CN108078983B - 一种双吲哚类化合物在制备抗炎药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双吲哚类化合物（4ae）在制备抗炎药物方面的应用，该双吲哚类化合物的结构式如下所示：

Description

一种双吲哚类化合物在制备抗炎药物方面的应用

技术领域

本发明属于药学技术领域，具体涉及一种双吲哚类化合物在制备抗炎药物方面的应用。

背景技术

中国随着人口的老龄化发展、饮食结构的改变，脑血管疾病的发病率逐年升高，其中血管性痴呆患者显著增多。痴呆患者生活质量显著降低，家庭负担较大，社会保障体系无法全面覆盖该老年群体。与之相对，国内外至今对该疾病仍无有效的干预方法和治疗药物。

痴呆主要体现为认知障碍，主要包括：老年性痴呆（Alzheimer’s Disease，AD）和血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）。近年来研究认为：血管性危险因素均与VD和AD发病息息相关，因此，慢性脑缺血所致的血管性痴呆已成为评价抗痴呆药物的经典模型。

因AD的发病机制尚未能阐明，其治疗药物仍以乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂为主，代表药为盐酸多奈哌齐、重酒石酸卡巴拉汀等。而针对VD，临床治疗多使用扩张血管、增加脑血流量的药物，或者利用抗氧化剂或自由基清除剂改善缺血、缺氧所引起的病理损伤。相关代表药物有双氢麦角碱类、钙离子拮抗剂、烟酸类、维生素E、维生素C 以及银杏叶制剂等。然而目前上述药物的临床应用疗效非常有限，不能逆转其病理进程。

炎症在神经性疾病的重要性已得到了越来越多的关注（Nikolett Lénárt, DavidBrough, and Ádám Dénes. Inflammasomes link vascular disease withneuroinflammation and brain disorders. J Cereb Blood Flow Metab. 2016; 36(10): 1668–1685.）。研究表明炎症与脑血管疾病、痴呆等神经退行性疾病产生和进展密切相关。事实上，炎症反应是一把双刃剑：急性或较低水平的炎症反应有助于机体处理异常情况并促进愈合；但当炎症反应被长期维持在较高水平时，其对组织造将成严重损害。流行病学研究表明，AD及其他神经退行性疾病的大鼠海马中炎症反应的强度极高，提示必须使用足量、有效的抗炎药物才可以实现对神经系统的保护作用（McGeer PL1, McGeer EG.Inflammation and the degenerative diseases of aging. Ann N Y Acad Sci. 2004;1035:104-16.）。因此炎症因子及其相关受体是此类疾病的潜在治疗靶点，而高效的抗炎药物则可用于此类疾病的干预。

非甾体类抗炎药（NSAIDs）是临床上最常用的抗炎药物。然而使用NSAIDs可能导致广泛且多样的急性中枢神经系统毒性及副作用（in t' Veld BA, Ruitenberg A, HofmanA, Launer LJ, van Duijn CM, Stijnen T, Breteler MM, Stricker BH. Nonsteroidalantiinflammatory drugs and the risk of Alzheimer's disease. N Engl J Med.2001;345(21):1515-21.）。如，过量使用布洛芬可导致患者产生中枢神经系统效应如嗜睡、昏迷等；使用后还会引发多种神经后遗症，包括共济失调、眩晕、头晕、反复跌倒、眼球震颤、头痛、脑病、定向障碍及癫痫发作。其他NSAIDs也多具有无菌性脑膜炎这种重要的神经系统副作用。此外，经典NSAIDs药物阿司匹林其实用意义也受到了广泛质疑，因其对凝血有双重影响：一方面，药物可抑制血小板中血栓素的合成，从而抑制凝血；另一方面，药物又抑制了内皮细胞产生前列环素，导致血栓前状态的形成。此外，COX-2的选择性抑制尽管可以特异性抑制前列腺素的合成从而抑制炎症，却被发现也会导致血管并发症甚至脑卒中，这又与痴呆的治疗背道而驰。重要的是，尽管有研究提示长期使用NSAIDs，可以预防AD，但对VD无影响。而一些大型的、设计良好的临床研究却未能证实NSAIDs对AD的预防作用，甚至有人发现NSAIDs的使用与认知能力下降有关（Auriel E, Regev K, Korczyn AD. Nonsteroidalanti-inflammatory drugs exposure and the central nervous system. Handb ClinNeurol. 2014;119:577-84.）。另有研究表明，使用具有强抗炎作用的糖皮质激素可改善AD患者脑内的病理情况，但由于激素类药物的毒副作用及长期使用问题，迄今未有更多深入研究，且糖皮质激素用于预防或治疗VD尚未见报道（Beeri MS, Schmeidler J, LesserGT, Maroukian M, West R, Leung S, Wysocki M, Perl DP, Purohit DP, HaroutunianV. Corticosteroids, but not NSAIDs, are associated with less Alzheimerneuropathology. Neurobiol Aging. 2012;33(7):1258-64.）。

综上，由于使用已有抗炎药物对痴呆的防治进展有限，近年来国内研究开始关注使用具有抗炎作用的中药或天然产物对痴呆进行干预。研究表明：姜黄素等具有多靶点活性作用的天然产物对痴呆动物模型具有显著治疗作用，但其又因稳定性差、生物利用度低等问题在人体试验中收效甚微（饶志方，王婉钢，程振玲，王智，涂静. 姜黄素治疗老年痴呆研究困境及其对策. 中国药师, 2016 , 19 (8) :1566-1568）。其他一些中药制剂如银杏叶、灯盏花、刺五加等又因活性成分不清、作用机制不明、质量控制困难、毒副作用较大等原因均难以满足临床需要。因此，目前亟需针对此疾病研发出更为有效的药物。

炎症是痴呆的经典机制，但已有抗炎药对痴呆，尤其是血管性痴呆的治疗作用有限，毒副作用较多。因此开发具有高效抗炎作用的多靶点药物对血管性痴呆的临床治疗具有极为重大的意义。发明人所在课题组首次设计并合成了本申请所述的双吲哚类化合物4ae（You-Qing Wang, Zhong-Shu Wei, Chao-Qun Zhu, Yuan-Yuan Ren, Chunrui Wu.Solvent-controlled and selective synthesis of mono- and bis-indolyl productsin Brønsted acid catalyzed aza-Friedel–Crafts reactions of indoles withcyclic imines. Tetrahedron. 2016; 72(31):4643-4654.），本发明经体实验结果显示：其具有强效抗炎作用，且对VD大鼠脑组织保护作用明显，可显著改善VD大鼠的学习记忆能力、脑组织病理学变化、改善脑内炎症、氧化状态。加之其具有一定的抗胆碱酯酶作用，对其进行后续研发用于治疗痴呆意义重大。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种双吲哚类化合物在制备抗炎药物方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

双吲哚类化合物在制备抗炎药物方面的应用（即其可以治疗炎症相关疾病），该双吲哚类化合物的结构式如下所示：

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本发明提供了该双吲哚类化合物在抗炎方面的用途，说明该双吲哚类化合物单用或与其它物质合用可用于预防、治疗和研究与炎症及以炎症机制相关的疾病，例如痴呆。

进一步的，该双吲哚类化合物在制备抗氧化药物方面的应用。

本发明还提供了该双吲哚类化合物对痴呆的干预作用，该化合物可以用于预防、治疗或研究一种或多种类型的痴呆，也可用于痴呆患者的保健。进一步优选的，该双吲哚类化合物在制备防治血管性痴呆药物方面的应用。

模式动物斑马鱼在基因水平上87%与人类同源，适用于多种人类重大疾病治疗的药理学研究，因此其药物试验有较高的参考意义。本申请以血管荧光标记的转基因斑马鱼为模型动物，证实了本发明所述双吲哚类化合物4ae具有显著抑制斑马鱼炎症细胞迁移的作用。皮层下缺血性血管性痴呆是血管性痴呆的重要类型，目前实验室研究使用的动物模型主要是大鼠双侧永久性颈总动脉阻塞模型（2-VO）。本申请证实本发明所述双吲哚类化合物4ae可显著改善VD大鼠的学习记忆能力、改善脑内组织学变化及炎症、氧化状态，可治疗大鼠的血管性痴呆。综上，本发明所述双吲哚类化合物4ae可显著改善血管性痴呆痴呆大鼠的认知障碍，改善血管性痴呆痴呆大鼠的脑内组织学变化，降低血管性痴呆痴呆大鼠脑内的炎症及氧化应激状态；可选择性抑制乙酰胆碱酯酶；还可以抑制斑马鱼炎症细胞的迁移。

附图说明

图1 是本发明所述双吲哚类化合物4ae对CuSO₄诱导的斑马鱼白细胞/巨噬细胞迁移的抑制作用；图中，* ：与正常对照组（加入溶剂0.1%DMSO组）相比，具有极显著性差异（p<0.01）；# ：与模型对照组（加入CuSO₄组）相比，具有极显著性差异（p<0.01）。

图2 是检测药物对血管性痴呆治疗作用的动物实验流程安排；2-VO，双侧颈总动脉结扎；MWM，Morris水迷宫；Probe，空间探索实验；SAC，处死；BA，生化检测；

图3 是本发明所述双吲哚类化合物4ae对血管性痴呆大鼠空间学习记忆的改善作用；图中，*：与伪手术组相比具有极显著性差异（p<0.01）；#：与模型组相比具有极显著性差异（p<0.01）；

图4 是本发明所述双吲哚类4ae对血管性痴呆大鼠脑组织TNF-α（A）、IL-6（B）、ROS（C）、SOD（D）含量的影响；各组设置与给药、实验数据处理及方差分析参照图3说明；

图5 是HE染色检测本发明所述双吲哚类化合物4ae对血管性痴呆大鼠脑组织的病理学改善作用。（200×）各组设置与给药、实验数据处理及方差分析参照图3说明；

图6 是尼氏染色检测本发明所述双吲哚类化合物4ae对血管性痴呆大鼠神经元的病理学改善作用。上行图片为皮层区神经元，下行图片为海马区神经元。（200×）各组设置与给药、实验数据处理及方差分析参照图3说明。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

本申请所述的双吲哚类化合物4ae可参照文献（You-Qing Wang, Zhong-Shu Wei,Chao-Qun Zhu, Yuan-Yuan Ren, Chunrui Wu. Solvent-controlled and selectivesynthesis of mono- and bis-indolyl products in Brønsted acid catalyzed aza-Friedel–Crafts reactions of indoles with cyclic imines. Tetrahedron. 2016; 72(31):4643-4654.）制备获得。

应用试验1、双吲哚类化合物4ae对斑马鱼的抗炎活性实验。

1.1 实验仪器、材料及动物。

SZX16 型体视荧光显微镜（日本奥林巴斯光学有限公司）；DP2-BSW 图像采集系统（日本奥林巴斯光学有限公司）；X-51 倒置相差显微镜（日本奥林巴斯光学有限公司）；斑马鱼养殖饲养系统（北京爱生科技有限公司）。姜黄素（Sigma公司产品，纯度98%以上）用DMSO溶解为100mM的母液，备用；实验时，用培养水稀释至受试浓度。硫酸铜（CuSO₄）（Sigma公司产品，纯度99%以上）。用DMSO配成的样品母液，置于4℃冰箱备用。实验时受试药物用斑马鱼胚胎培养用水（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.4 mM CaCl₂，0.16 mM MgSO₄）稀释获得实验所需浓度10μM。实验动物为荧光转基因斑马鱼Tg（zlyz:EGFP）由山东省科学院药物筛选技术重点实验室提供。斑马鱼饲养于斑马鱼养殖系统，照明14 h /黑暗10 h、28 ℃标准条件下饲养。

1.2 实验方法。

取健康性成熟的斑马鱼，按雌雄1/2的比例放入交配缸内，次日9～10时获得受精卵。对受精卵进行消毒和清洗后，移入斑马鱼胚胎培养水中，28 ℃下控光培养。收集受精卵，对受精卵进行消毒和清洗后，移入斑马鱼胚胎培养水中，28℃下控光培养。在体视显微镜下挑选正常的72 hpf （hours post fertilization）的斑马鱼幼鱼，小心转移至24孔培养板中，每孔8枚，每组两个复孔。设定空白对照组（胚胎培养用水，含0.5 %DMSO）、CuSO₄造模组（20 μM）和样品组（10μM）。每孔用培养用水加至总体积为2 mL。保证DMSO的终浓度不高于0.5 %。给药后将胚胎置于光照培养箱（28 ℃）继续控光培养。药物处理2 h后，样品组每孔加2μL CuSO₄（终浓度为20 μM），作用1 h后，用培养用水清洗3遍，然后用4 %多聚甲醛固定，置于4℃冰箱，保存过夜。次日采用荧光显微镜观察荧光标记的炎症细胞迁移变化，计数神经丘周围巨噬细胞个数。利用Image Pro Plus软件统计。实验数据用mean±SE表示，采用SPSS软件进行各组间方差分析，P＜0.01为有极显著性差异。

1.3实验结果。

转基因斑马鱼（zlyz：EGFP）免疫细胞带有绿色荧光标记。利用CuSO₄损伤神经丘（斑马鱼体表侧线器的末梢器官），造成斑马鱼巨噬细胞迁移至神经丘周围，建立CuSO₄诱发的斑马鱼炎症模型，实验结果如附图1所示。

图1 是化合物4ae对CuSO₄诱导的斑马鱼白细胞/巨噬细胞迁移的抑制作用。荧光显微镜（4倍）观察药物对斑马鱼炎症细胞迁移的影响。左图：Control为空白对照组（0.1%DMSO），Model为CuSO₄（20μM）造模组，Curcumin为姜黄素（10μM）+ CuSO₄（20μM）处理组，4ae为4ae（10μM）+ CuSO₄（20μM）处理组。右图为EGFP荧光标记的炎性细胞个数的统计结果。实验数据用mean±SD表示，n=16。采用SPSS软件进行各组间方差分析。图中可以看出：造模组荧光标记的炎症细胞迁移显著增多，姜黄素和4ae组可显著抑制该细胞迁移，且在同样剂量下4ae组的抗炎作用要强于姜黄素的作用。

应用试验2、双吲哚类化合物4ae对血管性痴呆大鼠的治疗作用。

2.1 实验仪器、材料及动物。

电子天平（慈溪市天东衡器厂，型号：HX501），分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，型号：BSA224S-CW），自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂，型号：SZ-93），超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-500E），恒温磁力搅拌器（江苏中大仪器厂，型号：85-2），立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂，型号：LDZX-75KB），Morris水迷宫视频分析系统（北京众实迪创科技发展有限责任公司，型号：ZS-001），Y迷宫视频分析系统（北京众实迪创科技发展有限责任公司，型号：ZS-MGY），水迷宫、Y迷宫及Panlab Smart小动物行为记录分析系统（瑞沃德生命科技有限公司）。水合氯醛（天津市光复精细研究所，分析纯），抗生素（深圳华药南方制药有限公司），羧甲基纤维素钠（CMC-Na）（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯），医用碘伏（洛阳市尚春生物科技有限公司）。反应氧族（ROS）检测试剂盒（DCFH-DA法）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒购自碧云天生物有限公司，大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA检测试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司，大鼠白细胞介素6（IL-6）ELISA试剂盒购自伊莱瑞特生物科技有限公司。雄性SD大鼠购自河南省实验动物中心，许可证号SCXK（豫）2015-0004，体质量250±10g。动物饲养在温度控制的环境（22± 1）℃下，12 h明暗循环，分笼饲养并自由摄水饮食。所有行为学的实验均在10：00 ～17：00 间进行。遵循的程序符合国家及提供实验动物单位的实验动物福利规则和制度。

2.2 实验方法。

采用双侧颈总动脉永久性结扎建立大鼠慢性脑缺血损伤模型（手术第1天先结扎单侧，第7天结扎另一侧），同时设立假手术组（Sham）。造模大鼠随机分为3 组：2-VO模型组灌胃给予溶剂对照; 姜黄素给药组灌胃给予剂量为50mg/kg/d的姜黄素，4ae给药组灌胃给予剂量为20mg/kg/d的4ae。Sham组灌胃给予溶剂对照。应用0.5%羧甲基纤维素钠溶液制备混悬溶液作为溶剂。按照附图2所示流程进行行为学测试，测试完毕处理动物进行其他指标的检测。

第17天开始对大鼠进行5天的水迷宫实验测试大鼠学习记忆能力，实验包括定位航行实验及空间探索实验两部分。定位航行实验为期4天，每只大鼠每天训练3次，记录大鼠找到平台的时间为潜伏期，3次测得潜伏期均数作为1d 的成绩，进行统计分析。空间探索实验为期1天，需撤去平台，记录每只动物120 s 内穿越平台所在位置的次数、平台所在象限（目标象限）的时间比例及游泳路程比例等作为衡量其学习记忆能力的指标。

第22天对大鼠进行通电Y迷宫实验。测试装置由三个臂组成，每个臂末端都有一个灯。在每次试验中，只有一只臂（安全区）的光线是明亮的，没有电流。与此同时，其他两个臂（不安全区）无灯光，但臂内通50 - 70伏的电。训练前，大鼠可以自由探索5分钟。训练、测试时，大鼠会先被放在安全不通电流的地方。当老鼠在安全区停留30秒以上时，安全区的位置被改变，迫使老鼠通过电击找到新的安全区域。10s内成功地进入安全区，可记录为1次正确入臂，否则记录为1次不正确的入臂。整个过程共记录10次入臂，统计正确入臂次数。所有大鼠均在训练2次后进行测试，每次间隔1h。

第23天处死大鼠，取脑匀浆，蛋白定量后参照试剂盒说明书检测脑内ROS、SOD、TNF-α和IL-6的含量。另取一半大鼠大脑标本，经固定、脱水、包埋、切片，然后进行HE 染色及尼氏染色，在光学显微镜下观察皮层、海马病理学组织形态变化。实验数据均来自3～6次独立实验。

2.3实验结果。

图3 是化合物4ae对血管性痴呆大鼠空间学习记忆的改善作用。A-F是Morris 水迷宫检测结果：A，第4天定位航行试验各组大鼠的代表性游泳轨迹；B，第5天空间探索试验中各组大鼠的代表性游泳轨迹；C，定位航行试验中大鼠的逃避潜伏期；D，空间探索试验中大鼠在120s内的平台穿越次数；E，空间探索试验中大鼠在目标象限的停留时间所占的百分比。F，空间探索试验中大鼠在目标象限游泳距离占总游泳路程的百分比。G是Y迷宫的检测大鼠进入正确臂的次数。Sham组为伪手术组，Model为双侧颈总动脉结扎模型组（2-VO模型组），Curcumin为姜黄素给药组，4ae为4ae给药组。姜黄素给药剂量为50mg/kg/d，4ae的给药终浓度为20mg/kg/d。实验数据用mean±SD表示，n=6。采用SPSS软件进行各组间方差分析。

从附图3可看出：在水迷宫测试中，与Sham组相比，2-VO模型组大鼠的逃避潜伏期有所延长，说明造模成功。姜黄素组和化合物4ae组大鼠的逃避潜伏期比模型组的明显缩短。随着训练时间的延长，各组大鼠的逃避潜伏期均逐渐缩短，其中Sham组的缩短幅度较大，给药组也呈缩短趋势。与Sham组相比，模型组小鼠的平台穿越次数明显减少（P＜0.01）。与模型组相比，姜黄素组和化合物4ae组的平台穿越次数明显增加（P＜0.01）。目标象限的停留时间和所占游泳距离比例也出现相似趋势。在通电Y迷宫实验中，模型组的正确入臂次数要显著低于sham组小鼠，而姜黄素和4ae可显著提高血管性痴呆大鼠的正确入臂次数。

图4 是4ae对血管性痴呆大鼠脑组织TNF-α（A）、IL-6（B）、ROS（C）、SOD（D）含量的影响。如附图4所示，与Sham相比，2-VO模型组小鼠脑内的TNF-α、IL-6与ROS均显著升高，而SOD显著下降（P＜0.01），进一步证实了炎症因子与氧化应激在血管性痴呆病理进程的重要作用。姜黄素组和化合物4ae组小鼠的自发交替率比模型组均有显著改善（P＜0.01）。尤其是4ae对IL-6的抑制作用极强，说明4ae主要通过抗炎机制及抗炎级联的抗氧机制有效干预了血管性痴呆大鼠的病理进程。

图5 是HE染色检测化合物4ae对血管性痴呆大鼠脑组织的病理学改善作用。如附图5所示，大鼠皮层神经元HE染色结果表明：Sham组大鼠神经元结构完整，排列整齐，核仁清晰，细胞核大而圆，胞质无红染；而2-VO模型组大鼠神经元细胞排列散乱，细胞体积缩小，核不规则，核固缩深染的变性神经细胞数增多。与2-VO 模型组比较，给药组对神经元损伤具有显著改善作用，其中4ae组对神经元形态结构改善作用尤为明显，细胞排列整齐，深染细胞核数目明显减少。

图6 是尼氏染色检测化合物4ae对血管性痴呆大鼠神经元的病理学改善作用。如附图6所示，大鼠海马区和皮层神经元尼氏染色中，Sham组大鼠神经元细胞排列整齐、紧凑，基本没有尼氏体破裂现象；而2-VO模型组大鼠神经元排列散乱，细胞带出现断裂，出现尼氏体碎裂现象的神经元数目增多，细胞核深染数目增多。与2-VO模型组比较，给药组对神经元损伤具有一定改善作用，其中4ae组对神经元形态结构改善作用尤为明显，深染细胞核数目明显减少，尼氏体较完整清晰。

综上可以看出：在以上实验中，用药剂量为20mg/kg/d的4ae对血管性痴呆大鼠的干预作用均与50mg/kg/d的姜黄素干预组相当，甚至对炎症指标的干预作用更强，提示其高效的作用特点。

应用试验3、双吲哚类化合物4ae对胆碱酯酶的抑制作用。

3.1 实验仪器、材料。

1500-831型全长酶标仪（Thermo Fisher Scientific），测试所用的乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BuChE）、碘化硫代乙酰胆碱酯酶（ACI）、碘化硫代丁酰胆碱酯酶（BCI）、二硫代-双-硝基苯甲酸（DTNB）均购自Sigma，磷酸二氢钾及其他试剂购自阿拉丁。

3.2 实验方法。

配置0.1mol/L的磷酸盐缓冲液（PH=8.0）：精确称取氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g调PH至8.0。采用以上配置的缓冲液现配现用AChE、BuChE。DTNB、ACI、BCI也用上述缓冲液稀释至0.01mol/L、 0.01mol/L、0.02mol/L。姜黄素和化合物4ae先用DMSO配置为10mM溶液，再用缓冲液稀释至100μM。

96孔板中每孔加入酶溶液10μl，10μl的待测样品，加入80μl PBS,使总体积为100μl，37℃反应15min，加入10μl ACI（测AChE时）或BCI（测BuChE时），10μl的DTNB及80μl的PBS的混合液共计100μl。混匀后测定其在412nm波长处的A值（An），参比用0.1mol/L PBS。ACI或BCI的自发水解为A_自发，以未加样品测定的A_control值作为100个活力单位。相对酶活率 =（An-A_自发/A_control-A_自发）×100%，药物对酶活力的抑制率=1—相对酶活率，计算抑制率。实验结果由三次检测数据所得。

3.3实验结果。

10μM姜黄素对AChE的抑制率为28.3±3.1%，同样浓度的化合物4ae对AChE的抑制率为20.3±2.2%。10μM姜黄素和化合物4ae对BuChE抑制率分别为2.4±0.5%和-1.1±0.3%。提示4ae对AChE的作用虽不及姜黄素，但其对AChE的选择性较好。因此，AChE可能作为其抗炎以外的辅助性靶点，对血管性痴呆的干预起到一定作用。

Claims (1)

1.双吲哚类化合物在制备防治血管性痴呆药物方面的应用，其特征在于，该双吲哚类化合物的结构式如下所示：

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