CN109678857A - 一种鎓氯化物以及在神经退行性疾病药物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的鎓氯化物以乙酰胺为原料、通过人工化学合成手段合成的吲哚类化合物，属于β‑咔啉类生物碱，是由五个环组成的大平面结构分子，可显著抑制AChE，且为非竞争性抑制AChE，并可提高ChAT水平，可能多靶点协同对抗神经退行性疾病；并能够影响某些重要炎症因子的水平，有效地抑制神经炎症。本鎓氯化物在治疗神经退行性疾病中具有良好疗效。

Description

一种鎓氯化物以及在神经退行性疾病药物的应用
技术领域
本发明涉及神经退行性疾病药物技术领域，尤其涉及一种鎓氯化物以及在神经退行性疾病药物的应用。
背景技术
神经退行性疾病包括阿兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、肌肉萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张症、牛海绵状脑病、克雅二氏病、亨廷顿氏病、小脑萎缩症、多发性硬化症、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症等多种疾病，是一种大脑和脊髓的神经元逐步丧失的疾病状态，由神经元或其髓鞘的丧失所致。正常情况下，大脑和脊髓的神经元是无法再生的，一旦对神经元造成过度的损害可能是不可恢复的。因此，神经退行性疾病会随着时间的推移而恶化，并导致神经系统的功能障碍，造成患者的语言、学习、记忆等认识能力受损。
但是，现在神经退行性疾病仍缺乏特异性的临床防治措施，已成为严重危害老年人身心健康和生活质量的一类重要疾病。尽管多数神经退行性疾病的病理机制尚未完全阐明，但众多的证据表明乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)异常会引起AD等神经系统疾病。ACh广泛分布于神经系统，是介导学习和记忆最主要的神经递质，可增强记忆、促进神经传导。ACh代谢紊乱直接诱导学习和记忆能力下降等认知障碍。胆碱乙酰转移酶(ChAT)能够将乙酰辅酶A的一个乙酰基转移到胆碱从而形成乙酰胆碱，在ACh的合成过程中起到重要作用。而乙酰胆碱酯酶是存在于神经接头和胆碱能神经突触的一种具有羧肽酶和氨肽酶活性的酶，能特异水解乙酰胆碱，生成乙酸和胆碱，从而阻断乙酰胆碱神经递质的传递。AD是一种中枢神经变行性疾病，由于胆碱能系统活性下降，神经末梢乙酰胆碱的合成、储存、释放减少或分解增加，均会导致患者出现认知功能严重障碍。
此外，神经炎症的发生和发展也是造成神经元损伤、导致神经退行性疾病产生的重要因素。虽然在正常情况下，神经炎症可以消除有害的刺激，是对神经元损伤时的必要和保护性生理反应。然而，长期过度的神经炎症反应则超过了生理控制的界限，导致神经元的损伤甚至不可逆地坏死。研究表明，某些炎症因子如IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α和IL-10等在神经炎症的发生和发展过程中起到重要的作用。另外，还有研究表明β-淀粉样蛋白(Aβ)是AD的主要毒性蛋白。Aβ可聚集为有神经毒性的Aβ寡聚体和纤维，诱导细胞内tau蛋白磷酸化，导致神经元缠结，进而诱导神经元凋亡，产生认知障碍。因此抑制Aβ组装，降低Aβ神经毒性也是对抗AD的重要途径。
随着研究的深入，AD更多的发病机理被阐明，针对不同的作用机制，临床上主要使用AChE抑制剂，如多奈哌齐(Donepezil)、加兰他敏(galantamine)等治疗早期AD。如AChE抑制剂可通过抑制AChE的活性，增加患者突触间ACh水平，延长并增加兴奋ACh受体的作用达到治疗AD的目的。遗憾的是，这些药物仅仅缓解AD症状，对已造成的脑神经损伤不能修复，而且无有效预防和控制病情恶化的表现，同时这些药物还伴有头晕、恶心、呕吐等副作用，严重造成病人的不适。因此，开发新的能够对抗AD等神经退行性疾病的药物是全世界共同的目标。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有良好疗效，用于治疗神经退行性疾病的化合物。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
一种鎓氯化物，其特征在于：结构式为:
包含鎓氯化物的组合物，所述组合物的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、口服液和混悬剂。
鎓氯化物在制备治疗和/或预防神经退行性疾病药物中的应用。
鎓氯化物在制备治疗和/或预防神经退行性疾病保健品中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于证明了：本鎓氯化物可显著抑制AChE，且为非竞争性抑制AChE，并可提高ChAT水平，可能多靶点协同对抗神经退行性疾病；并能够影响某些重要炎症因子的水平，有效地抑制神经炎症。本鎓氯化物在治疗神经退行性疾病中具有良好疗效。
附图说明
图1为本发明实施例1的新物体识别实验训练期各组小鼠的识别指数。
图2为本发明实施例1的新物体识别实验探索期各组小鼠的识别指数。
图3为本发明实施例1的水迷宫实验各组小鼠的平台穿越次数。
图4为本发明实施例1的水迷宫实验各组小鼠的目标象限探索时间。
图5为本发明实施例2的体外AChE活力实验的抑制效率。
图6为本发明实施例2的体外AChE活力实验中鎓氯化物对AChE的抑制作用的Lineweaver-Burk双倒数图。
图7为本发明实施例2的体外AChE活力实验中双倒数直线的斜率对鎓氯化物浓度的关系图。
图8为本发明实施例2的AD模型小鼠海马组织AChE的抑制效率。
图9为本发明实施例3的ELISA实验的AD模型小鼠海马组织IL-1β水平。
图10为本发明实施例3的ELISA实验的AD模型小鼠海马组织IL-6水平。
图11为本发明实施例3的ELISA实验的AD模型小鼠海马组织IL-10水平。
图12为本发明实施例3的ELISA实验的AD模型小鼠海马组织TNF-α水平。
图13为本发明实施例3的蛋白质印记实验中AD模型小鼠海马组织IL-17水平。
图14为本发明实施例4的蛋白质印记实验中AD模型小鼠海马组织ChAT水平。
图15为本发明实施例5的Aβ纤维聚集实验的ThT荧光强度。
图16为本发明实施例6的点印记实验的点印记图。
图17为本发明实施例6的点印记实验的寡聚体水平。
图18为本发明实施例6的透射电镜实验的寡聚糖形态图。
图19为本发明实施例7的MTT实验的细胞存活率。
图20为本发明实施例7的FDA/PI双染色实验的细胞染色图。
图21为本发明实施例7的FDA/PI双染色实验的细胞活性。
具体实施方式
本发明的鎓氯化物以乙酰胺为原料、通过人工化学合成手段合成的吲哚类化合物，属于β-咔啉类生物碱，是由五个环组成的大平面结构分子，其化学式为：9-甲基-13-氧代-12,13-二氢吡啶并[1,2-a:3,4-b’]二吲哚-5-鎓氯化物，其结构式为:本鎓氯化物对于神经退行性疾病具有良好的治疗效果。为了更好地表明本鎓氯化物的疗效，下面通过实施例及附图进行详细描述，其中实施例中的鎓氯化物为本申请人人工制备合成。
实施例1
1、鎓氯化物对记忆能力改善效果
1.1实验材料
鎓氯化物溶于二甲亚砜(DMSO，购自国药集团化学试剂有限公司)，浓度分别为10μmol/L、33μmol/L。东莨菪碱(Scopolamine，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶于生理盐水(购自浙江都帮药业有限公司)，浓度为0.5mg/L(因Scopolamine与ACh化学结构相似，可与ACh竞争突触后膜ACh受体，导致认知障碍，故常用于AD模型的建立)。多奈哌齐(Donapezil)溶于生理盐水(购自浙江都帮药业有限公司)，浓度为0.5mg/L。
1.2实验分组
选取大小、体重相近的小鼠40只，随机分为5组，每组为8只小鼠，并按照表1所示的方式分组：
表1实验分组方案
鎓氯化物注射方法：
通过腹膜内(i.p.)施用戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉小鼠，然后将其置于脑立体定位注射仪中中。在使用碘酒消毒后用眼科剪剪开小鼠头皮，用棉签蘸取少量2％双氧水涂抹灼烧小鼠脑膜暴露前囟。之后使用以下坐标将鎓氯化物注射到小鼠的双侧海马区域(各1μL)：AP，距前囟1.7mm；ML，距离中线1.8mm；DV，距离软脑膜2.0mm。每次注射五分钟，注射完毕后等待五分钟拔出针头，使得药物被充分吸收。两侧海马均注射完毕后用带针缝合线缝合，并用碘酒消毒手术部位。
1.3新物体识别实验
此实验一天完成，分为训练期和探索期两个部分，两个部分之间时间间隔为4-6小时。训练期期间，先在暗环境下将两个相同的物体置于敞口实验箱内的对角并记录5分钟内各组小鼠探索两个物体的时间，计算识别指数。探索期期间，将其中一个物体换成形状不同的新物体并记录5分钟内各组小鼠探索新旧物体的时间，计算识别指数。结果表2所示。
1.4水迷宫实验
此实验共计四天完成，实验过程中要保持水温在20-25℃之间。第一天使平台露出水面以上0.5-1cm，让各组小鼠能够轻易找到平台，感受平台的方位。此后两天使平台浸没水下0.5-1cm，每次将小鼠分别从一、二、三、四象限将小鼠放入水迷宫中使其寻找平台，视为一组。每天进行两组实验，即训练小鼠8次，不断强化小鼠对平台位置的记忆力并通过软件记录小鼠的运动轨迹及到达平台的时间。最后一天撤去平台，检测小鼠在平台周边探测的时间及穿越平台所在区域的次数，其结果如表3-4所示。
1.5实验结果
表2新物体识别实验中各组小鼠在训练期和探索期的识别指数
根据表2的数据，将各组小鼠的识别指数按照训练期和探索期分别求出平均值，结果如图1-2所示。由图1可知，新物体识别实验中，训练期各组小鼠识别指数未出现显著差异，表明实验环境、所用物体等因素不会影响小鼠探索情况。由图2可知，探索期期间AD模型组与空白组之间的识别指数相比较出现显著差异(p<0.01)，表明AD小鼠模型建立成功。此外低浓度实验组的识别指数相比于AD模型组略高，高浓度实验组的探索时间接近阳性对照组，并且高浓度实验组与AD模型组相比出现显著差异(p<0.05)。
表3水迷宫实验中各组小鼠的平台穿越次数
表4水迷宫实验中各组小鼠的目标象限探索时间
根据表3和表4的数据，将各组小鼠的平台穿越次数和目标象限探索时间分别求出平均值，结果如图3-4所示。
由图3和图4可知，AD模型组的目标象限探索时间及穿越平台位置次数与空白组比较均具有显著差异(p<0.05)，表明AD小鼠模型建立成功。此外低浓度实验组的数据均略高于AD模型组，高浓度实验组的数据接近阳性对照组，并且高浓度实验组与AD模型组相比出现显著差异(p<0.05)。
由上述实验结果可知，鎓氯化物组能够有效改善scopolamine诱导的小鼠认知和记忆障碍，并且其治疗效果和鎓氯化物的药物浓度有关，其优选的鎓氯化物浓度为33μmol/L。
实施例2
2、鎓氯化物对乙酰胆碱酯酶(AChE)的抑制作用
2.1实验材料
鎓氯化物。碘代乙酰硫代胆碱(AChI，购自sigma公司)溶于100mmol/L Na2HPO4溶液，浓度为20mmol/L。二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB，购自Life Science公司)。乙丙嗪(BuChE抑制剂，购自sigma公司)溶于二甲基亚砜(DMSO，购自国药集团化学试剂有限公司)，浓度为20mmol/L。
2.2实验方法
2.2.1脑匀浆液制备
取若干正常小鼠，斩首后取脑，在冰上分离取得大脑皮层后用液氮干燥。皮层称重后，加入10倍的裂解缓冲液(HEPES10mmol/L，Triton X-100 0.5％，EDTA 5mmol/L，EGTA5mmol/L，NaCl 1000mmol/L，调节pH＝7.5)，匀浆直至破坏停止。匀浆液超声处理30秒后，然后按照3000rpm、4℃离心15分钟，取上清液待测。
2.2.2体外AChE活力测定
体外AChE活力测定按照Ellan等报道的方法稍加改变。
在84.5μl 100mmol/LNa2HPO4溶液(pH＝7.5)中加入5μl脑匀浆液(酶)、5μlAChI、5μl待测物和0.5μl乙丙嗪，混匀后在在37℃孵育30min后加入75μl 20mmol/L DTNB，应用荧光光度计测定412nm处的吸收值，结果如图5所示。待测物包括鎓氯化物和Donepezil，其中鎓氯化物的终浓度为50nmol/L到500μmol/L，Donepezil10μmol/L。
2.2.3 AD模型小鼠海马组织AChE活力测定
按照上述体外AChE活力测定方法稍加改变。
AD模型小鼠脑组织AChE活力测定按照体外AChE活力测定方法稍加改变。两者不同之处在于：第一，体外AChE活力测定中使用的是正常小鼠的脑匀浆液，而AD模型小鼠海马组织AChE活力测定中使用的是实施例1中各组小鼠制成的脑匀浆液；第二，体外AChE活力测定中需脑匀浆液和待测物各5μL，而AD模型小鼠脑组织AChE活力测定中加入的脑匀浆液为10μL，待测物不需加入。应用荧光光度计测定每组小鼠脑组织在412nm处的吸收值，每次测量三次，结果如表5所示。
2.3实验结果
表5 AD模型小鼠脑组织AChE活性
根据表5的数据，将各组小鼠的AChE活性求出平均值，结果如图8所示。
由图5可知，鎓氯化物(0.05-150μM)可剂量依赖性抑制AChE，其半抑制剂量(IC50)为0.95μM。该结果表示鎓氯化物可直接抑制AChE。而且该酶促反应遵循米氏(Michaelis-Menten)动力学方程，并进行Lineweaver-Burk双倒数作图，并以双倒数直线的斜率对鎓氯化物浓度作图，结果如图6-7所示，从而得到抑制剂常数Ki＝2.65μM。
由图8可知，AD模型组与空白组之间的AChE活性相比较出现显著差异(p<0.01)，进一步表明AD小鼠模型建立成功。此外低浓度实验组的AChE活性相比于AD模型组略高，高浓度实验组的AChE活性接近阳性对照组，并且高浓度实验组与AD模型组相比出现显著差异(p<0.05)。
综上所述，鎓氯化物可剂量依赖性抑制AChE，其半抑制剂量(IC50)为0.95μM，并可非竞争性抑制AChE，并且能够对抗AD小鼠模型脑内AChE活性的升高，为新型对抗神经退行性疾病药物的开发提供理论基础。
实施例3
3、鎓氯化物对神经炎症的抑制作用
3.1实验材料
IL-1β(白细胞介素-1β)酶联免疫分析试剂盒、IL-6酶联免疫分析试剂盒、TNF-α(肿瘤坏死因子α)酶联免疫分析试剂盒、IL-10酶联免疫分析试剂盒(以上试剂盒均购自江苏酶标生物有限公司)；BCA工作液(购自碧云天生物科技有限公司，按A液体积：B液体积＝50：1配置)；RIPA-PIC-磷酸酶抑制剂裂解液(按RIPA体积：PIC体积：磷酸酶抑制剂体积＝97：2：1配置)；1.5M Tris-HCL缓冲液(PH＝8.8、PH＝6.8，购自索莱宝生物科技有限公司)；30％PAGE-Pre-Solution 29：1(购自索莱宝生物科技有限公司)；10％SDS溶液(购自索莱宝生物科技有限公司)；TEMED；anti-IL-17抗体、HRP标记山羊抗鼠二抗(购自Santa CruzBiotechnology)、Bio-rad电泳仪、Bio-rad电泳槽(购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司)。
3.2实验方法
3.2.1脑匀浆制备
同2.2.1中脑匀浆制备方法，将实施例1中各组小鼠制备得到不同的待测样品。
3.2.2ELISA实验测定炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α)水平
按照试剂盒说明书进行操作：在酶标板包被板上分别设置空白孔(不加样品及酶标试剂，其余步骤操作相同)、标准孔(加入50μL 120U/L、60U/L、30U/L、15U/L、7.5U/L的标准品)和待测样品孔(加入40μL标准品稀释液和10μL待测样品，每种待测样品设置8孔)，然后在37℃温育30分钟。之后洗板5次，各孔均加入酶标试剂50μL(空白孔除外)，在37℃反应30分钟。然后洗板5次，加入显色液A、B，在37℃显色10分钟。最后各孔加入50μL加入终止液，15分钟内450nm波长读取OD值。结果如表6-9所示。
3.2.3蛋白质印迹实验测定炎症因子(IL-17)水平
蛋白样本制备：取实施例1中各组小鼠的脑组织，每1mg脑组织加入10ul RIPA-PIC-磷酸酶抑制剂裂解液后室温静置1h后，在13200rpm、4℃低温离心30min。取适量上清液，按4：1的量加入5倍缓冲液。混匀后，在99℃水浴加热5-10min使蛋白变性，完成蛋白样本制备。
在琼脂糖凝胶中加入蛋白样品后，先后调节电压至60V电泳35分钟、调节电压至80V电泳100分钟，使不同分子量的蛋白分开。之后将凝胶取出覆盖上醋酸纤维素薄膜，100V转膜90分钟，使琼脂糖凝胶内的蛋白转移到醋酸纤维素薄膜上。取出醋酸纤维素薄膜后加入5％脱脂奶粉溶液，室温封闭1小时，之后加入一抗(用5％BSA配置，浓度1：1000)孵育过夜后，用1×TBST清洗4次，每次15分钟。在加入二抗孵育1小时后用1×TBST清洗4次，每次15分钟。最后将条带加上显色液并放入曝光机中曝光，测量三次。结果如表10所示。
3.3实验结果
表6 AD模型小鼠脑内IL-1β水平
表7 AD模型小鼠脑内IL-6水平
表8 AD模型小鼠脑内IL-10水平
表9 AD模型小鼠脑内TNF-α水平
表10 AD模型小鼠脑内IL-17水平
根据表6-10的数据，将求出相应的平均值，结果如图9-13所示。
由图9-13可知，AD模型组的数据与相应的空白组比较均具有显著差异(p<0.05)，进一步表明AD小鼠模型建立成功。此外低浓度实验组和高浓度实验组的数据相较于相应的AD模型组，均出现显著差异(p<0.05)，且高浓度实验组的数据都接近相应的阳性对照组。
综上所述，鎓氯化物能够降低AD小鼠模型脑内IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-17水平并增高IL-10水平，从而改善AD。并且鎓氯化物的治疗效果和其药物浓度有关，其优选的鎓氯化物浓度为33μmol/L。
实施例4
4、鎓氯化物提高AD模型小鼠海马内胆碱乙酰转移酶(ChAT)水平
4.1实验材料
BCA工作液(购自碧云天生物科技有限公司，按A液体积：B液体积＝50：1配置)；RIPA-PIC-磷酸酶抑制剂裂解液(按RIPA体积：PIC体积：磷酸酶抑制剂体积＝97：2：1配置)；1.5M Tris-HCL缓冲液(PH＝8.8、PH＝6.8，购自索莱宝生物科技有限公司)；30％PAGE-Pre-Solution 29：1(购自索莱宝生物科技有限公司)；10％SDS溶液(购自索莱宝生物科技有限公司)；TEMED；anti-ChAT抗体、HRP标记山羊抗兔二抗(购自Santa Cruz Biotechnology)；Bio-rad电泳仪、Bio-rad电泳槽(购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司)。
4.2实验方法：
同实施例3 3.2.3的“蛋白质印迹实验”，结果如表11所示。
4.3实验结果
表11 AD模型小鼠脑内ChAT水平
根据表11的数据，将各组小鼠脑内ChAT水平求出平均值，结果如图14所示。
由图14可知，AD模型组的ChAT水平与空白组比较均具有显著差异(p<0.05)，表明AD小鼠模型建立成功。此外低浓度实验组的数据均略低于AD模型组，高浓度实验组的数据接近阳性对照组，并且高浓度实验组与AD模型组相比出现显著差异(p<0.05)。因此，鎓氯化物能够有效对抗AD模型小鼠脑内ChAT水平降低，并且在浓度为33μmol/L时治疗效果最优。
实施例5
5、鎓氯化物抑制Aβ纤维聚集
5.1实验材料
合成Aβ粉末(购于吉尔生化上海有限公司)，硫磺素-T(Thioflavin-T)，六氟异丙醇(HFIP)(购自HFIP,Sigma,St Louis,MO,USA)，蒸馏水(Milli-Q water)，NaOH，PBS溶液；氮吹仪，恒温箱，荧光酶标仪。
5.2实验方法
将合成Aβ粉末溶于HPIF中形成Aβ单体，用蒸馏水稀释，再用N2完全蒸干溶液中的HFIP和水，然后加入NaOH溶液，使Aβ溶液的终浓度达到1mM。之后取2μL上述Aβ溶液和10μL不同浓度的鎓氯化物加入到187μL PBS溶液中，再加入5μL ThT并使其终浓度为5μM。将混合体系放入湿盒中，在37℃下避光孵育6天，再用荧光酶标仪在激发光440nm和发射光485nm下检测荧光强度。
采用上述实验方法依次测定0.3μM、1μM、3μM、10μM和30μM的鎓氯化物对Aβ纤维的抑制率，并以3μM和10μM的姜黄素为阳性对照，以不加入鎓氯化物为阴性对照，结果如图15所示。
5.3实验结果
由图15可知，加入鎓氯化物的组别纤维水平显著低于阴性对照组(p<0.01)，并且鎓氯化物能够浓度依赖性地抑制Aβ纤维的形成。而且在相同浓度下，鎓氯化物的抑制效果比姜黄素更好。
实施例6
6、鎓氯化物抑制Aβ寡聚体形成
6.1实验材料
合成Aβ粉末，HFIP，蒸馏水，BSA，Aβanti-oligomer A11抗体(购自Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA,)，anti-Aβ1-17 6E10抗体(购自Sigma公司)，TBST，HRP标记山羊抗兔二抗(购自Santa Cruz Biotechnology)，化学发光显色液；硝酸纤维膜，透射电镜。
6.2实验方法
6.2.1点印记实验
将合成Aβ粉末溶解于HFIP中，取100μL上述溶液，加入900μL的蒸馏水，氮吹至溶液约为750μL，此时的Aβ单体溶液浓度约为50μM。将Aβ溶液和不同浓度的鎓氯化物混合震荡形成寡聚体，并使鎓氯化物终浓度分别为10μM，3μM和1μM，同时Aβ浓度为10μM。接着室温下避光并持续震荡2天，然后在4℃，14000g下离心15分钟，收集沉淀物待测。沉淀物主要含有Aβ寡聚体。
分别取2μL加入了不同浓度(1μM、3μM和10μM)的鎓氯化物的Aβ寡聚体以及Aβ寡聚体空白对照，在硝酸纤维膜上依次点样，自然风干，结果如图16所示。用5％BSA溶液封闭30分钟，回收封闭液，再用抗寡聚物A11抗体或抗Aβ1-17单体6E10抗体孵育1小时。孵育结束后，回收抗体，用1％TBST溶液清洗条带3次，再用HRP标记山羊抗兔二抗孵育一小时，回收二抗，用1％TBST清洗条带3次，用化学发光显色液涂在条带表面，用曝光仪器曝光，所得数据经过Image J灰度统计分析，结果如图17所示。
6.2.2透射电镜实验(TEM)
将2μL要观察的鎓氯化物和Aβ寡聚体混合样品和Aβ寡聚体样品分别放置在碳涂层网格上，用醋酸双氧铀染色，用干净的纸吸干多余的染色液，然后放在透射电镜下观察，结果如图18所示。
6.3实验结果
如图16-17所示，加入10μM和3μM鎓氯化物的Aβ寡聚体水平显著降低(p<0.01)。
由图18所示，在透射电镜观察下，寡聚体形态较为规则，而加入10μM的鎓氯化物的寡聚体形态则为丝状结构。因此可知，鎓氯化物能够改变寡聚体形态。
实施例7
7、鎓氯化物在SH-SY5Y细胞中降低Aβ的神经毒性
7.1实验材料
DMEM，盘尼西林，FBS，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，SDS；恒温培养箱，酶标仪，荧光显微镜。
7.2实验方法
7.2.1 MTT实验
SH-SY5Y细胞培养于高葡萄糖培养基(DMEM)中，其中包含1％的盘尼西林(100U/mL)和10％的FBS，并且于5％CO2中、37℃的恒温培养箱中培养，培养基每两天更换一次。在进行实验之前，将培养基换成含有1％FBS的DMEM。
将5μL的Aβ寡聚体和加入了不同浓度(0.1μM、0.01μM和0.001μM)的鎓氯化物的Aβ寡聚体加入96孔板中，在37℃下培养24小时之后加入10μLMTT。培养4小时之后，加入100μLSDS，在16小时之后，在570和655波长下测定样品的吸光值。结果如图19所示。
7.2.2 FDA/PI双染色实验
FDA可以染活细胞，PI能够染色死细胞。将加入了100nM鎓氯化物和Aβ混合物以及Aβ寡聚体共同加入于6孔板中，用PBS配置含有5μg/mL的PI和10μg/mL的FDA的溶液，用该溶液对加药处理后的细胞染色15分钟，然后在紫外光显微镜下进行观察，并选取同一区域对活细胞和死细胞进行数量统计。计算公式为：细胞存活率＝被FDA染色的活细胞/被FDA染色的活细胞+被PI染色的死细胞。结果如图20-21所示。
7.3实验结果
如图19可知，1-100nM氯化物能够显著性并且浓度依赖地降低细胞中Aβ寡聚体毒性(p<0.01)，其中100nM降低Aβ毒性效果最好。
如图20-21所示，加入100n鎓氯化物和Aβ混合物的细胞存活率较高，且统计结果和MTT结果相近。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种鎓氯化物，其特征在于：结构式为:
2.如权利要求1所述的一种鎓氯化物，其特征在于：浓度为33μmol/L。
3.包含如权利要求1-2中任一权利要求的鎓氯化物的组合物，其特证在于：所述组合物的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、口服液和混悬剂。
4.根据权利要求1-2中任一权利要求的鎓氯化物在制备治疗和/或预防神经退行性疾病药物中的应用。
5.根据权利要求1-2中任一权利要求的鎓氯化物在制备治疗和/或预防神经退行性疾病保健品中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110627791A (zh) * 2019-10-17 2019-12-31 宁波大学 一种fascaplysin衍生物及制备方法
CN112245430A (zh) * 2020-10-26 2021-01-22 宁波大学 9-甲基法斯卡普莱森在制备治疗或预防缺血性脑卒中的药物中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003007925A1 (en) * 2001-07-19 2003-01-30 Isis Innovation Limited Therapeutic strategies for prevention and treatment of alzheimer's disease
WO2016063303A1 (en) * 2014-10-21 2016-04-28 Council Of Scientific & Industrial Research N-substituted beta-carbolinium compounds as potent p-glycoprotein inducers
CN106588917A (zh) * 2016-11-25 2017-04-26 西北农林科技大学 咔啉类化合物及其合成方法与抗乙酰胆碱酯酶活性

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003007925A1 (en) * 2001-07-19 2003-01-30 Isis Innovation Limited Therapeutic strategies for prevention and treatment of alzheimer's disease
WO2016063303A1 (en) * 2014-10-21 2016-04-28 Council Of Scientific & Industrial Research N-substituted beta-carbolinium compounds as potent p-glycoprotein inducers
CN106588917A (zh) * 2016-11-25 2017-04-26 西北农林科技大学 咔啉类化合物及其合成方法与抗乙酰胆碱酯酶活性

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SANDIP B. BHARATE ET AL.: "Total synthesis and anti-cholinesterase activity of marine-derived bis-indole alkaloid fascaplysin", 《MED. CHEM. COMMUN.》 *
SUDHAKAR MANDA ET AL.: "Discovery of a marine-derived bis-indole alkaloid fascaplysin, as a new class of potent P-glycoprotein inducer and establishment of its structure-activity relationship", 《EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》 *
党柱 等: "海洋天然活性产物Fascap lysin的研究进展", 《药学进展》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110627791A (zh) * 2019-10-17 2019-12-31 宁波大学 一种fascaplysin衍生物及制备方法
CN112245430A (zh) * 2020-10-26 2021-01-22 宁波大学 9-甲基法斯卡普莱森在制备治疗或预防缺血性脑卒中的药物中的应用
CN112245430B (zh) * 2020-10-26 2022-03-01 宁波大学 9-甲基法斯卡普莱森在制备治疗或预防缺血性脑卒中的药物中的应用

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Assignor: Ningbo University

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Denomination of invention: An onium bromide and its application in drugs for neurodegenerative diseases

Granted publication date: 20200814

License type: Common License

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