CN110064006B - 一种中药组合物在制备抗帕金森症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，提供一种中药组合物在制备抗帕金森药物中的应用。本发明的中药组合物包括以下重量比的原料药：当归1～2份、川芎1～2份、炒白芍1～2份、熟地黄1～2份。本发明以模式生物秀丽隐杆线虫进行的体内实验，结果显示该中药组合物可显著抑制α‑突触核蛋白的表达，表明该中药组合物具有治疗帕金森症的潜力，可在制备抗帕金森症的药物中应用。

Description

一种中药组合物在制备抗帕金森症药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种中药组合物的一种新用途，具体地讲，本发明提供了一种中药组合物在制备抗帕金森药物中的应用。
背景技术
帕金森症(Parkinson’s disease，PD)是第二大神经退行性疾病，表现为运动能力和认识功能下降。运动能力上表现为肌肉僵硬、运动迟缓和震颤；行为和认知能力上表现为痴呆、抑郁、焦虑和睡眠紊乱。这一疾病的发病率在大于60岁的人群中迅速增加。病患生活质量随疾病发展不断下降，直至负累家庭，给社会和家庭带来沉重的负担。
帕金森症的主要病理特征为α-突触核蛋白在脑组织中聚积。到目前为止，尚无有效的治疗药物。
采用传统帕金森哺乳动物病理模型筛选抗帕金森药物周期长、成本高，而采用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)可使筛选周期从月为单位下降至以天为单位，因此，秀丽隐杆线虫已成为一个非常有用的药物筛选模型。秀丽隐杆线虫廉价、易培养；世代周期短、后代数目多，同时可获得大量背景一致的个体，保证实验重复性和采用大样本量进行实验，从而排除个体差异的影响；另外，秀丽隐杆线虫与高等生物在基因和分子通路方面高度保守(Kaletta and Hengartner，2006)。因此，秀丽隐杆线虫越来越受到药学家的青睐。美国devGen公司利用人源化线虫筛选的抗心律不齐药物已被FDA批准进入临床研究。
将人源α-突触核蛋白与YFP黄色荧光蛋白融合后，置于秀丽隐杆线虫肌肉特异性启动子之下，人类α-突触核蛋白便可在秀丽隐杆线虫肌肉组织特异性表达。由于秀丽隐杆线虫通体透明，利用荧光显微镜可清晰地观察到黄色荧光，荧光越强，人源α-突触核蛋白表达越高。对PD有治疗作用的药物可显著抑制α-突触核蛋白表达产生的荧光，待检药物抑制荧光能力越强，抗PD活性就越好(Fμet al.，2014)。
发明名称为一种治疗帕金森病的中药制剂(CN 104922406 A)的专利，公开了一种由钩藤、熟地黄、当归、白芍、知母组成的中药制剂，实验研究表明，该中药制剂可改善MPTP诱发的亚急性PD模型小鼠的爬杆和转棍行为学，提高其纹状体多巴胺的含量，提示其具有治疗帕金森病的功效。
本发明公开了一种中药组合物，可显著减弱与人源α-突触核蛋白融合的黄色荧光蛋白在秀丽隐杆线虫肌肉组织中呈现的荧光强度，表明本发明的中药组合物可显著下调人源α-突触核蛋白表达的活性，具有治疗帕金森症的潜力，可在制备抗帕金森症药物中应用。实验结果显示，相对于现有技术，本发明所保护的中药组合物治疗帕金森症的效果更好。
参考文献
FμR.H.，Harn H.J.，LiμS.P.，Chen C.S.，Chang W.L.，et al.n-Bμtylidenephthalide protects against dopaminergic neμron degeneration and a-Synμclein accμmμlation in Caenorhabditis elegans models of Parkinson’sdisease.PLoS ONE 2014，9(1):e85305.doi:10.1371/joμrnal.pone.0085305.
Kaletta T，Hengartner MO.Finding fμnction in novel targets:C.elegansas a model organism.Nat Rev Drμg Discov 2006，5:387e398.
Ma，L.，Qin，C.，Wang，M.，Gan，D.，Cao，L.，Ye，H.，et al.Preparation，preliminarycharacterization and inhibitory effect on hμman colon cancer HT-29cells of anacidic polysaccharide fraction from Stachys floridana Schμttl.exBenth.Food and Chemical Toxicology 2013，60:269–276.
FμR.H.，Wang Y.C.，Chen C.S.，Tsai R.T.，LiμS.P.，Chang W.L.，Lin H.L.，etal.Acetylcorynoline attenμates dopaminergic neμron degeneration and a-synμclein aggregation in animal models of Parkinson’s disease.Neμropharmacology82(2014)108e120.
发明内容
本发明的目的是提供一种中药组合物在制备抗帕金森症药物中的新用途，具体涉及这种中药组合物在制备抗帕金森症药物中的应用，以期提供一种抗帕金森症药物候选物。
本发明所请求保护的中药组合物包括以下重量比的原料药：当归1～2份、川芎1～2份、炒白芍1～2份、熟地黄1～2份。
优选地，本发明所请求保护的中药组合物包括以下重量比的原料药：当归1份、川芎1份、炒白芍1份、熟地黄1份。
所述的中药组合物为当归、川芎、炒白芍和熟地黄的水煎剂。
本发明所请求保护的中药组合物制备方法如下：按重量比称取当归、川芎、炒白芍、熟地黄，加蒸馏水浸泡后，加热煮沸，过滤去药渣，收集药液备用，将药渣再次用蒸馏水浸泡后，加热煮沸，再次过滤取上清液，将两次药液合并，浓缩并定容，离心，弃去不溶沉淀，过滤除菌，分装后保存。
其中，浸泡时间为20分钟。
其中，加热煮沸时间为30分钟。
其中，离心速度为12000rpm。
其中，离心时间为10分钟。
本发明所述的中药组合物在制备治疗抗帕金森症药物中的应用，可以将这种中药组合物添加药学上可接受的载体如填充剂、润滑剂、湿润剂、促进吸收剂、吸附载体、稀释剂、赋形剂等，必要时可加入甜味剂、香味剂等，制备成注射剂、散剂、颗粒剂、丸剂、口服液、片剂等药物的多种剂型，这是本领域技术人员可以理解的。
附图说明
图1各组平均荧光强度值
不同字母意味着差异显著p<0.05。
具体实施方式
以下提供具体实施例以实现本发明所述的中药组合物在制备抗帕金森症药物中应用，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例一 中药组合物水煎剂的制备
煎煮法制备中药组合物水煎剂(1:1:1:1)：称取当归6g、川芎6g、炒白芍6g、熟地黄6g，加蒸馏水200mL，浸泡20min后，加热煮沸并保持30分钟，用纱布初步滤去药渣，收集药液备用，将药渣再次用150ml蒸馏水浸泡5-10min，加热煮沸并保持25min，再次用纱布滤去药渣获得上清液，将两次药液合并，浓缩并定容至50ml，12000rpm×10min离心2次，弃去不溶沉淀，用0.22μm水系滤头过滤除菌，分装后于-20℃保存。
实施例二 中药组合物水煎剂的制备
煎煮法制备中药组合物水煎剂(1:1:1:2)：称取当归4.8g、川芎4.8g、炒白芍4.8g、熟地黄9.6g，加蒸馏水200mL，浸泡20min后，加热煮沸并保持30分钟，用纱布初步滤去药渣，收集药液备用，将药渣再次用150ml蒸馏水浸泡5-10min，加热煮沸并保持25min，再次用纱布滤去药渣获得上清液，将两次药液合并，浓缩并定容至50ml，12000rpm×10min离心2次，弃去不溶沉淀，用0.22μm水系滤头过滤除菌，分装后于-20℃保存。
实施例三 中药组合物水煎剂的制备
煎煮法制备中药组合物水煎剂(2:2:2:1)：称取当归6.86g、川芎6.86g、炒白芍6.86g、熟地黄3.43g，加蒸馏水200mL，浸泡20min后，加热煮沸并保持30分钟，用纱布初步滤去药渣，收集药液备用，将药渣再次用150ml蒸馏水浸泡5-10min，加热煮沸并保持25min，再次用纱布滤去药渣获得上清液，将两次药液合并，浓缩并定容至50ml，12000rpm×10min离心2次，弃去不溶沉淀，用0.22μm水系滤头过滤除菌，分装后于-20℃保存。
实施例四 阳性对照1水煎剂的制备
煎煮法制备阳性对照1水煎剂：称取钩藤3.69g、熟地黄5.54g、当归7.38g、炒白芍3.69g、知母3.69g，加蒸馏水200mL，浸泡20min后，加热煮沸并保持30分钟，用纱布初步滤去药渣，收集药液备用，将药渣再次用150ml蒸馏水浸泡5-10min，加热煮沸并保持25min，再次用纱布滤去药渣获得上清液，将两次药液合并，浓缩并定容至50ml，12000rpm×10min离心2次，弃去不溶沉淀，用0.22μm水系滤头过滤除菌，分装后于-20℃保存。
实施例五 阳性对照2水煎剂的制备
煎煮法制备阳性对照2水煎剂：称取当归12g、川芎12g，加蒸馏水200mL，浸泡20min后，加热煮沸并保持30分钟，用纱布初步滤去药渣，收集药液备用，将药渣再次用150ml蒸馏水浸泡5-10min，加热煮沸并保持25min，再次用纱布滤去药渣获得上清液，将两次药液合并，浓缩并定容至50ml，12000rpm×10min离心2次，弃去不溶沉淀，用0.22μm水系滤头过滤除菌，分装后于-20℃保存。
实施例六 一种中药组合物对帕金森秀丽隐杆线虫的治疗作用
1.生物材料
(1)秀丽隐杆线虫OW13购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)；为转基因品系，人源α-突触核蛋白与YFP黄色荧光蛋白融合被插入肌肉特异性启动子之下，因此该株系线虫肌肉组织特异性表达人类α-突触核蛋白，以荧光显微镜观察，荧光越强，α-突触核蛋白表达越高。对PD有治疗作用的药物可显著抑制α-突触核蛋白表达产生的荧光，待检药物抑制荧光能力越强，抗PD活性就越好。本实施例采用秀丽线虫OW13株系作为筛选抗PD药物的病理模型。
(2)大肠杆菌OP50(尿嘧啶渗漏突变株)，购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)，作为秀丽隐杆线虫的食物。
2.试剂
(1)固体NGM(Nematode Growth Mediμm)培养基成分与制作(以1升为例)：
成分 含量
NaCl 3.00g
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 2.34g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 17.23g
蛋白胨 2.50g
琼脂 17.00g
补充H<sub>2</sub>O至 1000mL
固体NGM培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，在无菌操作台下加入5mg/mL胆固醇1mL，1M MgSO4 1mL，1M CaCl2 1mL摇匀，趁热倒入已灭菌的9cm培养板，约20mL/板。静置等待培养基凝固，备用。
(2)M9液配方
成分 含量
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 6.00g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 3.00g
NaCl 5.00g
1M MgSO<sub>4</sub> 1.00mL
补充H<sub>2</sub>O至 1000mL
(3)裂解液的配制：6.4％NaClO溶液和1M NaOH溶液按体积比1:1混合。
3.配制含有一种中药组合物的NGM平板
将一种中药组合物以无菌水稀释，加入NGM培养基的终浓度分别为4.8mg/mL，9.6mg/mL和48mg/mL，将NGM倒入各平板，静置等待培养基凝固。在培养基上均匀涂布大肠杆菌OP50作为线虫的食物。
4.实施步骤
(1)线虫的培养：
将线虫接在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上，然后置于20℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。
(2)线虫同步化：
挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出的NGM培养基，用M9液将线虫从培养基上冲下，转移到离心管中，静置使线虫自由沉降至管底，弃上清。视线虫量多少向离心管中加入裂解液，在漩祸搅拌器上振荡5-7分钟待线虫全部断裂时停止涡旋，并分装于1.5mL离心管中，用M9溶液洗线虫卵三次。
(3)中药组合物水煎剂抑制人源α-突触核蛋白在秀丽隐杆线虫OW13肌肉组织中的表达
将同步化后分装于离心管，M9缓冲中孵化48小时成为同步化的L1期幼体线虫，4000rpm，5min离心除去多余M9，将线虫转移到涂布有OP50的NGM板中20℃培养至L3期，用M9液冲冼下线虫，4000rpm，5min离心除去多余M9，最终将线虫转移到含不同浓度的一种中药组合物的NGM培养皿和空白对照为涂布有OP50并加有与一种中药组合物等体积无菌水的NGM培养皿中，所有NGM皿中均含有50μM 5-氟脱氧尿苷(FUDR)，用以抑制线虫繁殖，避免产生世代交叠。每个培养皿60条线虫，每个药物浓度三个培养皿作为平行，25℃继续培养72小时。再用M9将冲冼下来，4000rpm，5min离心除去多余M9，加入20mM NaN3麻醉线虫，在荧光显微镜下观察，拍照。每组随机观察25条线虫，所有图片采用Image J软件定量分析荧光强度。结果见图1。
图1中纵坐标表示为平均荧光强度(YFP)，由于同α-突触核蛋白融合，因此代表α-突触核蛋白在线虫肌肉组织的表达，此值越低，表明一种中药组合物抗PD活性越高，即一种中药组合物抗PD作用越强。不同字母意味着差异显著p<0.05。
实验结果表明，在本实施例中，相对于空白对照组、1:1:1:2组、2:2:2:1组以及阳性对照1水煎剂组和阳性对照2水煎剂组，1:1:1:1配比的中药组合物水煎剂显著抑制了人源α-突触核蛋白在线虫肌肉组织的表达，提示其对PD具有显著的治疗作用。
通过以上实施例证明，本发明提供的中药组合物对PD秀丽隐杆线虫发挥显著的治疗作用，提示本发明提供的中药组合物具有抗PD的潜力，可在制备防治PD的药物中应用。

Claims (3)

1.一种中药组合物在制备抗帕金森症药物中的应用，其特征在于，所述的中药组合物按照重量份数计，由如下原料药组分组成：当归1份、川芎1份、炒白芍1份、熟地黄1份。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的制备方法如下：按重量比称取当归、川芎、炒白芍、熟地黄，加蒸馏水浸泡后，加热煮沸，过滤去药渣，收集药液备用，将药渣再次用蒸馏水浸泡后，加热煮沸，再次过滤取上清液，将两次药液合并，浓缩并定容，离心，弃去不溶沉淀，过滤除菌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述的中药组合物添加药学上可接受的载体制备成注射剂、散剂、颗粒剂、丸剂、口服液、片剂。
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养血清脑颗粒改善帕金森病患者日间过度嗜睡状态的临床疗效观察;潘先芳等;《中风与神经疾病杂志》;20140331;第31卷(第3期);第263-264页，尤其是第264页"3讨论" *

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