种培养液进行离心分离，分别得到发酵乳杆菌泥、嗜热链球菌泥和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥。在本发明中，所述离心分离的转速优选为5000～7000rpm，更优选为6000rpm；时间优选为8～12min，更优选为10min。在本发明中，所述混合优选包括以下步骤：将发酵乳杆菌泥、嗜热链球菌泥和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥分别与所述冷冻保护剂混合，分别得到发酵乳杆菌泥-冻干保护剂菌悬液、嗜热链球菌泥-冻干保护剂菌悬液和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥-冻干保护剂菌悬液；然后将所述发酵乳杆菌泥-冻干保护剂菌悬液、嗜热链球菌泥-冻干保护剂菌悬液和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥-冻干保护剂菌悬液混合。在本发明中，所述发酵乳杆菌泥、嗜热链球菌泥和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥的质量与冻干保护剂的体积之比独立地优选为(0.9～1.1)g：3mL，更优选为1g：3mL。
本发明提供了一种复方脱霉剂，包括上述技术方案所述复方乳酸菌制剂、葡甘露聚糖改性蒙脱石和乳酸。
在本发明中，所述复方乳酸菌制剂和葡甘露聚糖改性蒙脱石的质量比为(0.5～1.5):4，更优选为(0.8～1.2):4，最优选为1:4。
在本发明中，所述葡甘露聚糖改性蒙脱石的制备方法，包括以下步骤：
将钠基蒙脱石和葡甘露聚糖溶液混合，调节pH值至3～7，进行改性反应，得到葡甘露聚糖改性蒙脱石。
在本发明中，所述钠基蒙脱石优选为粉末状态，钠基蒙脱石粉末的粒度优选≥200目。在本发明中，所述钠基蒙脱石粉末优选以钠基蒙脱石水悬浮液的形式使用，所述钠基蒙脱石水悬浮液的浓度优选为0.03～0.05g/mL，更优选为0.04g/mL。
在本发明中，所述葡甘露聚糖溶液的浓度优选为0.5～2.5wt％，更优选为1～2wt％，最优选为1.5wt％。在本发明中，以葡甘露聚糖的量计，所述钠基蒙脱石和葡甘露聚糖溶液的质量比优选为1：(0.1～0.7)，更优选为1：(0.2～0.5)，最优选为1：(0.3～0.4)。
在本发明中，所述pH值为3～6，优选为3～5，最优选为3～4，本发明在酸性条件下进行改性，有利于增加钠基蒙脱石的膨胀容，进而提高葡甘露聚糖改性蒙脱石对霉菌素素的吸附率。本发明对于所述调节pH值用的pH调节剂没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的酸或碱即可。
在本发明中，所述改性反应的温度优选为30～70℃，更优选为40～60℃，最优选为40～50℃；时间优选为4～20h，更优选为10～18h，最优选为15～16h。在本发明中，所述改性反应过程中，葡甘露聚糖具有极性结构，属于非离子型改性剂，通过氢键作用吸附在硅氧四面体层表面，从而使层间距增大，吸附在层间的非离子表面活性剂，可通过氢键作用束缚一定的水分子，通过水分子与活性剂相互作用进一步进入到钠基蒙脱石的层间，使钠基蒙脱石的层间距增大，表面积增大，进而使葡甘露聚糖改性蒙脱石能够结合更多的霉菌毒素，提高其吸附能力。
所述改性反应后，本发明优选还包括将所述改性反应的体系静置后固液分离，将所得固体产物置于醇溶液中冷藏、水洗后干燥，得到葡甘露聚糖改性蒙脱石。在本发明中，所述静置的时间优选为0.8～1.2h，更优选为1h；所述静置的目的是使葡甘露聚糖改性蒙脱石沉淀到反应体系的底部，有利于分离。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如离心分离。在本发明中，所述醇溶液优选为乙醇水溶液，所述醇溶液中醇的体积百分浓度优选为75～85％，更优选为80～85％；所述冷藏的温度优选为2～6℃，更优选为2～4℃；所述冷藏的时间优选为8～15h，更优选为10～12h。在本发明中，所述水洗的次数优选为3～5次，更优选为4次；所述水洗的目的是除去醇以及未反应的葡甘露聚糖。在本发明中，所述干燥的温度优选为2～6℃，更优选为2～4℃；时间优选为4～20h，更优选为10～16h。
在本发明中，所述复方脱霉剂的制备方法，优选包括以下步骤：将上述技术方案所述复方乳酸菌制剂和葡甘露聚糖改性蒙脱石混合，得到复方脱霉剂。
在本发明中，所述葡甘露聚糖改性蒙脱石在使用前优选进行粉碎和过筛处理，本发明对于所述粉碎和过筛没有特殊限定，能够保证所得葡甘露聚糖改性蒙脱石的粒度为60～80目即可。
在本发明中，所述混合优选为搅拌混合；本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。
本发明还提供了上述技术方案所述复方乳酸菌制剂或上述技术方案所述复方脱霉剂作为饲料添加剂的应用。
在本发明中，所述复方乳酸菌制剂和复方脱霉剂在饲料中的添加量独立地优选为0.05～0.5wt％，更优选为0.05～0.2wt％，最优选为0.1～0.15wt％。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)用微量移液器吸取500μL无菌生理盐水，分别滴入装有购买于北纳生物发酵乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种的3个菌种管内，振荡溶解悬浮，分别得到发酵乳杆菌悬浮液、嗜热链球菌菌种悬浮液和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种悬浮液；
(2)在离心管中加入MRS液体培养基，在121℃条件下灭菌15min后降温至45℃以下，得到灭菌MRS液体培养基；
分别取150μL步骤(1)得到的所述发酵乳杆菌悬浮液、嗜热链球菌悬浮液和德氏乳杆菌保加利亚亚种悬浮液，分别接种于5mL所述灭菌MRS液体培养基中第一活化，置于气浴摇床中，在42℃、100r/min的条件下恒温第一活化培养24h，得到第一发酵乳杆菌活化液、第一嗜热链球菌活化液和第一德氏乳杆菌保加利亚亚种活化液；
(3)将600μL步骤(2)得到的所述第一发酵乳杆菌活化液、第一嗜热链球菌活化液和第一德氏乳杆菌保加利亚亚种活化液分别接种于20mL所述灭菌MRS液体培养基第二活化，然后置于气浴摇床中，在42℃、100r/min条件下恒温第二活化培养24h，得到发酵乳杆菌活化液、嗜热链球菌活化液和德氏乳杆菌保加利亚亚种活化液；
(4)分别将12mL步骤(3)得到的发酵乳杆菌活化液、嗜热链球菌活化液和德氏乳杆菌保加利亚亚种活化液接种于400mL灭菌MRS液体培养基中，置于气浴摇床中，在42℃、100rpm条件下恒温扩繁培养8h，得到活化发酵乳杆菌培养液、活化嗜热链球菌培养液和活化德氏乳杆菌保加利亚亚种培养液；
(5)将11.0g脱脂乳粉，8.0g海藻糖和1.0mL的甘油和99mL生理盐水混合均匀，在121℃条件下灭菌15min，得到冻干保护剂；
准备30个50mL离心管，在121℃条件下灭菌15min后称其质量，将称完质量的离心管放入超净台内，分别将40mL步骤(4)得到的活化发酵乳杆菌培养液、活化嗜热链球菌培养液和活化德氏乳杆菌保加利亚亚种培养液置于离心管中拧紧管盖，从超净台取出，放入离心机离心中在6000r/min条件下离心l0min，离心结束后拧开管盖，弃上清液，收集离心后的菌泥，得到发酵乳杆菌菌泥、嗜热链球菌菌泥和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥；每个菌种作10个平行试验；
(6)在超净台内，分别将步骤(5)得到的发酵乳杆菌菌泥、嗜热链球菌菌泥和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥和冻干保护剂按1:3(w/v)的比例加入至离心管中，拧紧管盖后置于振荡器振荡混匀，制成发酵乳杆菌菌泥-冻干保护剂菌悬液、嗜热链球菌菌泥-冻干保护剂菌悬液和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥-冻干保护剂菌悬液；
(7)将10mL步骤(6)得到的发酵乳杆菌菌泥-冻干保护剂菌悬液、10mL嗜热链球菌菌泥-冻干保护剂菌悬液和10mL德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥-冻干保护剂菌悬液混合，得到复方菌泥-冻干保护剂菌悬液；将所述复方菌泥-冻干保护剂菌悬液置于灭菌平皿中，盖上平皿盖，用无菌的牛皮纸密封，在-80℃超低温冰箱预冻4h，使样品中的水以固体冰的形式存在，迅速取出样品放入冷冻干燥机中，在-50℃、真空度为0.04Pa条件下真空冷冻干燥48h，得到复方乳酸菌制剂。
在步骤(7)得到的复方乳酸菌制剂加入30mL无菌生理盐水，使其与冻干前复方菌泥-冻干保护剂菌悬液的体积相等，采用平板计数法测量活菌数，冻干存活率＝(冻干后每毫升复方菌泥-冻干保护剂菌悬液活菌总数/冻干前每毫升复方菌泥-冻干保护剂菌悬液活菌总数)×100％，计算结果为1.822×1010cfu/g，冻干存活率91％。
发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的生长曲线绘制
分别将3mL步骤(3)制备的发酵乳杆菌活化液、嗜热链球菌活化液和德氏乳杆菌保加利亚亚种活化液置于装有100mL灭菌MRS液体培养基的锥形瓶中，置于气浴摇床中，在42℃、100rpm条件下恒温培养24h，每隔4h分别从各个菌种的培养基中取100μL培养液采用平板计数法进行活菌数检测，以时间为横坐标、菌落数的常用对数值作为纵坐标，绘制发酵乳杆菌冻干粉、嗜热链球菌冻干粉和德氏乳杆菌保加利亚亚种三种乳酸菌的生长曲线，确定最佳收获时间，测试结果如图1所示。
由图1可知，发酵乳杆菌、嗜热链球菌菌的生长曲线变化趋势相似，而德氏乳杆菌保加利亚亚种相比发酵乳杆菌和嗜热链球菌稳定期较短，0～4h为三种乳酸菌的迟缓期，此时乳酸菌处于对新环境进行短暂适应阶段，分裂迟缓，繁殖极少；4～8h为三种乳酸菌的对数生长期，此时乳酸菌以几何级数增加，大量繁殖；8～20h为发酵乳杆菌和嗜热链球菌的平衡期，8～12h为德氏乳杆菌保加利亚亚种的平衡期，此时乳酸菌的生长和死亡速率处于动态平衡；12h后为德氏乳杆菌保加利亚种的衰亡期，20h后为发酵乳杆菌和嗜热链球菌的衰亡期，此时乳酸菌生长必备的营养物质和生长空间急剧减少，乳酸菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中总活菌数急剧下降。对数生长前期的菌体在真空冷冻干燥过程中稍显脆弱，而对数生长期末期、平衡期前期的菌体对冷冻干燥的耐受较强，因此，三种菌株冻干前最佳收获时间为8h。
测试例1
实施例1制备的复方乳酸菌制剂的活菌数测定
(1)将实施例1步骤(3)制备的发酵乳杆菌活化液、嗜热链球菌活化液和德氏乳杆菌保加利亚亚种活化液充分摇匀，分别吸取500μL放入盛有4.5mL的生理盐水的10mL离心管中，振荡器振摇混匀，制成第一样品匀液；
(2)称取1.0g实施例1步骤(7)制备的复方乳酸菌制剂放入盛有5.0mL生理盐水的10mL离心管中，振荡器振摇混匀，制成第二样品匀液；
(3)用1mL微量移液器分别吸取500μL步骤(1)得到的第一样品匀液和步骤(2)得到的第二样品匀液，沿管壁缓慢注于盛有4.5mL生理盐水的无菌试管中反复吹打使其混合均匀，制成两个体积比为1:100的第三样品匀液；另取1mL微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，更换一次吸头；分别吸取100μL空白稀释液加入至三个无菌平皿内作空白对照；
将15mL灭菌MRS固体培养基倾注于无菌平皿中，转动无菌平皿使其混合均匀，冷却凝固后，根据待检样品活菌总数的估计，选择3个适宜稀释度(总有效活菌数分别为1×108cfu/g、1×109cfu/g和1×1010cfu/g)，用100μL微量移液器从每个稀释度分别吸取100μL样品匀液于平皿内，每个稀释度做三个平行试验，置于培养箱内，在42℃条件下培养24h。
(4)选取菌落数在30～300cfu/mL之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，每个稀释度的菌落数为3个平板的平均数。
若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，则计算三个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每个样品中菌落总数结果；若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式(1)计算，发酵乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的活化菌液培养8h后有效活菌数均可达到1×1010cfu/mL，实施例1制备的复方乳酸菌制剂检测活菌数1.83×1010cfu/mL，保护率91％。
式(1)中，N—样品中菌落数，单位为cfu/mL；
∑C—平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和，单位为cfu/mL；
n1—第一稀释度(低稀释倍数)平板个数，单位为个；
n2—第二稀释度(高稀释倍数)平板个数，单位为个；
d—稀释因子(第一稀释度)。
测试例2
(1)复方乳酸菌制剂对胃液的耐受试验
采用人工模拟胃酸性环境检测制得的微生态制剂对低pH值耐受性。将1.64mL体积百分浓度为27.7％的稀盐酸(纯HCl体积为0.455mL)、80mL水和1g酶活力为10000U/mg的胃蛋白酶摇匀后，加水稀释至100mL，分别配置成pH值为2.0、3.0和4.0的人工模拟胃液，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，保存备用。
用10mL无菌生理盐水将1g实施例1制备的复方乳酸菌制剂(活菌数为1010cfu/g)稀释混匀，得到菌悬液；分别将1mL菌悬液加至9mLpH值为2.0、3.0和4.0的人工模拟胃液中，在41℃、100rpm条件下摇床培养，以pH＝7的模拟胃液为空白对照，每组pH值做4个平行试验，在0h和4h分别取样，采用平板计数法测量活菌数，以存活率为测量指标，检测复方乳酸菌制剂对胃液低酸性环境的耐受性，测试结果如表1所示：
表1复方乳酸菌制剂对胃液的耐受试验结果
| 人工模拟胃液pH值 | 有效活菌数(10<sup>9</sup>cfu/mL) | 存活率(％) |
| pH＝2 | 0.35±0.01<sup>d</sup> | 1.93 |
| pH＝3 | 6.10±0.42<sup>c</sup> | 33.33 |
| pH＝4 | 9.50±0.40<sup>b</sup> | 51.89 |
| pH＝7 | 13.17±0.50<sup>a</sup> | 71.97 |
其中，本发明的表格中，同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。
(2)复方乳酸菌制剂对肠液的耐受试验
将0.68g KH2PO4加入至50mL蒸馏水中溶解，用0.4％(w/v)的NaOH溶液调节pH至6.8，按1wt％的比例加入酶活力为11800U/mg的胰蛋白酶固体，加水稀释至100mL，加入牛胆酸盐充分溶解后，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，得到模拟肠液；所述模拟肠液中牛胆酸盐的质量百分浓度为0.1％、0.2％和0.3％；用10mL无菌生理盐水将1g实施例1制备的复方乳酸菌制剂(活菌数≥1010cfu/g)稀释混匀，得到菌悬液；分别将1mL菌悬液加至9mL牛胆酸盐质量百分浓度为0.1％、0.2％和0.3％的模拟肠液中，在41℃、100rpm条件下摇床培养，以不加胆酸盐的模拟肠液为空白对照，每组浓度作4个平行试验，分别在0h和4h取样，采用平板计数法测量活菌数，以存活率为测量指标，检测复方乳酸菌制剂对肠液耐受性，测试结果如表2所示：
表2复方乳酸菌制剂对肠液耐受性试验结果
| 牛胆酸盐浓度 | 有效活菌数(10<sup>9</sup>cfu/mL) | 存活率(％) |
| 0％ | 13.20±0.21<sup>a</sup> | 72.14 |
| 0.1％ | 7.32±0.32<sup>b</sup> | 40.00 |
| 0.2％ | 3.27±0.07<sup>c</sup> | 17.86 |
| 0.3％ | 2.91±0.02<sup>c</sup> | 15.89 |
由表2可知，在牛胆酸盐浓度为0.1％、0.2％和0.3％模拟肠液中复方乳酸菌制剂的活菌数显著低于对照组，牛胆酸盐浓度为0.2％和0.3％模拟肠液中复方乳酸菌制剂活菌数显著低于牛胆酸盐浓度为0.1％的模拟肠液中乳酸菌活菌数(P<0.05)。对照组乳酸菌的存活率为65.00％；在牛胆酸盐浓度为0.1％、0.2％和0.3％时乳酸菌的存活率分别为40.00％、17.86％和2.71％。说明，本发明制备的复方乳酸菌制剂对低浓度(0.1％)牛胆酸盐的肠液的耐受性好。
(3)复方乳酸菌制剂对温度耐受试验
将实施例1制备的复方乳酸菌制剂采用常规包装和真空包装两种方式进行包装，分别置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃干燥箱中热处理10min后检测活菌数，每份包装1g复方乳酸菌制剂，4份为一组，每组温度作4个平行试验，以4℃保存的复方乳酸菌制剂作为对照组。采用平板计数法测量活菌数，以存活率为测量指标，检测复方乳酸菌制剂对温度的耐受性，测试结果如表3所示；对常规包装和真空包装复方乳酸菌制剂在相同温度处理条件下乳酸菌存活率进行t检验，结果如表3所示：
表3常规包装和真空包装复方乳酸菌制剂温度耐受性对比试验结果
由表3可知，常规包装方式：20℃、30℃、40℃的控温摇床振荡10min后乳酸菌活菌数与真空包装组差异不显著(P>0.05)，显著高于其他组(P<0.05)；50℃气浴10min后乳酸菌活菌数高于60℃气浴，60℃气浴10min后乳酸菌活菌数高于70℃气浴，70℃气浴10min后乳酸菌活菌数高于80℃和90℃气浴(P<0.05)；随着气浴温度的升高，乳酸菌存活率呈现大幅度下降趋势。真空包装方式：20℃、30℃、40℃气浴10min后乳酸菌活菌数与常规包装方式差异不显著(P>0.05)，显著高于50℃～90℃组(P<0.05)；50℃和60℃气浴10min后乳酸菌活菌数高于70℃气浴，70℃气浴10min后乳酸菌活菌数高于80℃和90℃气浴(P<0.05)，随着气浴温度的升高，乳酸菌存活率呈现大幅度下降趋势。说明，本发明制备的复方乳酸菌制剂在40℃以下复方乳酸菌的存活率在94.3～100％，50℃～60℃存活率在57.57％～72.10％。
在60℃、70℃的控温摇床振荡10min后，真空包装中乳酸菌存活率显著高于常规包装中乳酸菌存活率(P<0.05)，其它温度处理条件下真空包装中乳酸菌存活率也高于常规包装中乳酸菌存活率，但差异不显著(P>0.05)。说明，本发明制备的复方乳酸菌制剂在40℃以下有较高的存活率，真空包装的存活率显著高于常规包装。
(4)复方乳酸菌制剂储存期试验
将实施例1制备的复方乳酸菌制剂(活菌数为1010cfu/g)采用常规包装和真空包装两种方式进行包装，置于室温下保存6个月，每隔15天采用平板计数法测量每组样品的活菌数，以存活率为测量指标，检测复方乳酸菌制剂对温度的耐受性，每份包装1g复方乳酸菌制剂，4份为一组，每组温度作4个平行试验，测试结果如表4所示：
表4复方乳酸菌制剂储存期试验结果
由表4可知，常规包装方式：15d时乳酸菌存活率与真空包装方式差异不显著(P>0.05)，显著高于其他组(P<0.05)；30d时乳酸菌存活率高于45d、45d时乳酸菌存活率高于60d、60d时乳酸菌存活率高于75d和90d、75d和90d时乳酸菌存活率高于105d、105d时乳酸菌存活率高于120d、120d时乳酸菌存活率高于135d、150d、165d和180d(P<0.05)；15d后随着储存时间变长，乳酸菌的存活率呈现大幅度下降趋势。真空包装方式：15d和30d时乳酸菌存活率与对照组差异不显著(P>0.05)，显著高于其他组(P<0.05)。45d时乳酸菌存活率高于60d、60d时乳酸菌存活率高于75d和90d、75d和90d时乳酸菌存活率高于105d和120d、105d和120d时乳酸菌存活率高于135d、135d时乳酸菌存活率高于150d、150d时乳酸菌存活率高于165d和180d(P<0.05)。30d后随着储存时间变长，乳酸菌的存活率呈现大幅度下降趋势。说明，本发明制备的复方乳酸菌制剂真空包装在0～45d具有较高的存活率。
对常规包装和真空包装保存的复方乳酸菌制剂在室温下、相同储存时间下乳酸菌存活率进行t检验，结果如表5所示：
表5常规包装和真空包装复方乳酸菌制剂储存期对比试验结果
由表5可知，0～15d时常规包装中乳酸菌存活率与真空包装中乳酸菌存活率差异不显著(P>0.05)，30d后真空包装中乳酸菌存活率显著高于常规包装中乳酸菌存活率(P<0.05)。表明真空包装中乳酸菌存活率优于常规包装。
综上所述，本发明提供的复方乳酸菌制剂在高pH模拟胃液中和低胆酸盐的模拟肠液中存活率高；在温度不超过40℃时，常规包装和真空包装的复方乳酸菌制剂中乳酸菌存活率高，且在一定温度范围内，真空包装复方乳酸菌制剂对温度的耐受性相比常规包装有明显的提高。室温条件下真空包装保存的复方乳酸菌制剂的储存期要长于常规包装保存，最佳储存时间分别为45d和30d。
测试例3
实施例1制备的复方乳酸菌制剂体外降解黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和呕吐毒素(DON)试验
AFB1、ZEN和DON标准品液制备：将AFB1、ZEN和DON固体标准品分别溶解于84％乙腈水溶液中，制成10μg/mL的标准品液，置于冰箱4℃中保存备用。
第I组为基础日粮组，不含复方乳酸菌制剂和霉菌毒素，在10mL离心管中加入5mL生理盐水；第II组为空白菌液对照组，不含霉菌毒素，向10mL离心管中加入0.05g复方乳酸菌制剂(活菌数≥1010cfu/g)，加入5mL生理盐水摇匀；第III组为空白毒素对照组，不添加复方乳酸菌制剂，各取0.25mL的AFB1、ZEN和DON标准品液加入10mL离心管中，加入4.75mL生理盐水使4种毒素的终浓度为0.5μg/mL；第IV组为复方乳酸菌制剂组，复方乳酸菌制组含有AFB1、ZEN和DON，4种霉菌毒素的浓度与空白毒素对照组相同，向10mL离心管中加入0.05g的复方乳酸菌制剂进行降解试验，每组各做5个平行试验，按照参照DB37/T 3856-2019采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)测试AFB1、ZEN和DON的浓度，AFB1、ZEN和DON的浓度和降解率结果如表6所示：
表6复方乳酸菌制剂对AFB、DON和ZEN的降解效果
| 霉菌毒素 | 第I组(μg/mL) | 第II组(μg/mL) | 第III组(μg/mL) | 第IV组(μg/mL) | 降解率(％) |
| AFB<sub>1</sub> | 0 | 0 | 0.51±0.01 | 0.12±0.01 | 76.55±1.53 |
| ZEN | 0 | 0 | 0.50±0.02 | 0.29±0.01 | 42.07±3.61 |
| DON | 0 | 0 | 0.52±0.02 | 0.25±0.02 | 51.73±3.23 |
由表6可知，复方乳酸菌制剂对AFB1的降解率为76.55％，对ZEN的降解率为42.07％，对DON的降解率为51.73％。说明，本发明制备的复方乳酸菌制剂对AFB、DON和ZEN的降解效果显著。
采用HPLC-MS对AFB1的降解产物进行分析，AFM1标准品的总离子流谱图如图2所示，其出峰时间在3.905min。AFL标准品总离子流谱图如图3所示，其出峰时间在0.172min。复方乳酸菌制剂降解AFB1总离子流谱图如图4所示，AFB1降解产物出峰时间分别与标准品AFM1和AFL的出峰时间进行对比，在0.172min出现AFL，其含量是0.033μg/mL，转化率为6.40％；在3.936min有AFM1生成，其含量是0.00098μg/mL，转化率为0.19％。
采用HPLC-MS对ZEN的降解产物进行分析，α-ZAL标准品的总离子流谱图如图5所示，其出峰时间在2.642min；β-ZAL标准品的总离子流谱图如图6所示，其出峰时间在2.931min；α-ZEL标准品的总离子流谱图如图7所示，其出峰时间在2.695min；β-ZEL标准品的总离子流谱图如图8所示，其出峰时间在2.996min。经复方乳酸菌制剂降解后ZEN降解产物的总离子流谱图如图9所示，出峰时间与标准品α-ZAL、β-ZAL、α-ZEL、β-ZEL的出峰时间进行对比，发现在2.931min出现β-ZAL，其含量是0.0078μg/mL，转化率1.56％，α-ZAL、α-ZEL和β-ZEL均未产生，说明ZEN经复方乳酸菌制剂降解后产物为β-ZAL。
采用HPLC-MS对DON的降解产物进行分析，3-AC-DON标准品的总离子流谱图如图10所示，其出峰时间在1.784min；15-AC-DON标准品的总离子流谱图如图11所示，其出峰时间是在1.772min；DOM-1标准品的总离子流谱图如图12所示，其出峰时间是在1.506min。DON经复方乳酸菌制剂降解后DON降解产物的总离子流谱图如图13所示，出峰时间与3-AC-DON、15-AC-DON和DOM-1标准品的出峰时间进行对比，3-AC-DON、15-AC-DON和DOM-1均未产生，表明经复方乳酸菌制剂降解DON，无任何降解产物产生。
测试例4
(1)试验准备
(1.1)试验动物及处理
选取108只1日龄AA白羽肉鸡，随机分为6组，每组36只(6只×6次平行试验)。第I组为基础日粮组，饲喂基础日粮；第II组饲喂霉变基础日粮；第III组饲喂添加0.2wt％复方乳酸菌制剂的霉变基础日粮；第IV组饲喂添加0.1wt％复方乳酸菌制剂的霉变基础日粮；第V组饲喂添加0.05wt％实施例1制备的复方乳酸菌制剂的霉变基础日粮；第VI组饲喂市场购买的微生态脱霉剂脱霉V+。鸡舍采用网上平养，24h光照模式，每组采用自由采食、饮水，并记录每日喂料量、撒料量、各组死亡数等，免疫程序为常规免疫程序。其中，基础日粮的组成和营养成分如表7所示：
表7基础日粮组成及营养成分
| 原料 | 配比(wt％) | 营养成分 | 含量(wt％) |
| 玉米 | 65.3 | 粗蛋白 | 21.0 |
| 豆粕 | 28.0 | 粗纤维 | 7.0 |
| 鱼粉 | 3.0 | 粗灰分 | 9.0 |
| 石粉 | 1.1 | 钙 | 0.7 |
| 磷酸氢钙 | 1.2 | 磷 | 0.35 |
| 蛋氨酸 | 0.1 | 钠 | 0.3 |
| 食盐 | 0.3 | 赖氨酸 | 1.1 |
| 预混料 | 1.0 | 蛋氨酸+胱氨酸 | 0.9 |
| 总计 | 100 | 水分 | 13.8 |
其中，每千克预混料中的营养成分：维生素A 8000IU、维生素D34000 IU、维生素E50IU、维生素K 0.5mg、维生素B23.6mg、维生素B11.8mg、维生素B63mg、维生素B120.01mg、叶酸0.55mg、泛酸10mg、烟酸30mg、生物素0.15mg、胆碱1300mg、铁60mg、锰90mg、铜6mg/kg、碘0.35mg、硒0.30mg和锌90mg。
(1.2)霉变日粮的制备
将基础日粮置于阴暗潮湿的环境中使其自然霉变，向霉变基础日粮中添加0.15％的丙酸钙防止饲料继续霉变，并添加甜味剂促进采食，得到霉变日粮。
(1.3)霉变日粮中霉菌毒素的含量检测
分别称取粉碎过筛的5g霉变日粮和基础日粮，加入25mL 84％乙腈后置于摇床中，在37℃、120r/min条件下处理2h使霉菌毒素充分溶解，过滤离心，用无菌注射器吸取上清液3～4mL将其缓慢过0.22μm有机相膜并转至洁净的空试管中，用固相萃取柱过滤，取上层液体1mL于液相小瓶中，高效液相色谱测试霉菌毒素的含量，结果如表8所示：
表8霉变基础日粮中霉菌毒素含量
其中，①为GB13078-2017。
(2)生长性能
称取肉鸡第8天和第35天的重量，计算平均日增重和料重比，测试结果如表9所示：
表9复方乳酸菌制剂对肉鸡生长性能的影响
由表9可知，与饲喂基础日粮的基础日粮组相比，饲喂霉变基础日粮组的料肉比显著大于基础日粮组(P<0.05)，平均日增重显著小于基础日粮组(P<0.05)；添加0.2wt％复方乳酸菌制剂组的料肉比与基础日粮组差异不显著(P＞0.05)，显著低于微生态脱霉剂脱霉V+组(P<0.05)，平均日增重显著小于第I组基础日粮组，显著大于霉变基础日粮组(P<0.05)，与微生态脱霉剂脱霉V+组差异不显著(P＞0.05)。表明，霉变基础日粮中添加复方乳酸菌制剂可提高料肉比和平均日增重，添加0.2wt％复方乳酸菌制剂的效果最好。
(3)抗氧化及免疫指标测定
在试验第35天时肉鸡禁食，从每组的每一个平行试验中随机抽取3只鸡(混合样)，心脏采血，并置于37℃恒温箱中静置1h后在3000r/min下离心10min，分离血清，同时取肝脏、脾脏组织液氮保存。抗氧化指标检测血清和肝脏中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量；免疫指标检测血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白A(IgA)含量，血清和脾脏中干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)和第白介素-6(IL-6)含量；抗体水平IBD-Ab、ND-Ab和H9N1-A含量测试结果如表10～13所示。
抗氧化指标MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px的测试结果如表10所示：
表10复方乳酸菌制剂对肉鸡抗氧化指标的影响
由表10可知，添加复方乳酸菌制剂组的抗氧化指标MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px均低于基础日粮组，高于霉变基础日粮组(P<0.05)。表明，霉变基础日粮中添加复方乳酸菌制剂可提高肉鸡的抗氧化能力。
免疫指标IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IgG、IgM和IgA的测试结果如表11所示：
表11复方乳酸菌制剂对肉鸡免疫指标影响
由表11可知，复方乳酸菌制剂对肉鸡免疫指标影响，除了IgG显著低于基础日粮组(P<0.05)外，IFN-γ、IL-6、IL-4、IL-2、IgM和IgA各项指标均和基础日粮组差异不显著(P＞0.05)，且高于霉变基础日粮组(P<0.05)。表明，霉变基础日粮中添加复方乳酸菌制剂可提高肉鸡的免疫功能。
抗体水平IBD-Ab、ND-Ab和H9N1-Ab的测试结果如表12所示：
表12肉鸡抗体水平检测结果
由表12可知，复方乳酸菌制剂除了对H9N1-Ab水平显著低于基础日粮组(P<0.05)，IBD-Ab和ND-Ab与基础日粮组差异不显著(P＞0.05)，且高于霉变基础日粮组(P<0.05)。表明，霉变基础日粮中添加复方乳酸菌制剂可以缓解霉菌毒素对肉鸡免疫系统的损害。
脏器指标的测试结果如表13所示：
表13复方乳酸菌制剂对肉鸡脏器指标的影响
由表13可知，复方乳酸菌制剂对肉鸡的心脏、肝脏、肺脏和脾脏指标与基础日粮组差异不显著(P＞0.05)。表明，霉变基础日粮中添加复方乳酸菌制剂对可缓解对脏器功能的损伤。
综上所述，在霉变基础日粮中添加复方乳酸菌制剂，可以显著提升肉鸡的平均日增重，降低料肉比；可以显著提升肉鸡血清T-AOC水平，提高SOD、GSH-Px活性，显著降低血清MDA含量；可显著提升肉鸡血清中IL-2、IL-4、IL-6、INF-γ、IgG、IgM和IgA水平，同时可使试验肉鸡血清中的ND-Ab和IBD-Ab含量显著增加，复方乳酸菌制剂的添加量以0.2wt％最佳。
实施例2
将钠化蒙脱石粉碎后过200目筛，得到钠化蒙脱石粉末(层间距(d001)为1.25nm)；将1kg钠基化蒙脱石粉末和25L蒸馏水混合，得到蒙脱石悬浮液；将所述蒙脱石悬浮液和2.5L浓度为1.5wt％的葡甘露聚糖溶液混合，调节pH值至3，在40℃、搅拌条件下改性反应16h，静置1天后离心弃去上清液，将所得固体产物置于85v/v％乙醇水溶液中冷藏过夜，洗涤，在60℃烘干24h后研磨至60～80目，得到葡甘露聚糖改性蒙脱石(简写为KGM-MMT)，层间距(d001)为1.29nm。
本实施例制备的葡甘露聚糖改性蒙脱石的FT-IR谱图如图14所示。由图14可知，3622cm-1附近的的伸缩振动吸收区是蒙脱石2:1型单元层内Al-O-H键，在3425cm-1附近的是蒙脱石层间的吸附水的伸缩振动吸收区，吸收谱带比较宽，与1650cm-1附近结晶水水分子的H-O-H键的弯曲振动相对应；在1033cm-1附近，有Si-O-Si键的不对称伸缩振动，是蒙脱石的一个主要吸收峰带；在2926cm-1、2850cm-1处为-CH2吸收峰；1454cm-1附近吸收峰是钠基蒙脱石与钙基蒙脱石主要区别峰；其他的吸收峰均被掩盖在蒙脱石的吸收带内，表明葡甘露聚糖负载在蒙脱石上。
测试例5
(1)选取210只1日龄蛋鸡，公母各半，随机分为等量的6组，每组35只(7只×5次平行试验)，每组设置平行试验5次。第I组为基础日粮组，饲喂基础日粮；第II组饲喂霉变基础日粮；第III组饲喂添加0.05wt％KGM-MMT的霉变基础日粮；第IV组饲喂添加0.15wt％KGM-MMT的霉变基础日粮；第V组饲喂添加0.20wt％KGM-MMT的霉变基础日粮；第VI组饲喂未改性纳基蒙脱石的霉变基础日粮。鸡舍采用笼养，24h光照模式，每组采用自由采食和饮水，预试7日，第8日正式开始试验，免疫程序为常规免疫程序，试验期为28天。
按照测试例4的方法制备霉变日粮，基础日粮和霉变日粮中霉菌毒素的含量检测结果如表14所示：
表14试验饲料中霉菌毒素含量
其中，①标准为GB13078-2017。
(2)生长性能
称取蛋鸡第8天和第35天的重量，计算平均日增重和料重比，测试结果如表15所示：
表15生长性能检测结果
其中，本发明的表格中，同列数据肩标大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。
由表15可知，添加KGM-MMT的第III～V组的蛋鸡平均日增重低于第I组基础日粮组和第VI组未改性纳基蒙脱石组(P<0.01)，高于第II组霉变基础日粮组(P<0.01)，与第VI组未改性纳基蒙脱石组差异不显著(P>0.01)。料肉比低于第II组霉变基础日粮组，与第I组基础日粮组和第VI组未改性纳基蒙脱石组差异不显著(P>0.01)。
(3)脏器指数测试
在试验第35天时蛋鸡禁食，从每组的每一个平行试验中随机抽取3只鸡(混合样)称重，快速扑杀，立即解剖分离胸腺、法氏囊和脾脏，剔除脂肪后用生理盐水漂洗并用滤纸擦干，分别称重，并计算脏器指数，测试结果如表16所示：
表16脏器指数测试结果
由表16可知，各组胸腺指数间差异不显著(P>0.05)。霉变基础日粮中添加KGM-MMT各组法氏囊指数低于霉变基础日粮组差异不显著，且与未改性纳基蒙脱石组差异不显著(P>0.05)。霉变基础日粮中添加KGM-MMT各组脾脏指数低于霉变基础日粮组(P<0.05)，且与基础日粮组及未改性纳基蒙脱石组差异不显著(P>0.05)。表明，霉变基础日粮中添加KGM-MMT可以降低免疫器官脏器指数，提高动物免疫能力。
(4)抗氧化及免疫指标测定
按照测试例4的方法测定抗氧化指标检测血清和肝脏中SOD、MDA、T-AOC、GSH-Px、AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)和AKP(碱性磷酸酶)含量；免疫指标检测血清中IgG、IgM和IgA含量以及血清和脾脏中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6含量，测试结果如表17～23所示。
表17血清中SOD、MDA、T-AOC和GSH-Px含量检测结果
由表17可知，血清中SOD：添加0.15wt％和0.2wt％KGM-MMT的霉变基础日粮组高于霉变基础日粮组(P<0.01)，与基础日粮组差异不显著(P>0.05)，未改性纳基蒙脱石组低于基础日粮组(P<0.01)。血清中MDA：添加KGM-MMT的霉变基础日粮组高于霉变基础日粮组，但差异不显著，与添加未改性纳基蒙脱石组也差异不显著(P>0.05)。血清中GSH-Px：添加KGM-MMT的霉变基础日粮组高于霉变基础日粮组(P<0.01)，低于基础日粮组(P<0.01)，与未改性纳基蒙脱石组也差异不显著(P>0.05)。血清中T-AOC：添加0.15wt％和0.2wt％KGM-MMT的霉变基础日粮组高于霉变基础日粮组(P<0.01)，与基础日粮组和未改性纳基蒙脱石组差异不显著(P>0.01)。表明，霉变基础日粮中添加0.15wt％和0.2wt％KGM-MMT可提高血清中血清中SOD、GSH-Px、T-AOC、GSH-Px含量以及降低MDA含量。
表18肝脏中SOD、MDA、T-AOC和GSH-Px含量检测结果
由表18可知，肝脏中SOD：添加KGM-MMT的霉变基础日粮组高于霉变基础日粮组(P<0.05)，低于基础日粮组(P<0.01)，与添加未改性纳基蒙脱石组差异不显著(P>0.05)。肝脏中MDA：添加0.15wt％和0.2wt％KGM-MMT的霉变基础日粮组低于霉变基础日粮组(P>0.05)，与基础日粮组差异不显著(P>0.05)，低于未改性纳基蒙脱石组(P<0.05)。肝脏中GSH-Px：添加0.15wt％和0.2wt％KGM-MMT的霉变基础日粮组高于霉变基础日粮组(P<0.01)，与基础日粮组和未改性纳基蒙脱石组差异不显著(P>0.01)。肝脏中T-AOC：添加0.15wt％和0.2wt％KGM-MMT的霉变基础日粮组高于霉变基础日粮组(P>0.05)，与基础日粮组和未改性纳基蒙脱石组差异不显著(P>0.05)。表明，霉变基础日粮中添加0.15wt％和0.2wt％KGM-MMT可提高肝脏SOD、GSH-Px、T-AOC、GSH-Px含量，降低MDA含量。
表19血清中AST、ALT和AKP含量检测结果
由表19可知，血清中AST：添加0.15wt％和0.2wt％KGM-MMT的霉变基础日粮组低于霉变基础日粮组(P<0.05)，与基础日粮组和未改性纳基蒙脱石组差异不显著(P>0.05)。血清中ALT：添加0.2wt％KGM-MMT霉变基础日粮组低于霉变基础日粮组(P<0.05)，与基础日粮组和未改性纳基蒙脱石组差异不显著(P>0.05)，未改性纳基蒙脱石组极显著低于基础日粮组(P<0.01)。血清中AKP：添加0.15wt％KGM-MMT霉变基础日粮组极显著低于霉变基础日粮组(P<0.01)，与基础日粮组差异不显著(P>0.01)。表明，霉变基础日粮中添加添加0.15wt％和0.2wt％KGM-MMT可降低血清中AST含量，添加0.2wt％KGM-MMT能够降低血清中ALT含量，添加0.15wt％KGM-MMT能够提高血清中AKP含量。
表20肝脏中AST、ALT和AKP含量检测结果
由表20可知，肝脏中AST：添加KGM-MMT组低于霉变基础日粮组，差异不显著(P>0.05)，0.15wt％KGM-MMT组与基础日粮组差异不显著(P>0.05)，其他组均高于基础日粮组(P<0.01)。肝脏中ALT：添加0.15wt％和0.2wt％KGM-MMT组低于霉变基础日粮组(P<0.01)，0.2wt％KGM-MMT组与基础日粮组差异不显著(P>0.05)，未改性纳基蒙脱石组与霉变基础日粮组差异不显著(P>0.05)。肝脏中AKP：添加0.15wt％和0.2wt％KGM-MMT组低于霉变基础日粮组(P<0.01)，与基础日粮组和未改性纳基蒙脱石组相比差异不显著(P>0.05)。表明，霉变基础日粮中添加添加0.15wt％KGM-MMT可降低肝脏中AST含量，添加0.2wt％KGM-MMT降低肝脏中ALT含量，添加0.15wt％和0.2wt％KGM-MMT提高肝脏中AKP含量。
表21血清中IgA、IgG和IgM含量检测结果
由表21可知，血清中IgA：霉变基础日粮中添加KGM-MMT的IgA含量高于霉变基础日粮(P<0.05)，与基础日粮组差异不显著(P>0.05)；未改性纳基蒙脱石组显著低于基础日粮组(P<0.05)。IgG、IgM：霉变基础日粮中添加KGM-MMT的各组的IgG、IgM含量高于霉变基础日粮组(P<0.05)，与基础日粮组差和未改性纳基蒙脱石组差异不显著，基础日粮组的IgG、IgM含量高于喂霉变基础日粮组(P<0.05)和其他组(P>0.05)。表明，霉变基础日粮中添加KGM-MMT可以提高血清中IgA、IgG和IgM含量。
表22血清中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量检测结果
由表22可知，霉变基础日粮中添加KGM-MMT各组IL-2和IFN-γ含量，高于霉变基础日粮组(P>0.05)与对照组差异不显著(P>0.05)。霉变基础日粮中添加0.15wt％和0.2wt％KGM-MMT后IL-4、IL-6含量显著高于霉变基础日粮组(P<0.05)，与基础日粮组及未改性纳基蒙脱石组间差异不显著(P>0.05)。表明，霉变基础日粮中添加0.15wt％和0.2wt％KGM-MMT可以显著提高血清中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量。
表23脾脏中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量检测结果
由表23可知，霉变基础日粮中添加KGM-MMT各组脾脏中IL-2、IL-4含量高于霉变基础日粮组(P<0.05)，与基础日粮组和未改性纳基蒙脱石组差异不显著(P>0.05)。霉变基础日粮中添加KGM-MMT各组脾脏中IL-6含量高于霉变基础日粮组(P>0.05)，低于基础日粮组(P<0.05)和未改性纳基蒙脱石组差异不显著(P>0.05)。霉变基础日粮中添加KGM-MMT各组脾脏中IFN-γ含量高于霉变基础日粮组(P<0.05)，与对照组和未改性纳基蒙脱石组差异不显著(P>0.05)。表明，霉变基础日粮中添加KGM-MMT可提高脾脏中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量。
实施例3
将实施例2制备的葡甘露聚糖改性蒙脱石粉碎后过筛，得到的粒度为60～80目的葡甘露聚糖改性蒙脱石与实施例1制备的复方乳酸菌制剂和按照质量比为4:1的比例混合均匀，得到复方脱霉剂。
测试例6
(1)选取108只8日龄伊莎褐蛋种鸡，随机分为等量的6组，每组36只(6只×3次平行试验)。第I组为基础日粮组，饲喂基础日粮；第II组饲喂霉变基础日粮；第III组饲喂添加0.2wt％霉克净的霉变基础日粮；第IV组饲喂添加0.05wt％实施例3制备的复方脱霉剂的霉变基础日粮；第V组饲喂添加0.10wt％实施例3制备的复方脱霉剂的霉变基础日粮；第VI组饲喂添加0.20wt％实施例3制备的复方脱霉剂的霉变基础日粮。鸡舍采用笼养，24h光照模式，每组采用自由采食和饮水，试验期28天。
按照测试例4的方法制备霉变日粮，基础日粮和霉变日粮中AFB1、ZEN、DON和FB1的含量检测结果如表24所示：
表24试验饲料中霉菌毒素含量
其中，①来源于GB13078-2017。
(2)生长性能
将试验动物从第1d和第28d空腹(自由饮水)称重，计算平均日采食量、平均日增重和料重比，测试结果如表25所示：
表25复方脱霉剂对生长性能的影响
由表25可知，添加0.2wt％复方脱霉剂组的平均日采食量与基础日粮组差异不显著(P>0.05)，显著高于霉变基础日粮组以及市售霉克净组(P<0.05)。添加0.2wt％复方乳酸菌制剂组的料肉比低于基础日粮组，并且和市售霉克净组差异不显著(P>0.05)。表明，本发明提供的复方脱霉剂具有提高蛋雏鸡生长性能的作用且优于单一的葡甘露聚糖改性蒙脱石与复方乳酸菌制剂之和。
(3)抗氧化及免疫指标测定
按照测试例4的方法测定抗氧化指标检测血清和肝脏中SOD、MDA、T-AOC、GSH-Px、AST、ALT和AKP含量；免疫指标检测血清中IgG、IgM和IgA含量以及血清和脾脏中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6含量，测试结果如表26～27所示。
表26复方脱霉剂对蛋雏鸡血液抗氧化指标和肝损伤指标的影响
由表26可知，添加0.2wt％复方脱霉剂组受试鸡血浆MDA含量与基础日粮组差异不显著(P>0.05)，显著低于市售微生态脱霉剂组(P<0.05)。添加0.2wt％复方脱霉剂组受试鸡血浆GSH-Px活力显著高于基础日粮组和市售微生态脱霉剂组(P<0.05)。添加0.1wt％、0.2wt％复方脱霉剂组受试鸡血浆ALT活力低于基础日粮组(P<0.05)和霉克净组差异不显著(P>0.05)。添加0.2wt％复方脱霉剂组受试鸡血浆SOD活力、血浆T-AOC水平、血浆AST活力、血浆AKP活力和血浆T-AOC水平与基础日粮组和霉克净组差异不显著(P>0.05)。表明，复方乳酸菌制剂可以降低霉变饲料中霉菌毒素的含量，修复霉菌毒素对蛋雏鸡氧化损伤程度，提升蛋雏鸡抗氧化损伤的能力。
表27复方脱霉剂对蛋雏鸡血液免疫指标的影响
由表27可知，霉变基础日粮组受试鸡血浆IgM含量显著低于其他组(P<0.05)。添加复方脱霉剂组受试鸡血浆IgM含量与霉克净组差异不显著(P<0.05)，显著低于基础日粮组(P<0.05)；基础日粮组受试鸡血浆IL-2含量显著低于其他组(P<0.05)。添加0.2wt％复方脱霉剂受试鸡血浆IL-2含量与霉克净组差异不显著(P>0.05)，显著高于霉变基础日粮组(P<0.05)；霉变基础日粮组受试鸡血浆中IFN-γ、IL-4、IL-6和IgA含量显著低于其他组(P<0.05)。添加0.2wt％复方脱霉剂组与基础日粮组和霉克净组差异不显著(P>0.05)。表明，与饲喂霉变饲料的对照组相比，添加复方脱霉剂组蛋雏鸡血浆IL-4、IFN-γ、IgG、IgM和IgA含量显著提高，IL-6含量与对照组相比无明显提高，证明复方脱霉剂可以起到一定缓解霉菌毒素对蛋雏鸡免疫系统危害的作用。此外，饲喂霉变基础日粮组蛋雏鸡血浆IL-2的含量与饲喂基础日粮组相比有了明显的提高，可能是因为霉变饲料中的霉菌毒素未达到可以抑制IL-2的量，轻度中毒提升了免疫系统对霉菌毒素免疫应答的能力，使IL-2的含量有所提高。
综上所述，霉变饲料中添加复方脱霉剂剂能提高蛋雏鸡生长性能、抗氧化能力和免疫功能，修复霉菌毒素对肝脏的损伤，效果与不产生霉变的饲料组差异不显著；复方脱霉剂在雏鸡日粮的最佳添加水平为0.2wt％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种复方乳酸菌制剂，其特征在于，包括由发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种组成的复方乳酸菌及葡甘露聚糖改性蒙脱石；所述发酵乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的有效活菌数之比为（0.5~1.5）：（0.5~1.5）：（0.5~1.5），所述复方乳酸菌制剂的总有效活菌数≥108cfu/g。
2.根据权利要求1所述的复方乳酸菌制剂，其特征在于，所述复方乳酸菌制剂的总有效活菌数≥109cfu/g。
3.根据权利要求1所述的复方乳酸菌制剂，其特征在于，还包括冷冻保护剂。
4.一种复方脱霉剂，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述复方乳酸菌制剂。
5.根据权利要求4所述的复方脱霉剂，其特征在于，所述复方乳酸菌和葡甘露聚糖改性蒙脱石的质量比为（0.5~1.5）:4。
6.根据权利要求4或5所述的复方脱霉剂，其特征在于，所述葡甘露聚糖改性蒙脱石的制备方法，包括以下步骤：
将钠基蒙脱石和葡甘露聚糖溶液混合，调节pH值至3~6，进行改性反应，得到葡甘露聚糖改性蒙脱石。
7.根据权利要求6所述的复方脱霉剂，其特征在于，以葡甘露聚糖的量计，所述钠基蒙脱石和葡甘露聚糖溶液的质量比为4:（0.5~1.5）。
8.根据权利要求6所述的复方脱霉剂，其特征在于，所述改性反应的温度为30~40℃，时间为4~20h。
9.权利要求1~3任一项所述复方乳酸菌制剂或权利要求4~8任一项所述复方脱霉剂作为饲料添加剂的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述复方乳酸菌制剂或所述复方脱霉剂在饲料中的添加量独立地为0.05~0.5wt%。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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