CN109260184A

CN109260184A - 补骨脂乙素在抑制Tau蛋白异常聚集中的应用

Info

Publication number: CN109260184A
Application number: CN201811485373.7A
Authority: CN
Inventors: 肖时锋; 张默涵; 吴秋平
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2018-12-06
Filing date: 2018-12-06
Publication date: 2019-01-25

Abstract

本发明公开了补骨脂乙素作为Tau蛋白异常聚集的抑制剂和在制备预防/治疗Tau蛋白病的药物，或预防/缓解Tau蛋白病的功能食品或保健品中的应用中的应用。本发明公开了补骨脂乙素具有有效抑制Tau蛋白异常聚集功能，进而阻止Tau蛋白病的病理进程，另外，由于补骨脂乙素无毒，从而可将补骨脂乙素作为一种抗Tau蛋白病药物用于神经退行性疾病的治疗。

Description

补骨脂乙素在抑制Tau蛋白异常聚集中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体的是涉及一种补骨脂乙素在抑制Tau蛋白异常聚集抑制剂、预防/治疗Tau蛋白病的药物中的应用。

背景技术

近年来，老年神经退行性疾病患者逐年递增，表现为认知障碍，记忆力减退，行为和运动能力减弱等等。其中一种蛋白质沉积便是神经细胞内的神经纤维缠结，该缠结是由Tau蛋白异常聚集纤维化形成，从而导致神经元结构改变、功能退化、甚至凋亡。越来越多的研究者认为Tau蛋白是神经退行性疾病的有效靶点。常见的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹、皮克病、帕金森病等，统称为Tau蛋白病。Tau蛋白病是一种常见的神经退行性疾病，是一类在人脑中因神经元纤维缠结(NFT)的病理性聚集所致的神经变性疾病。近年来越来越多的学者认为Tau蛋白是这些神经退行性疾病的有效靶点。

Tau蛋白广泛存在于大脑的额叶、颞叶、海马及周围的神经细胞中，是含量最高的微管相关蛋白。Tau蛋白是位于常染色体17号位，主要的生理功能是促进微管的聚集，并稳定其结构、诱导其成束、驱动神经元轴突的生长等。随着以Aβ以及其淀粉样聚集物为靶点的药物研发的临床失败，频频受阻，越来越多的人开始关注以Tau作为靶点的疗法。这对于神经退行性疾病的早期预防和治疗显得尤为重要，对Tau病理学的研究具有普遍的生物学意义。

目前，治疗Tau蛋白病一般是根据Tau蛋白病的种类分别施药和实施治疗方案。比如根据具体神经退行性疾病各种治病机理研发的相关治疗药物，具体可以分为：抗氧化剂、抗炎剂和抗细胞凋亡剂等。其中，抗氧化剂包括依达拉奉、还原型谷胱甘肽、维生素E、乙酰半胱氨酸、司来吉兰、雷沙吉兰等，抗炎剂非甾体类消炎药NSAIDs、塞来昔布等，抗凋亡剂包括p53抑制剂等。尽管目前已有数十种治疗神经衰退型疾病的可筛选药物，而且许多动物实验也能肯定某些新药的疗效，但是在药物的临床实验中却不尽人意。

补骨脂乙素是一种多羟基黄酮类化合物，黄酮类化合物广泛存在于水果、蔬菜、谷物、茶、葡萄酒和果汁中。黄酮类化合物有较强的抗氧化性，抗炎和信号通路调节剂等功能，但是目前没有发现将补骨脂乙素用于Tau蛋白异常聚集以及用于Tau蛋白病药物中的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种补骨脂乙素作为Tau蛋白异常聚集相关抑制剂或者药物中的应用，以解决现有抑制Tau蛋白异常聚集和治疗Tau蛋白病的药物临床中药效不理想的技术问题。

为了实现上述发明目的，本发明的一方面，提供了补骨脂乙素作为Tau蛋白异常聚集的抑制剂的应用。

优选地，所述Tau蛋白异常聚集包括由基因突变引起或异常修饰所导致的Tau蛋白寡聚化或纤维化。

本发明的另一方面，提供了补骨脂乙素在制备预防/治疗Tau蛋白病的药物中的应用，或预防/缓解Tau蛋白病的功能食品或保健品中的应用。

优选地，所述Tau蛋白病包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹和皮克病中的至少一种。

本发明的再一方面，提供了一种预防/治疗Tau蛋白病的药物。所述预防/治疗Tau蛋白病的药物包括有效剂量的补骨脂乙素。

优选地，所述补骨脂乙素的所述有效剂量为10μM-1mM。

优选地，所述预防/治疗Tau蛋白病药物还包括药学上可接受的所述补骨脂乙素的载体。

具体地，所述载体包括赋予所述药物剂型的辅料、用于保护所述补骨脂乙素稳定的化合物或组合物中的至少一种。

本发明的又一方面，本发明还提供了一种抑制Tau蛋白异常聚集的方法。所述方法包括将有效剂量的补骨脂乙素或预防/治疗Tau蛋白病与Tau蛋白接触的步骤。

与现有技术相比，本发明补骨脂乙素具有以下有益效果：

经实验证明，所述补骨脂乙素具有相对较强的抑制Tau蛋白异常聚集的功能，因此，将所述补骨脂乙素作为Tau蛋白异常聚集的抑制剂后，能够起到有效抑制Tau蛋白异常聚集的作用，同时还具有并解聚已形成的Tau蛋白纤维的作用，从而预防或治疗由Tau蛋白异常聚集而引发的Tau蛋白病。

本发明补骨脂乙素在制备预防/治疗Tau蛋白病的药物或预防/缓解Tau蛋白病功能食品或保健品中的应用后以及基于其该应用制备的预防/治疗Tau蛋白病的药物和抑制Tau蛋白异常聚集的方法均能够用于抑制Tau蛋白异常聚集。另外，由于补骨脂乙素无毒，其疗效好、毒副作用小。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为实施例1中不同浓度的补骨脂乙素对TauK18蛋白纤维化的抑制作用结果；

图2为实施例2中低、中、高浓度的补骨脂乙素抑制TauK18蛋白纤维化的透射电镜照片,黑色标尺长度为0.2μm；

图3为实施例3中不同浓度的补骨脂乙素对TauK18纤维的解聚结果；

图4为实施例4中低、中、高浓度的补骨脂乙素解聚TauK18蛋白纤维后的透射电镜照片,黑色标尺长度为0.2μm。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例与附表，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

专用名称的解释：

补骨脂乙素(isobavachalcone或Corylifolinin)：又名异补骨脂查尔酮，属于中药补骨脂中的查尔酮成分，具有抗癌，抗炎，抗菌等生物活性。所述补骨脂乙素的分子式为C₂₀H₂₀O₄，分子结构式如下：

Tau蛋白：由17号染色体长臂上的单基因编码，为含量最高的微管相关蛋白(microtubule-associated proteins,MAP)，具有高度可溶性。完整的Tau蛋白含有441个氨基酸，包含N端突出区域、富含脯氨酸区和C端微管结合区域。C端结合区主要包括4个高度保守的微管蛋白结合重复序列R1-R4，(R1：244-274位氨基酸，R2：275-305位氨基酸，R3：306-336位氨基酸，R4：337-368位氨基酸)。下文各实施例中是选取该区域(TauK18)作为药物筛选模型。TauK18分子包含了Tau蛋白的全部功能区域，既可以像全长Tau蛋白一样与微管蛋白相结合，又是Tau蛋白纤维化的核心部分，能够聚集形成纤维，甚至聚集能力比全长Tau蛋白更强，是模拟全长Tau蛋白的一个有效模型，可作为体外药物筛选的依据。

Tau蛋白病：是微管结合蛋白的一种Tau蛋白的异常疾病的总称，是一种常见的神经退行性疾病，是一类在人脑中因神经元纤维缠结(NFT)的病理性聚集所致的神经变性疾病。

本发明的发明人基于大量研究发现，补骨脂乙素具有相对较强的抑制Tau蛋白异常聚集，实现抑制Tau蛋白纤维化和对Tau蛋白纤维解聚能力的等相关能力，基于此，本发明实施例提供了补骨脂乙素在下文相关方面的应用。

一方面，本发明实施例提供了补骨脂乙素作为Tau蛋白异常聚集的抑制剂的应用。经发明人构建的相关实验得知，所述补骨脂乙素作为活性成分，能够有效抑制Tau蛋白的异常聚集，实现抑制Tau蛋白纤维化和对Tau蛋白纤维解聚能力，而且补骨脂乙素无毒，其疗效好、毒副作用小。

另外，通过体外实验得知，所述补骨脂乙素抑制Tau蛋白异常聚集有效剂量低，如所述补骨脂乙素抑制TauK18蛋白异常聚集的IC₅₀值为为13.4μM。而且，经实验验证，如下文的实施例1结果得知，补骨脂乙素抑制Tau蛋白异常聚集的效果与补骨脂乙素的剂量呈明显的相关性，进一步研究得知，高浓度补骨脂乙素阻碍Tau蛋白异常聚集如抑制Tau蛋白纤维形成的效果最为明显，并且药效发挥与其浓度具有良好的依赖关系。

在上述各实施例中所述Tau蛋白异常聚集包括由基因突变引起或异常修饰所导致的Tau蛋白寡聚化或纤维化。而且，基于将含有补骨脂乙素的分子结构本体的补骨脂乙素衍生物用于抑制Tau蛋白异常聚集而开发的相关产品，如药品、功能食品和保健品也均在本发明实施例公开的范围。

另一方面，基于上文所述补骨脂乙素具有抑制Tau蛋白异常聚集的功能和作用，因此，所述补骨脂乙素可以被用于制备预防/治疗Tau蛋白病的药物中的应用，或预防/缓解Tau蛋白病的功能食品或保健品中的应用。这样，在制备的预防/治疗Tau蛋白病药物或预防/缓解Tau蛋白病的功能食品或保健品中，所述补骨脂乙素是作为抑制Tau蛋白异常聚集的有效成分，从而实现抑制Tau蛋白的异常聚集，如包括抑制Tau蛋白寡聚化或纤维化，同时还包括对Tau蛋白纤维化解聚，以达到预防/治疗/缓解Tau蛋白病的效果。补骨脂乙素在预防、缓解或治疗Tau蛋白病的相应药物、功能食品或保健品中的应用时，所述补骨脂乙素的优选剂量可以是为10μM-1mM。

其中，所述Tau蛋白病为由Tau蛋白异常聚集而引起的神经退行性疾病，如包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹和皮克病中的至少一种。

同样，基于上文所述补骨脂乙素具有抑制Tau蛋白异常聚集的功能和作用，本发明实施例具体的还提供了一种预防/治疗Tau蛋白病的药物。所述药物包括有效剂量的具有预防/治疗Tau蛋白病的活性成分。其中，所述活性成分包括补骨脂乙素，当然，所述活性成分还可以包括能够有效抑制抑制Tau蛋白异常聚集或其相关性能的其他活性成分，此处所述的“有效”是单独预防或治疗Tau蛋白病有临床效果的成分，也可以是与补骨脂乙素进行复合后能够提高补骨脂乙素预防或治疗Tau蛋白病有临床效果的成分。所述“有效剂量”是指能够预防或治疗Tau蛋白病的有效量，是指足以对个体显示益处或临床意义的补骨脂乙素的量。本领域技术人员将会理解，给药的实际量或剂量以及给药时程将取决于被预防或治疗的疾病的性质和严重性、被预防或治疗的受试者的年龄和一般状况以及给药方式等。如在一实施例中，所述补骨脂乙素的有效剂量可以是为10μM-1mM。

另外，所述预防/治疗Tau蛋白病的药物还可以进一步包括药学上可接受的补骨脂乙素的载体成分。所述药学上可接受的补骨脂乙素的载体成分可以根据所述Tau蛋白病药物给药方式制备的相应剂型的相应载体。如在一实施例中，所述载体包括但不仅仅是赋予所述药物剂型的辅料、用于保护所述补骨脂乙素稳定的化合物或组合物中的至少一种。其中，辅料可以是药物常规的液体剂型辅料、粉剂辅料、丸剂辅料、片剂辅料、胶囊辅料等。具体的所述辅料可以是环糊精，乙醇等有机溶剂中的至少一种等。在本发明实施例中只要是能够负载所述补骨脂乙素，或进一步有利于所述补骨脂乙素稳定和被吸收的符合医药要求的载体均在本发明实施例公开的范围。因此，所述预防/治疗Tau蛋白病的药物可以根据临床给药的需要进行选择相应的所述载体类型，从而呈现相应的剂型。同样，如上文所述的，所述Tau蛋白病为由Tau蛋白异常聚集而引起的神经退行性疾病，如包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹和皮克病中的至少一种。

因此，所述预防/治疗Tau蛋白病的药物由于含有上文的补骨脂乙素，由此，所述药物能够有效抑制Tau蛋白异常聚集的作用，具体如包括由基因突变引起或异常修饰所导致的Tau蛋白寡聚化或纤维化等，而且具有对Tau蛋白纤维化解聚作用，由此赋予所述预防/治疗的药物有效的预防/治疗Tau蛋白病作用。另外，由于补骨脂乙素为黄酮类化合物好，天然化合物，获取途径广，因此，其毒副作用小，安全，而且疗效好。

又一方面，基于上文所述补骨脂乙素的应用和含有所述补骨脂乙素的药物，一实施例中，本发明实施例提供了一种抑制Tau蛋白异常聚集的方法。所述方法包括将有效剂量的所述补骨脂乙素或上文所述预防/治疗Tau蛋白病的药物与Tau蛋白接触的步骤。通过所述方法能够有效抑制Tau蛋白的异常聚集，从而避免由于Tau蛋白的聚集形成不溶性双螺旋丝状Tau，也即是避免Tau蛋白纤维化，最终形成神经纤维缠结。

另外，上文所述补骨脂乙素可以按照现有常规方法制备获得。而且上文中的“预防/治疗”、“预防/缓解”中的“/”表示的和与或的关系，如“预防/治疗”表示的是预防和/或治疗。

现结合具体实例，对补骨脂乙素用于抑制Tau蛋白异常聚集应用进行进一步详细说明。

如上文所述的，由于TauK18是由Tau蛋白上244-372位的氨基酸所组成的蛋白片段，该序列是Tau蛋白与微管蛋白结合的区域，同时也是Tau蛋白聚集的起始和核心部位。有实验证明TauK18蛋白既具备与Tau蛋白相同的生理功能，其聚集形成的纤维也与Tau蛋白纤维高度类似。因此，下文以TauK18为代表设计研究Tau蛋白模型，以验证补骨脂乙素抑制Tau蛋白的异常聚集的作用。

下述各实施例中实验原料以及相关试剂：

主要实验仪器：全波长多功能酶标仪(美国，Biotek)、电子天平(德国，Sartorius)，移液器(德国，Eppendorf)，酸度计(美国，Mettler Toledo)。

主要实验材料：TauK18蛋白(深圳大学化学生物学实验室表达纯化)，补骨脂乙素(美国，Med Chem Express)，硫磺素T(上海源叶生物科技有限公司)，肝素钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，DTT(生工生物工程股份有限公司)，Tris碱(北京索莱宝科技有限公司)，DMSO(美国，Sigma-Aldrich)。

实施例1：不同浓度的补骨脂乙素对TauK18蛋白纤维化的抑制作用。

由于肝素钠诱导TauK18蛋白使其发生自身聚集形成纤维。为了模拟脑中Tau蛋白异常聚集形成神经纤维缠结，本实施例中，TauK18蛋白通过肝素钠诱导异常聚集形成神经纤维缠结。硫黄素T(ThT)可以和聚集后的纤维丝中β-片层相互作用，从而产生荧光，其荧光强度与纤维量的多少呈正相关性，可用于蛋白纤维量的定量分析。

方法：获取纯化的TauK18蛋白冻干品，精密称量，用Tris-HCl Buffer(pH 7.4)溶解，配制成0.56mg/mL左右的蛋白母液，再用BCA定量，记录准确浓度。精密称量补骨脂乙素，用DMSO配制成高浓度药物母液(10mM)，再依次用DMSO稀释成表2中8种浓度。然后，按照表2中实验设计，将其余相应试剂加入96孔黑色板中，每种浓度设置3个复孔。将样品放进酶标仪(Biotek SynergyH1)中连续孵育，定时跟踪监测各孔中样品对应的动态荧光值。导出数据，绘制动力学反应曲线。其中，所述酶标仪关键参数按照表1所示参数进行设置。

进一步将补骨脂乙素的浓度分别设定0μM、1μM、10μM、50μM的浓度组按照本实施例1上述的方法将各浓度组样品放进酶标仪(Biotek SynergyH1)中连续孵育，定时跟踪监测0μM、1μM、10μM、50μM的浓度组中样品对应的动态荧光值。

结果：根据测得动态荧光值相关数据绘制的反应曲线如图1所示。

表1酶标仪关键参数设置

表2不同浓度补骨脂乙素对肝素钠诱导TauK18蛋白纤维化实验分组

由图1可知，而且随着时间的推移，荧光吸收曲线强度逐渐升高，至大约14小时，达到最大值，这意味着TauK18的聚集数量逐渐增多，并达到最大值，随后基本保持平稳。并进一步结合浓度梯度组(1μM、10μM、50μM)的试验测得动态荧光值得知，随着补骨脂乙素药物浓度的逐渐增大，其荧光吸收最大值逐渐减小，说明当药物浓度升高时，其抑制作用越来越明显。由此，可知，不同浓度的补骨脂乙素加入后，均可降低ThT荧光值，说明对抑制TauK18纤维化均有效果。由图1和浓度梯度组(1μM、10μM、50μM)的试验结果可知，补骨脂乙素对TauK18蛋白的聚集有抑制作用，并且该抑制效果与补骨脂乙素的剂量呈明显的浓度相关性，并在较低浓度下，其抑制作用已经很明显。在对荧光实验数据进一步统计后，求得补骨脂乙素抑制TauK18纤维化的IC₅₀值为13.4μM。

实施例2：补骨脂乙素抑制TauK18蛋白纤维化的透射电镜实验

方法：利用透射电镜(TEM)可以直观观察到不同浓度的补骨脂乙素处理TauK18聚集纤维化情况，作为ThT荧光实验的有力佐证。从实施例1的ThT实验中，分别收集DMSO对照组、低浓度补骨脂乙素组(1μM)、中浓度补骨脂乙素组(10μM)和高浓度补骨脂乙素组(50μM)的样品各5μL，稀释后滴到的铜网上，沉降0.5小时，然后用滤纸吸去多余的样品，再分别滴上5μL的3％醋酸双氧铀，静置2分钟，再用滤纸吸去多余的醋酸双氧铀。放置于透射电镜(NIPPON TEKNO，JEM-1230)中，在100kV的加速电压下进行观察，拍照并保存图像。

结果：透射电镜照片如图2所示，其中，图2-A为添加DMSO对照组，其电镜观察到密集的TauK18蛋白纤维，说明DMSO作为溶解补骨脂乙素的溶剂，等体积添加后并不会造成蛋白纤维的溶解，而且TauK18形成均匀的细长纤维丝，纤维密集程度较高。根据图2-B至图2-D可知，随着补骨脂乙素药物浓度的增加，其电镜图片中呈现的纤维形态则表现出短而杂乱的形貌，所加药物浓度越高，TauK18所形成的纤维细丝便越短、越零散。说明高浓度补骨脂乙素阻碍纤维形成的效果明显，并且药效发挥与其浓度具有良好的依赖性关系。

实施例3：补骨脂乙素对TauK18蛋白纤维的解聚作用

本实施例3进一步验证补骨脂乙素对TauK18纤维具有解聚作用。

方法：向已经形成纤维的反应体系中加入不同浓度的补骨脂乙素，探索补骨脂乙素对TauK18纤维的解聚效果。纤维化反应第19小时左右，荧光强度达到最大值，TauK18纤维化的程度基本不变。具体的是按照实施例1中前期ThT荧光实验的构建方法(表2)，当观测到荧光强度几乎维持不变后，暂停酶标仪的检测，各个体系中分别添加5μL不同浓度的补骨脂乙素，等体积的DMSO作为对照，继续放进酶标仪中37℃恒温孵育17小时，定时跟踪监测各孔中样品对应的荧光值变化。其中，由于补骨脂乙素是溶解在DMSO中，因此选择DMSO作为对照组，有报道称DMSO对TauK18蛋白纤维化的过程起促进作用，所以DMSO不会干扰补骨脂乙素的药效评判。

结果：测得结果如图3所示，其中，DMSO对照组的荧光强度未降低，而加入药物后反应体系中ThT荧光值降低，说明补骨脂乙素对TauK18蛋白纤维有解聚功能。

实施例4：补骨脂乙素对解聚TauK18蛋白纤维的透射电镜实验

方法：利用透射电镜(TEM)可以直观观察到不同浓度的补骨脂乙素对TauK18蛋白纤维的解聚情况，作为ThT荧光实验的有力佐证。从实施例3的ThT实验中，分别收集DMSO对照组、低浓度补骨脂乙素组(1μM)、中浓度补骨脂乙素组(10μM、30μM)和高浓度补骨脂乙素组(50μM)的样品各5μL，稀释后滴到的铜网上，沉降0.5小时，然后用滤纸吸去多余的样品，再分别滴上5μL的3％醋酸双氧铀，静置2分钟，再用滤纸吸去多余的醋酸双氧铀。放置于透射电镜(NIPPON TEKNO，JEM-1230)中，在100kV的加速电压下进行观察，拍照并保存图像。

结果：透射电镜照片如图4所示，其中，图4-A所示DMSO对照组的电镜观察到密集的TauK18蛋白纤维，说明DMSO作为溶解补骨脂乙素的溶剂，添加后并不会造成蛋白纤维的溶解。TauK18形成均匀的细长纤维丝，纤维密集程度较高。根据图4-B至图4-E可知，随着药物浓度的增加，其电镜图片中呈现的纤维形态则表现出短而杂乱的形貌，所加药物浓度越高，TauK18所形成的纤维细丝便越短、越零散。说明高浓度补骨脂乙素打断纤维的效果明显，并且药效发挥与其浓度具有良好的依赖性关系。

以上所述的实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.补骨脂乙素作为Tau蛋白异常聚集的抑制剂的应用。

2.根据权利要求1的应用，其特征在于：所述Tau蛋白异常聚集包括由基因突变引起或异常修饰所导致的Tau蛋白寡聚化或纤维化。

3.补骨脂乙素在制备预防/治疗Tau蛋白病的药物中的应用，或预防/缓解Tau蛋白病的功能食品或保健品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述Tau蛋白病包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹和皮克病中的至少一种。

5.一种预防/治疗Tau蛋白病的药物，其特征在于：包括有效剂量的补骨脂乙素。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于：：所述补骨脂乙素的所述有效剂量为10μM-1mM。

7.根据权利要求5或6所述的药物，其特征在于：还包括药学上可接受的所述补骨脂乙素的载体。

8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于：所述载体包括赋予所述药物剂型的辅料、用于保护所述补骨脂乙素稳定的化合物或组合物中的至少一种。

9.一种抑制Tau蛋白异常聚集的方法，其特征在于：包括将有效剂量的补骨脂乙素或权利要求5-8任一项所述的药物与Tau蛋白接触的步骤。