CN111920823A - 丹参内酯在制备治疗帕金森病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物技术领域,提供一种丹参内酯的新应用,具体涉及丹参内酯在制备治疗帕金森病的药物中的应用。本发明通过提取分离得到丹参内酯,丹参内酯可显著抑制α‑突触核蛋白的表达,对秀丽隐杆线虫帕金森病病理模型具有显著的治疗作用,提示丹参内酯具有治疗帕金森病的潜力,可在制备治疗帕金森病的药物中应用,亦可在制备预防和辅助治疗帕金森病的保健品中应用。
Description
一、技术领域
本发明属于药物技术领域,提供一种丹参内酯的新应用,具体涉及丹参内酯在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
二、背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease,PD),又称震颤麻痹,是仅次于阿尔茨海默病的第二大神经退行性疾病。具有进行性、多发性、隐匿性起病的特点,主要表现为运动缓慢、肌肉僵硬、静止性震颤、体位不稳等。PD的发病年龄在40~70岁之间,50~60岁为发病高峰。患病率随着年龄增高而升高,男性稍高于女性(张,2012)。创伤、抑郁、过度劳累和感冒都会导致这种疾病。帕金森病在老年人群中正变得越来越普遍,既是一个需要加强护理的主要健康问题,也是一个经济挑战。这给家庭和社会带来了沉重的负担。
黑质多巴胺能神经元变性丢失导致黑质纹状体通路多巴胺减少和黑质神经元出现由α-突触核蛋白(α-synuclein)组成的蛋白聚集体(路易小体,PD病理形态学标记物)是目前公认的两个重要病理特征。
采用帕金森哺乳动物病理模型筛选抗帕金森病的药物周期长、成本高。采用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)可使筛选周期从月为单位下降至以天为单位。秀丽隐杆线虫是一个非常有用的多功能药物筛选和药物作用机制的研究平台。它廉价、易培养、世代周期短、后代数目多,同时可获得大量背景一致的个体,保证实验重复性和采用大样本量进行实验,从而排除个体差异的影响;与高等生物在基因和分子通路方面高度保守(Kaletta and Hengartner,2006)。它作为一个从细胞体外水平药物初筛到小鼠体内水平药物复筛的一个桥梁,越来越受到药学家的青睐。美国devGen公司利用人源化线虫筛选的抗心律不齐药物已被FDA批准进入临床研究。
将人源α-突触核蛋白与YFP黄色荧光蛋白融合,插入到线虫肌肉特异性启动子之下,人类α-突触核蛋白便可在线虫肌肉组织特异性表达。由于线虫通体透明,利用荧光显微镜可清晰地观察到黄色荧光,荧光越强,人源α-突触核蛋白表达越高。对PD有治疗作用的药物可显著抑制α-突触核蛋白表达产生的荧光,待检药物抑制荧光能力越强,抗PD活性就越好(Fu et al.,2014)。
栗色鼠尾草(Salvia castanea)为唇形科鼠尾草属植物,在中医药学中具有活血祛瘀,活血调经,养心除烦的作用,用于瘀血证,月经不调,痛经,心烦失眠,心悸。从栗色鼠尾草中提取的丹参酮类化合物对PTP1B具有竞争性抑制作用,并可能成为开发2型糖尿病治疗药物的新资源(胡et al.,2009)。现有技术公开了丹参内酯通过抑制肿瘤组织中的血管生成,从而抑制肿瘤的生长,但是对于丹参内酯是否具有抗PD作用尚未可知。
基于上述研究现状,本发明公开了一种丹参内酯的新应用,所述丹参内酯可显著抑制α-突触核蛋白的表达,对秀丽隐杆线虫帕金森病病理模型具有显著的治疗作用,提示丹参内酯具有治疗帕金森病的潜力,可在制备治疗帕金森病的药物中应用,亦可在制备预防和辅助治疗帕金森病的保健品中应用。
三、发明内容
1.本发明的目的是提供一种丹参内酯的应用。
2.具体涉及丹参内酯在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
3.所述丹参内酯作为药效成分的药物制剂为注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液、片剂等任一剂型,这是本领域技术人员可以理解的。
4.所述丹参内酯亦可在制备预防和辅助治疗帕金森病的保健品中应用。
5.所述丹参内酯作为有效成分的保健品剂型为散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液、片剂等任一剂型,这是本领域技术人员可以理解的。
6.本发明所述丹参内酯的制备方法如下:
取阴干的栗色鼠尾草全草7.5kg,机械粉碎,将粉碎后的药材装入桶中,用95%的乙醇将全部植物浸没,每次浸泡1周,重复提取4次,用旋转蒸发仪减压浓缩提取液,之后用水浴蒸发的方式继续浓缩至浸膏状即可,称重得1.4kg。
然后用温热的蒸馏水(1.5L)和乙酸乙酯(1.5L)将乙醇浸膏分散萃取。分别萃取四次,继续减压浓缩乙酸乙酯萃取液至浸膏状,称重得乙酸乙酯萃取物407.3g。
将乙酸乙酯萃取物以1:1的比例与硅胶(100-200目)均匀拌样后,待晾干后上硅胶柱。洗脱采用石油醚/丙酮(V/V)40:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1梯度洗脱,最后用甲醇作为流动相洗脱,通过薄层色谱检测试验(TLC),合并相似组分,最终得到6个部分(A-F)。
B部分合并相似组分得到Ba,Ba部分硅胶拌样后上硅胶柱,洗脱剂采用石油醚/乙酸乙酯比例为(V/V)40:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1,甲醇,得到(Ba1-Ba3)3个部分。
Ba1上Sephadex LH-20凝胶柱,用氯仿/甲醇比例为2:3洗脱,再经过制备薄层色谱(PTLC)得到白色针状晶体,丙酮重结晶得所述丹参内酯。
7.本发明以秀丽隐杆线虫PD病理模型进行实验,结果表明:丹参内酯可显著抑制α-突触核蛋白的表达,对秀丽隐杆线虫PD病理模型具有显著的治疗作用,提示丹参内酯具有治疗帕金森病的潜力,可在制备治疗帕金森病的药物中应用,亦可在制备预防和辅助治疗帕金森病的保健品中应用。
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案,但本发明的保护范围不局限于以下所述。
四、附图说明
图1丹参内酯结构式。
图2本发明所述丹参内酯减少OW13线虫α-突触核蛋白的积累。
五、具体实施方式
实施例1
本发明所述丹参内酯的制备:
取阴干的栗色鼠尾草全草7.5kg,机械粉碎,将粉碎后的药材装入桶中,用95%的乙醇将全部植物浸没,每次浸泡1周,重复提取4次,用旋转蒸发仪减压浓缩提取液,之后用水浴蒸发的方式继续浓缩至浸膏状即可,称重得1.4kg。然后用温热的蒸馏水(1.5L)和乙酸乙酯(1.5L)将乙醇浸膏分散萃取。分别萃取四次,继续减压浓缩乙酸乙酯萃取液至浸膏状,称重得乙酸乙酯萃取物407.3g。将乙酸乙酯萃取物以1:1的比例与硅胶(100-200目)均匀拌样后,待晾干后上硅胶柱。
洗脱采用石油醚/丙酮(V/V)40:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1梯度洗脱,最后用甲醇作为流动相洗脱,通过薄层色谱检测试验(TLC),合并相似组分,最终得到6个部分(A-F)。B部分合并相似组分得到Ba,Ba部分拌样后上硅胶柱,洗脱剂采用石油醚/乙酸乙酯比例为(V/V)40:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1,甲醇,得到(Ba1-Ba3)3个部分。
Ba1上Sephadex LH-20凝胶柱,用氯仿/甲醇比例为2:3洗脱,再经过制备薄层色谱(PTLC)得到白色针状晶体,丙酮重结晶得所述丹参内酯。
实施例2
本发明所述丹参内酯对秀丽隐杆线虫PD病理模型的治疗作用:
1.生物材料
(1)秀丽隐杆线虫OW13购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC),为转基因品系。该种系的人源α-突触核蛋白与YFP黄色荧光蛋白融合,被插入到肌肉特异性启动子之下,因此该株系线虫肌肉组织特异性表达人类α-突触核蛋白,以荧光显微镜观察,荧光越强,α-突触核蛋白表达越高。对PD有治疗作用的药物可显著抑制α-突触核蛋白表达产生的荧光,待检药物抑制荧光能力越强,抗PD活性就越好。本实施例采用秀丽隐杆线虫OW13株系作为筛选抗PD药物的病理模型。
(2)大肠杆菌OP50(尿嘧啶渗漏突变株),购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC),作为秀丽隐杆线虫的食物。
2.试剂
(1)固体NGM(Nematode Growth Medium)培养基成分与制作(以1000毫升为例):
成分 | 含量 |
NaCl | 3.00g |
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | 2.34g |
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 17.23g |
蛋白胨 | 2.50g |
琼脂 | 17.00g |
补充H<sub>2</sub>O至 | 1000mL |
固体NGM培养基配制好后,121℃下高压恒温灭菌20min,在无菌操作台下加入5mg/mL胆固醇1mL,1M MgSO41mL,1M CaCl21mL摇匀,趁热倒入已灭菌的9cm培养板,约20mL/板。静置等待培养基凝固,备用。
(2)M9液配方(以1000毫升为例):
成分 | 含量 |
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | 6.00g |
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 3.00g |
NaCl | 5.00g |
1MMgSO<sub>4</sub> | 1.00mL |
补充H<sub>2</sub>O至 | 1000mL |
(3)裂解液的配制:6.4%NaClO溶液和1M NaOH溶液按体积比1:1混合。
3.配制含有丹参内酯的NGM平板
称取丹参内酯0.0014g,加500μl DMSO溶解配成0.01M母液,加入NGM培养基的终浓度分别为10μM,20μM和40μM,将NGM倒入各平板,静置等待培养基凝固。在培养基上均匀涂布大肠杆菌OP50作为线虫的食物。
4.实施步骤
(1)线虫的培养:
将秀丽隐杆线虫接在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上,然后置于20℃的培养箱中培养,当线虫长到成虫时进行同步化处理。
(2)线虫同步化:
当NGM培养基含有大量成虫并且有部分虫卵已经孵出时,用M9缓冲液将线虫从培养基上冲下,转移到15ml离心管中,静置使线虫自由沉降至管底,弃去上清。向离心管中加入4ml裂解液,在旋涡混合仪上振荡5-7分钟待线虫全部断裂时停止涡旋,并分装于1.5mL离心管中,用M9溶液洗线虫卵三次。
(3)实验组设置
空白对照组:DMSO;
阳性对照组:50μM(n-butylidenephthalide);
丹参内酯组:10μM;20μM;40μM。
(4)实验步骤
将同步化后的虫卵分装于离心管中,M9缓冲液中孵化30小时成为同步化的L1期幼体线虫,吸取10μl计数三次,取平均值,将线虫转移到含不同浓度的丹参内酯的NGM培养基,空白对照组为涂布有OP50并加有与丹参内酯组等体积DMSO的NGM培养基,阳性对照药为n-butylidenephthalide(Fu et al.,2014)。每个培养皿接300条线虫,每个药物浓度三个培养皿作为平行,20℃继续培养72小时。再用M9将线虫冲洗下来,4000rpm,5min离心除去上清(M9培养基),加入25mM NaN3麻醉线虫,在荧光显微镜下观察,拍照。每组随机观察40条线虫,所有图片采用Image J软件定量分析荧光强度。
(5)实验结果
图2的纵坐标表示YFP荧光强度,由于同α-突触核蛋白融合,因此代表α-突触核蛋白在线虫肌肉组织的表达量,此值越低,表明丹参内酯抗PD活性越高,即丹参内酯抗PD作用越强。不同字母意味着差异显著p<0.05。
实验结果表明,在本实施例中丹参内酯显著抑制了人源α-突触核蛋白在线虫肌肉组织中的表达,提示丹参内酯对PD具有显著的治疗作用,最佳用药浓度为10μM,进一步增加药物浓度,药理效应无明显增加,降低用药浓度则失去药理效应,提示该药作用浓度范围较窄或无明显量效关系。
通过以上实施例证明,丹参内酯对秀丽隐杆线虫帕金森病病理模型具有显著的治疗作用,提示本发明所述丹参内酯具有治疗帕金森病的潜力,可在制备治疗帕金森病的药物中应用,亦可在制备预防和辅助治疗帕金森病的保健品中应用。
Claims (5)
1.丹参内酯在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述丹参内酯作为药效成分的药物制剂为注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液、片剂。
3.丹参内酯在制备预防和辅助治疗帕金森病的保健品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述丹参内酯作为有效成分的保健品剂型为散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液、片剂。
5.如权利要求1或3任一项所述的应用,其特征在于,所述丹参内酯的制备方法如下:
取阴干的栗色鼠尾草全草7.5kg,机械粉碎,将粉碎后的药材装入桶中,用95%的乙醇将全部植物浸没,每次浸泡1周,重复提取4次,用旋转蒸发仪减压浓缩提取液,之后用水浴蒸发的方式继续浓缩至浸膏状即可,称重得1.4kg。然后用温热的蒸馏水(1.5L)和乙酸乙酯(1.5L)将乙醇浸膏分散萃取。分别萃取四次,继续减压浓缩乙酸乙酯萃取液至浸膏状,称重得乙酸乙酯萃取物407.3g。将乙酸乙酯萃取物以1:1的比例与硅胶(100-200目)均匀拌样后,待晾干后上硅胶柱。洗脱采用石油醚/丙酮(V/V)40:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1梯度洗脱,最后用甲醇作为流动相洗脱,通过薄层色谱检测试验(TLC),合并相似组分,最终得到6个部分(A-F)。
B部分合并相似组分得到Ba,Ba部分拌样后上硅胶柱,洗脱剂采用石油醚/乙酸乙酯比例为(V/V)40:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1,甲醇,得到(Ba1-Ba3)3个部分。Ba1上SephadexLH-20凝胶柱,用氯仿/甲醇比例为2:3洗脱,再经过制备薄层色谱(PTLC)得到白色针状晶体,丙酮重结晶得所述丹参内酯。
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