CN113387867A - 一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物及其制备与应用 - Google Patents

一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物及其制备与应用。本发明氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物是以2‑甲氧基色胺为起始原料，经过苄基保护、脱甲基、氨基甲酰化、脱保护、缩合五步反应合成，能够选择性抑制丁酰胆碱酯酶活性，丁酰胆碱酯酶抑制活性具有比卡巴拉汀更好的作用。在细胞水平和动物水平上都具有显著的抗神经炎症活性，在动物水平上口服给药有效，能显著改善AD模型小鼠行为功能的缺陷，且该化合物具有良好的药代动力学性能和血脑屏障通透能力，可应用于制备抗阿尔兹海默症药物。

Description

一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物及其制备与应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物的制备方法，本发明同时还涉及该氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物在制备抗阿尔兹海默症药物中的应用。
背景技术
阿尔兹海默症（AD）作为最常见的神经退行性疾病，是全球人群痴呆症发生的主要原因，但其发病机制至今仍尚不清楚。最新研究资料显示，阿尔茨海默病（AD）的潜在病理机制包括β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积、Tau蛋白过度磷酸化造成神经纤维缠结、神经递质水平失衡、能量代谢紊乱、表观遗传变异，血管异常以及过度的神经炎症等引起神经元损伤，最后导致认知和行为障碍。随着人口老龄化的增长，AD患病率和治疗费用预计将呈指数级增长，这给患者、家庭、社会和医疗体系都带来了沉重负担。目前已批准的AD治疗药物主要有胆碱酯酶抑制剂（多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏）、N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）拮抗剂（美金刚）和靶向脑-肠轴的国产原研药物甘露特钠（GV-971）。然而，这些药物大多只是针对单一靶点改善临床症状，难以从根本上逆转疾病的进展，且容易产生耐药性和严重的不良反应。截止目前，针对高发病率的AD仍然缺乏特异的治疗方法，甚至对于中晚期的患者基本是处于“无药可用”的困境。因此，临床上迫切需要研发具有新型作用特点的AD治疗药物。
截止至2021年6月21日，根据Alzforum上的统计，历史上共有258种AD药物进入过临床试验阶段，但因为种种原因，近一半已经终止了实验，目前全球抗AD在研新药有152个，在II-III期临床实验中75%表现出积极的作用，主要集中在Aβ级联（38%）、神经递质（27%）、神经炎症（16%）、Tau蛋白病理（5%）、神经元凋亡（9%）和神经营养（5%）等病理靶点。很多专家指出，未来抗AD药物的研发不能只针对单一靶点，需采用多种疗法、多种模式来阻止这种疾病的发生发展，因此，多靶点导向配体（MTDLs）被认为是目前有效的治疗策略。研究表明，AD与多种中枢神经递质如乙酰胆碱（ACh）、5-羟色胺、多巴胺、兴奋性氨基酸等的异常有关，其中胆碱能神经系统功能缺陷尤为突出。老年痴呆病人脑组织中胆碱能标志物降低，主要是胆碱乙酰酶活性降低导致ACh合成减少。中枢胆碱能系统损伤是造成AD患者记忆损伤和认知功能降低的关键。研究表明，随着AD症状的加深（轻度-中度-重度），丁酰胆碱酯酶（BChE）的活性调控作用明显高于乙酰胆碱酯酶（AChE），是晚期AD的潜在治疗靶点。此外，近年来随着临床医学和分子生物学的快速发展，对于AD的发病机制研究不断深入，很多潜在的AD治疗新靶点被发现。小胶质细胞作为中枢神经系统的先天免疫细胞，在神经退行性疾病进程中由于被长期激活会释放炎症介质、活性氧中间产物、NO、蛋白水解酶、互补因子或兴奋性氨基酸等毒性物质，进而会造成周边神经元的损伤。同时，反应性小胶质细胞是AD患者大脑中淀粉样蛋白斑块沉积、Tau蛋白病理磷酸化和聚集的桥梁。由此可见，抑制小胶质细胞激活，干预神经炎症对预防AD及早期治疗具有重大作用。因此，设计开发具有抗神经炎症活性的多功能胆碱酯酶抑制剂对治疗不同阶段的AD具有重大临床价值，有进步开发得到“治标又治本”的潜力。
基于经典药物设计原理，在前期研究中已经证实了N-水杨酸色胺类化合物能同时抑制COX-2和小胶质细胞的激活，具有显著的抗神经炎症活性，且部分活性分子也具有Aβ聚集抑制作用，对开拓出预防及治疗AD的新型先导化合物提供一定的理论基础。进一步通过胆碱酯酶抑制活性实验发现，该类化合物本身不具备胆碱酯酶抑制活性。考虑到ACh对认知功能的关键作用，以及文献调研发现，氨基甲酸酯片段在常见胆碱酯酶抑制剂（如卡巴拉汀、毒扁豆碱等）中作为重要药效团在体内能结合丝氨酸残基上的羟基，对胆碱酯酶抑制活性有重要调节作用，鉴于此，我们以N-水杨酸色胺类化合物作为基本骨架，通过合理融合氨基甲酸酯药效团，设计合成了一系列氨基甲酸酯类N-水杨酸色胺衍生物，初步生物活性研究表明该类化合物的确具有良好的抗神经炎症活性及胆碱酯酶（AChE和BChE）抑制活性，此外，也具有良好的Aβ聚集抑制和抗氧化等多种活性，以期找到能有效预防及治疗AD的新型多功能胆碱酯酶抑制剂。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物及其制备方法；
本发明的另一个目的是提供氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物在制备抗阿尔兹海默症药物中的应用。
本发明一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物，其结构式如下：
Figure 665798DEST_PATH_IMAGE001
其中，R为甲胺，乙胺，正丙胺，正丁胺，戊胺，正己胺，庚胺，环丁胺，环戊胺，环己胺，环己甲胺，苯胺，二甲胺，二乙胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，甲基甲氧基胺，甲基苯胺，杂氮环丁烷，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，N-甲基哌嗪或咪唑；R1为苯基；R2为F、Cl、Br、烷基、烷氧基中的一种，R2在苯环上的取代位置为3位、4位、5位、6位，取代基数量为单取代。
本发明一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以5-甲氧基色胺和溴化苄为原料，以碳酸氢钠为碱，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，在氩气保护下，25~45 ℃下反应2~12 h，反应完成后，用水和乙酸乙酯萃取洗去N,N-二甲基甲酰胺，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物1；；
化合物1的结构式为：
Figure 989463DEST_PATH_IMAGE002
；溴化苄的用量为5-甲氧基色胺摩尔量的1.5~2.0倍；碳酸氢钠的用量为5-甲氧基色胺摩尔量的2.0~2.5倍。
（2）以化合物1和三溴化硼为原料，以二氯甲烷为溶剂，在氩气保护的条件下，于-78~-20 ℃反应1~4 h，转移至室温反应2~6 h，反应完成后，缓慢滴加冰水淬灭，再加饱和碳酸氢钠中和反应液，用二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物2；
化合物2的结构式为：
Figure 910146DEST_PATH_IMAGE003
；三溴化硼的用量为化合物1摩尔量的2.5~3.0倍。
（3）化合物2和双(三氯甲基)碳酸酯为原料，以吡啶为碱，以二氯甲烷为溶剂，在氩气保护的条件下，于0~10 ℃反应0.5~2h后，加入胺类化合物，转移至室温反应0.5~3 h，反应完成后，缓慢滴加冰水淬灭，用二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物3；
化合物3的结构式为：
Figure 532055DEST_PATH_IMAGE004
，R为甲胺，乙胺，正丙胺，正丁胺，戊胺，正己胺，庚胺，环丁胺，环戊胺，环己胺，环己甲胺，苯胺，二甲胺，二乙胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，甲基甲氧基胺，甲基苯胺，杂氮环丁烷，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，N-甲基哌嗪或咪唑；双(三氯甲基)碳酸酯的用量为化合物2摩尔量的0.3~0.4倍；吡啶的用量为化合物2摩尔量的1~2倍；胺类化合物为甲胺，乙胺，正丙胺，正丁胺，戊胺，正己胺，庚胺，环丁胺，环戊胺，环己胺，环己甲胺，苯胺，二甲胺，二乙胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，甲基甲氧基胺，甲基苯胺，杂氮环丁烷，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，N-甲基哌嗪或咪唑；胺类化合物的用量为化合物2摩尔量的1.0~1.5倍。
（4）以化合物3为原料，以钯碳为催化剂，以甲醇为溶剂，在氢气条件下，于25~60℃反应2~12 h，反应完成后，抽滤收集滤液旋干，柱层析分离得到化合物4
化合物4的结构式为：
Figure 487373DEST_PATH_IMAGE005
，R为甲胺，乙胺，正丙胺，正丁胺，戊胺，正己胺，庚胺，环丁胺，环戊胺，环己胺，环己甲胺，苯胺，二甲胺，二乙胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，甲基甲氧基胺，甲基苯胺，杂氮环丁烷，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，N-甲基哌嗪或咪唑；钯碳的用量为化合物3摩尔量的0.2~0.5倍。
（5）以化合物4和邻氨基苯甲酸类化合物为原料，以1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐为缩合剂，以1-羟基苯并三氮唑为催化剂，以三乙胺为碱，以二氯甲烷为溶剂，在氩气条件下，于室温反应1~6 h，反应完成后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到目标产物氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物；
目标产物的结构式为：
Figure 513098DEST_PATH_IMAGE006
，R为甲胺，乙胺，正丙胺，正丁胺，戊胺，正己胺，庚胺，环丁胺，环戊胺，环己胺，环己甲胺，苯胺，二甲胺，二乙胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，甲基甲氧基胺，甲基苯胺，杂氮环丁烷，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，N-甲基哌嗪或咪唑；R1为苯基；R2为卤素F或Cl或Br、烷基、烷氧基的一种；R2在苯环上的取代位置为3位、4位、5位、6位，取代基数量为单取代；
邻氨基苯甲酸类化合物的结构式为：
Figure 717814DEST_PATH_IMAGE007
，R1为苯基；R2为F、Cl、Br、烷基、烷氧基中的一种，R2在苯环上的取代位置为3位、4位、5位、6位，取代基数量为单取代；邻氨基苯甲酸类化合物的用量为化合物4摩尔量的1.0倍；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐的用量为化合物4摩尔量的1.0~1.2倍；1-羟基苯并三氮唑的用量为化合物4摩尔量的0.5~1.2倍；三乙胺的用量为化合物4摩尔量的1.5~2.5倍。
氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物的合成路线如下：
Figure 57660DEST_PATH_IMAGE008
其中，R为甲胺，乙胺，正丙胺，正丁胺，戊胺，正己胺，庚胺，环丁胺，环戊胺，环己胺，环己甲胺，苯胺，二甲胺，二乙胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，甲基甲氧基胺，甲基苯胺，杂氮环丁烷，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，N-甲基哌嗪或咪唑；R1为苯基；R2为F、Cl、Br、烷基、烷氧基中的一种；R2在苯环上的取代位置为3位、4位、5位、6位，取代基数量为单取代。
本发明所制备的氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物抗阿尔兹海默症活性显著，能够选择性抑制丁酰胆碱酯酶活性，丁酰胆碱酯酶抑制活性具有比卡巴拉汀更好的作用，在细胞水平和动物水平上都能具有显著的抗神经炎症活性，在动物水平上口服给药有效，能显著改善AD模型小鼠行为功能的缺陷，且该化合物具有良好的药代动力学性能和血脑屏障通透能力。
本发明所制备的氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物经Ellman光谱法实验显示，具有抑制丁酰胆碱酯酶的作用，其抑制类型为混合型（竞争型和非竞争型）可逆抑制剂。
本发明所制备的氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物经MTT法实验显示毒性小且具有神经保护作用。
本发明所制备的氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物经ELISA试剂盒检测，Western blot实验显示具有抑制炎症因子如COX-2,NO, TNF-α, PGE2, IL-6, IL-1β表达和促进抑炎因子如IL-4, IL-10表达的作用。
本发明所制备的氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物经流式细胞术及Westernblot实验显示具有抑制神经元凋亡的作用。
本发明所制备的氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物经流式细胞术，DPPH和ORAC实验显示具有抗氧化作用。
本发明所制备的氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物经急性毒性实验显示，该类化合物具有很低的毒性。
本发明所制备的氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物经小鼠药代动力学实验显示，该类化合物药代动力学参数较优。
本发明所制备的氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物经小鼠行为学实验显示，该类化合物对阿尔兹海默症模型小鼠的行为缺陷有显著的改善作用。
综上所述，本发明以2-甲氧基色胺为起始原料，经过苄基保护、脱甲基、氨基甲酰化、脱保护、缩合五步反应制备了一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物，该类化合物能够选择性抑制丁酰胆碱酯酶活性，丁酰胆碱酯酶抑制活性具有比卡巴拉汀更好的作用，在细胞水平和动物水平上都能具有显著的抗神经炎症活性，在动物水平上口服给药有效，能显著改善AD模型小鼠行为功能的缺陷，且该化合物具有良好的药代动力学性能和血脑屏障通透能力，可应用于制备抗阿尔兹海默症药物。
附图说明
图1为本发明制备化合物对丁酰胆碱酯酶的可逆性抑制类型曲线。
图2为本发明制备化合物对丁酰胆碱酯酶的酶动力曲线。
图3为本发明制备化合物对丁酰胆碱酯酶的抑制常数（Ki）曲线。
图4为本发明制备化合物对小胶质细胞BV2、海马神经元细胞HT22和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的增殖抑制影响。
图5为本发明制备化合物对小胶质细胞BV2、小鼠海马神经元细胞HT22和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的神经保护作用。
图6为本发明制备化合物对小胶质细胞BV2活性氧（ROS）爆发的影响。
图7为本发明制备化合物对海马神经元细胞HT22细胞凋亡的Hoechst染色结果。
图8-1~8-4为本发明制备化合物对海马神经元细胞HT22细胞凋亡的流式结果。
图9为本发明制备化合物对海马神经元细胞HT22凋亡相关蛋白表达的影响。
图10为本发明制备化合物对一氧化氮合酶、COX-2表达的影响。
图11为本发明制备化合物对炎症因子表达的影响。
图12为空白组与给药组（1000 mg/kg，灌胃，单次给药）的脾脏、肝脏、肾脏、心脏、肺和胃的病理切片结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl ethylcarbamate(化合物HN-2,R=NCH2CH3, R2=H).
（1）将5-甲氧基色胺（21mmol），碳酸氢钠（50.4mmol）加入100 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气。加入42mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，滴加溴化苄（35.7mmol），加热到45℃反应6小时。经TLC监测反应完成后，用水和乙酸乙酯萃取洗去N,N-二甲基甲酰胺，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物N,N-dibenzyl-2-(5-methoxy-1H-indol-3-yl)ethan-1-amine(化合物1)，产率为73%。
（2）将N,N-dibenzyl-2-(5-methoxy-1H-indol-3-yl)ethan-1-amine(1.35mmol)加入50 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气。加入7mL干燥的二氯甲烷，于低温-20℃中缓慢滴加1mol/L三溴化硼（4mmol），在低温-20℃中反应1小时后，转移至室温反应约3小时（溶液搅拌至完全澄清）。经TLC监测反应完成后，缓慢滴加冰水淬灭，再加饱和碳酸氢钠水溶液中和反应体系，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物3-(2-(dibenzylamino)ethyl)-1H-indol-5-ol(化合物2)，产率为83%。
（3）将双(三氯甲基)碳酸酯（0.168mmol），吡啶（1.12mmol）加入50 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气。加入2 mL干燥的二氯甲烷，在0℃中反应30min后，缓慢滴加溶于二氯甲烷中的3-(2-(dibenzylamino)ethyl)-1H-indol-5-ol(化合物2，0.56mmol)，继续0℃中反应30min。后缓慢滴加溶于二氯甲烷中的乙胺（0.8 mmol），0℃中反应40min。经TLC监测反应完成后，缓慢滴加冰水淬灭，再加饱和碳酸氢钠水溶液中和反应体系，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物3-(2-(dibenzylamino)ethyl)-1H-indol-5-ylethylcarbamate(化合物3,R=NCH2CH3)，产率为50%。
（4）将3-(2-(dibenzylamino)ethyl)-1H-indol-5-yl ethylcarbamate（0.8mmol），钯碳（0.2-0.5 mmol）加入25 mL圆底烧瓶中，并置换为氢气。45℃反应4小时。经TLC监测反应完成后，用砂芯过滤，收集有机相旋干，得到粗产物3-(2-aminoethyl)-1H-indol-5-yl ethylcarbamate(化合物4 R=NCH2CH3)。
（5）将3-(2-aminoethyl)-1H-indol-5-yl ethylcarbamate（1 mmol），2-(phenylamino)benzoic acid（1 mmol），1-羟基苯并三氮唑（1.2 mmol），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（1.2 mmol），三乙胺（2.5 mmol）加入25 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气。加入5 mL干燥的二氯甲烷，室温反应3小时。经TLC监测反应完成后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl ethylcarbamate(化合物HN-2,R=NCH2CH3, R2=H)，产率为70%。1HNMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.27 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.36 – 7.30 (m,3H), 7.30 – 7.27 (m, 2H), 7.26 – 7.21 (m, 2H), 7.17 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.03– 6.94 (m, 3H), 6.71 (m, J = 7.5, 1.2 Hz, 1H), 6.27 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 5.00(t, J = 5.8 Hz, 1H), 3.70 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 3.33 (p, J = 7.2 Hz, 2H), 2.99(t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.26 – 1.22 (m, 3H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 169.48,155.58, 145.19, 144.55, 141.73, 134.11, 131.99, 129.27, 127.59, 127.54,123.46, 122.23, 120.53, 118.90, 118.16, 116.83, 115.66, 113.11, 111.63,111.05, 39.87, 36.17, 25.16, 15.24.
实施例2
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl propylcarbamate(化合物HN-3, R=NHCH2CH2CH3, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为正丙胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率73%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.27 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.32 (t, J= 7.1 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.24 (m, J = 3.8, 1.8 Hz, 2H), 7.17(d, J = 7.8 Hz, 2H), 6.99 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.95 (m, J = 5.0, 2.6 Hz, 2H),6.73 – 6.68 (m, 1H), 6.30 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.06 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 3.67(q, J = 6.4 Hz, 2H), 3.24 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 2.97 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.60(h, J = 7.3 Hz, 2H), 0.98 (t, J = 7.4 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ169.49, 155.78, 145.19, 144.54, 141.73, 134.11, 132.00, 129.28, 127.62,127.52, 123.47, 122.23, 120.52, 118.90, 118.17, 116.78, 115.65, 113.05,111.64, 111.02, 43.02, 39.86, 25.15, 23.17, 11.31.
实施例3
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl butylcarbamate(化合物HN-4, R=NH(CH2)3CH3, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为正丁胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率71%。1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 9.22 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 7.18 (q, J= 10.7, 9.7 Hz, 5H), 7.07 (d, J = 7.4 Hz, 3H), 6.90 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.79(d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.62 (m, J = 15.8, 8.5 Hz, 2H), 6.37 (s, 1H), 5.09 (d, J= 6.4 Hz, 1H), 3.47 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 3.17 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 2.75 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 1.46 (p, J = 7.3 Hz, 2H), 1.31 (p, J = 7.0 Hz, 2H), 0.86 (t, J= 7.3 Hz, 3H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 169.47, 155.94, 145.02, 144.21,141.62, 134.01, 131.88, 129.19, 127.69, 127.34, 123.48, 122.12, 120.37,118.81, 118.09, 116.36, 115.49, 112.56, 111.62, 110.78, 40.95, 39.82, 31.85,24.93, 19.87, 13.70.
实施例4
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl pentylcarbamate(化合物HN-5, R=NH(CH2)4CH3, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为戊胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率74%。1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 9.29 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 7.31 (t, J =6.5 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 7.17 – 7.07 (m, 3H), 6.97 (t, J = 7.3Hz, 1H), 6.85 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 6.47 (s, 1H),5.30 – 5.13 (m, 1H), 3.52 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 3.22 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.80(t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.54 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.32 (m, J = 7.7, 5.3, 3.5 Hz,4H), 0.91 (d, J = 6.2 Hz, 3H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 169.46, 155.95,144.99, 144.15, 141.59, 133.99, 131.86, 129.18, 127.72, 127.31, 123.48,122.10, 120.34, 118.79, 118.09, 116.29, 115.46, 112.48, 111.62, 110.75,41.22, 39.81, 29.45, 28.83, 24.88, 22.27, 13.95.
实施例5
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl hexylcarbamate(化合物HN-6b, R=NH(CH2)5CH3, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为己胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率72%。1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 9.30 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 7.37 – 7.28(m, 3H), 7.23 (s, 1H), 7.16 (d, J = 7.9 Hz, 3H), 6.99 (t, J = 7.3 Hz, 1H),6.90 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.70 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.43 (s,1H), 5.16 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 3.58 (q, J = 6.2, 5.7 Hz, 2H), 3.26 (q, J =6.7 Hz, 2H), 2.87 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.64 – 1.50 (m, 2H), 1.34 (d, J = 12.0Hz, 6H), 0.95 – 0.87 (m, 3H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 169.45, 155.87,145.05, 144.26, 141.62, 134.02, 131.88, 129.19, 127.68, 127.36, 123.48,122.13, 120.40, 118.82, 118.10, 116.42, 115.51, 112.63, 111.63, 110.81,41.29, 39.83, 31.41, 29.77, 26.41, 24.97, 22.52, 14.00.
实施例6
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl heptylcarbamate(化合物HN-7b, R=NH(CH2)6CH3, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为庚胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率73%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.28 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.33 (d, J = 8.2 Hz,1H), 7.31 (s, 1H), 7.29 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.24 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 7.21(s, 1H), 7.17 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 6.99 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.93 (dd, J =8.7, 2.1 Hz, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.70 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.32 (t, J = 5.3Hz, 1H), 5.06 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 3.65 (m, J = 12.6, 6.5 Hz, 2H), 3.26 (m, J= 13.4, 6.8 Hz, 2H), 2.94 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.64 – 1.53 (m, 2H), 1.40 –1.28 (m, 8H), 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 169.44,155.74, 145.11, 144.42, 141.65, 134.05, 131.93, 129.22, 127.60, 127.43,123.44, 122.16, 120.44, 118.83, 118.11, 116.65, 115.57, 112.88, 111.60,110.93, 41.30, 39.80, 31.72, 29.85, 28.93, 26.72, 25.05, 22.58, 14.07.
实施例7
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-ylcyclopropylcarbamate (化合物HN-6, R=NH-cyclopropyl, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为环丙胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率68%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.29 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 7.36 – 7.29 (m,2H), 7.27 (d, J = 1.4 Hz, 3H), 7.22 (dd, J = 12.0, 4.8 Hz, 1H), 7.17 (s, 1H),7.15 (s, 1H), 6.99 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.78 (s,1H), 6.69 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.45 (s, 1H), 3.57 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 2.86(s, 2H), 2.67 (s, 1H), 0.75 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 0.61 (s, 2H). 13C NMR (101MHz, CDCl3) δ 169.47, 145.06, 141.64, 134.06, 131.89, 129.20, 127.69, 127.36,123.52, 122.15, 120.40, 118.82, 118.11, 116.34, 115.52, 112.63, 111.65,110.78, 39.85, 24.96, 23.26, 6.74.
实施例8
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-ylcyclopentylcarbamate (化合物HN-7, R=NH-cyclopentyl, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为环戊胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率69%。1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 10.89 (s, 1H), 9.73 (s, 1H), 8.71 (s, 1H),7.64 (dd, J = 12.5, 7.6 Hz, 2H), 7.30 (s, 3H), 7.28 (s, 2H), 7.23 (s, 1H),7.17 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.96 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.81 (m, J = 10.1, 7.8Hz, 2H), 3.84 (s, 1H), 3.49 (s, 2H), 2.90 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.82 (s, 2H),1.66 (s, 2H), 1.50 (s, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 169.42, 155.07, 145.15,144.54, 141.69, 134.04, 131.95, 129.23, 127.54, 127.49, 123.39, 122.18,120.48, 118.86, 118.12, 117.38, 116.85, 115.63, 113.10, 111.56, 111.03,52.98, 39.81, 33.22, 29.69, 25.14, 23.54.
实施例9
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-ylcyclohexylcarbamate (化合物HN-8, R=NH-cyclohexyl, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为环己胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率68%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.29 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.35 – 7.30 (m,2H), 7.28 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.25 – 7.21 (m, 2H), 7.17 (s, 1H), 7.16 (s,1H), 6.99 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.96 – 6.89 (m, 2H), 6.71 (t, J = 7.2 Hz, 1H),6.34 (s, 1H), 3.64 (m, J = 12.2, 6.2 Hz, 2H), 3.60 – 3.51 (m, 1H), 2.94 (t, J= 6.5 Hz, 2H), 2.02 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 1.81 – 1.56 (m, 4H), 1.37 (m, J =24.5, 12.2 Hz, 2H), 1.24 – 1.17 (m, 2H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 169.41,154.80, 145.08, 144.41, 141.64, 134.00, 131.93, 129.22, 127.59, 127.42,123.41, 122.16, 120.43, 118.84, 118.13, 116.70, 115.60, 112.91, 111.58,110.96, 50.08, 39.80, 33.31, 25.43, 25.09, 24.76.
实施例10
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl(cyclohexylmethyl)carbamate (化合物HN-9, R=NH-cyclohexylmethyl, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为环己甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率71%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.28 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.33 (d, J = 7.9Hz, 1H), 7.31 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.29 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.25 (s, 1H),7.24 (s, 1H), 7.21 (s, 1H), 7.17 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.99 (t, J = 7.3 Hz,1H), 6.96 – 6.90 (m, 2H), 6.74 – 6.67 (m, 1H), 6.33 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 5.11(t, J = 6.1 Hz, 1H), 3.65 (m, J = 12.6, 6.5 Hz, 2H), 3.12 (t, J = 6.5 Hz,2H), 2.94 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.76 (m, J = 14.7, 7.1 Hz, 4H), 1.59 – 1.46(m, 1H), 1.33 – 1.10 (m, 4H), 1.03 – 0.91 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ169.44, 155.89, 145.11, 144.46, 141.67, 134.04, 131.94, 129.22, 127.60,127.43, 123.42, 122.16, 120.45, 118.84, 118.12, 116.66, 115.58, 112.90,111.59, 110.92, 47.52, 39.80, 38.14, 30.67, 26.36, 25.78, 25.06.
实施例11
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl phenylcarbamate(化合物HN-10, R=NHPh, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为苯胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率67%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.26 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.46 (d, J = 7.9 Hz,2H), 7.39 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.32 – 7.29 (m, 2H),7.28 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.24 – 7.19 (m, 2H), 7.16 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.13– 7.06 (m, 2H), 7.04 – 6.96 (m, 4H), 6.70 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.32 (t, J =5.4 Hz, 1H), 3.69 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.99 (t, J = 6.6 Hz, 2H). 13C NMR (101MHz, CDCl3) δ 169.47, 145.08, 143.97, 141.62, 138.27, 137.51, 134.21, 131.99,129.23, 129.13, 129.05, 127.55, 123.77, 123.59, 123.55, 122.19, 120.45,120.30, 118.79, 118.17, 116.60, 115.63, 113.18, 111.73, 111.08, 39.91, 25.12.
实施例12
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl dimethylcarbamate(化合物HN-12, R=N(Me)2, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为二甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率78%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.34 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 7.34 (d, J = 8.2Hz, 1H), 7.29 (t, J = 7.9 Hz, 3H), 7.26 – 7.21 (m, 2H), 7.18 (s, 1H), 7.16(s, 1H), 7.13 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.00 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.88 (m, J =8.7, 2.2 Hz, 1H), 6.72 – 6.67 (m, 2H), 6.52 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.53 (m, J =12.7, 6.6 Hz, 2H), 3.13 (s, 3H), 3.03 (s, 3H), 2.83 (t, J = 6.8 Hz, 2H). 13CNMR (75 MHz, CDCl3) δ 170.42, 157.17, 146.01, 145.59, 142.62, 135.01, 132.82,130.17, 128.73, 128.32, 124.48, 123.09, 121.34, 119.81, 119.04, 117.34,116.45, 113.45, 112.61, 111.82, 40.83, 37.63, 37.37, 25.90.
实施例13
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl diethylcarbamate(化合物HN-13, R=N(Et)2, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为二乙胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率79%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9.31 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.33 (d, J = 8.7Hz, 1H), 7.26 (d, J = 7.0 Hz, 4H), 7.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.17 (s, 1H),7.14 (s, 1H), 6.98 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.81 (s,1H), 6.70 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 6.40 (s, 1H), 3.59 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 3.44(d, J = 9.3 Hz, 4H), 2.90 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 1.31 – 1.16 (m, 6H). 13C NMR(101 MHz, CDCl3) δ 169.41, 155.42, 145.05, 144.78, 141.67, 134.01, 131.89,129.21, 127.67, 127.42, 123.40, 122.18, 120.43, 118.91, 118.20, 116.66,115.67, 112.71, 111.57, 110.91, 39.84, 25.01, 14.22, 13.45.
实施例14
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl dipropylcarbamate(化合物HN-14, R=N((CH2)2CH3)2, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为二丙胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率76%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.31 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 7.34 – 7.30 (m,1H), 7.27 (dd, J = 4.6, 2.8 Hz, 3H), 7.24 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 7.19 (d, J =8.8 Hz, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 6.99 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.90 (dd,J = 8.7, 2.0 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.70 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.40 (s, 1H),3.61 (dd, J = 12.2, 6.2 Hz, 2H), 3.42 – 3.34 (m, 2H), 3.34 – 3.27 (m, 2H),2.90 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.76 – 1.61 (m, 4H), 1.00 – 0.91 (m, 6H). 13C NMR(101 MHz, CDCl3) δ 169.40, 155.88, 145.05, 144.84, 141.68, 134.00, 131.89,129.21, 127.66, 127.41, 123.38, 122.17, 120.43, 118.93, 118.21, 116.65,115.68, 112.71, 111.56, 110.87, 49.48, 49.14, 39.82, 25.00, 22.00, 21.26,11.28.
实施例15
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl dibutylcarbamate(化合物HN-15, R=N((CH2)3CH3)2, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为二丁胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率78%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9.29 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.33 (d, J = 8.5Hz, 1H), 7.28 (s, 2H), 7.23 (s, 2H), 7.20 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.14 (s,1H), 6.99 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.86 (s, 1H), 6.71(t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.36 (s, 1H), 3.64 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.37 (dt, J =21.9, 7.1 Hz, 4H), 2.93 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 1.63 (dd, J = 16.1, 7.5 Hz, 4H),1.38 (s, 4H), 0.96 (q, J = 7.1 Hz, 6H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 169.37,155.76, 145.08, 144.88, 141.69, 133.98, 131.89, 129.20, 127.63, 127.41,123.35, 122.11, 120.39, 118.90, 118.14, 116.74, 115.63, 112.77, 111.54,110.92, 47.50, 47.15, 39.81, 30.94, 30.18, 25.04, 20.07, 13.91.
实施例16
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl diphenylcarbamate(化合物HN-16,R=N(Ph)2, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为二苯胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率85%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9.28 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 7.36 (d, J = 3.6Hz, 7H), 7.31 (d, J = 8.9 Hz, 3H), 7.23 (dd, J = 15.0, 7.9 Hz, 6H), 7.14 (d,J = 5.6 Hz, 3H), 6.95 (dd, J = 18.8, 7.9 Hz, 2H), 6.80 (s, 1H), 6.62 (t, J =7.4 Hz, 1H), 6.32 (s, 1H), 3.59 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 2.89 (t, J = 6.1 Hz,2H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 169.66, 154.51, 145.35, 144.73, 142.63, 141.93,134.35, 132.20, 129.48, 129.26, 127.86, 127.63, 127.19, 126.62, 123.79,122.42, 120.67, 119.03, 118.45, 116.52, 115.87, 113.15, 111.87, 110.97,40.19, 25.29.
实施例17
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl methoxy(methyl)carbamate(化合物HN-17, R=NMe(OMe), R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为甲基甲氧基胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率86%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.30 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 7.33 (d, J= 7.4 Hz, 2H), 7.32 – 7.26 (m, 3H), 7.25 – 7.20 (m, 2H), 7.18 (s, 1H), 7.16(s, 1H), 7.00 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 6.90 (s,1H), 6.71 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.33 (s, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.68 – 3.61 (m,2H), 3.31 (s, 3H), 2.94 (t, J = 6.5 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ169.43, 156.30, 145.12, 144.29, 141.63, 134.21, 131.95, 129.22, 127.57,127.44, 123.60, 122.21, 120.47, 118.77, 118.13, 116.36, 115.60, 112.93,111.72, 110.86, 61.77, 39.84, 35.69, 25.07.
实施例18
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl methyl(phenyl)carbamate(化合物HN-22, R=NMe(Ph), R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为甲基苯胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率81%。1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 9.29 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 7.37 (d,J = 4.3 Hz, 4H), 7.26 (dt, J = 18.7, 9.1 Hz, 7H), 7.15 (s, 2H), 7.12 (d, J =3.6 Hz, 1H), 6.97 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.73 (d, J =2.4 Hz, 1H), 6.64 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.37 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 3.55 (q, J =6.5 Hz, 2H), 3.43 (s, 3H), 2.85 (t, J = 6.7 Hz, 2H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ169.71, 155.46, 145.36, 144.86, 143.30, 141.94, 134.36, 132.18, 129.50,129.27, 127.94, 127.65, 123.80, 122.43, 120.69, 119.09, 118.41, 116.63,115.84, 112.99, 111.91, 111.09, 40.18, 38.44, 25.28.
实施例19
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl azetidine-1-carboxylate(化合物HN-24, R=azetidine, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为氮杂环丁烷，其余步骤同实施例1制备而得，收率64%。1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 8.25 (s, 1H), 7.32 (dd, J = 11.9,6.8 Hz, 3H), 7.26 – 7.20 (m, 3H), 7.18 (s, 1H), 7.16 (s, 1H), 6.99 (t, J =7.2 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 6.71 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.33 (s,1H), 4.18 (s, 4H), 3.66 (q, J = 6.2 Hz, 2H), 2.95 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.33(p, J = 7.1, 6.6 Hz, 2H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 169.64, 155.70, 145.31,144.67, 141.86, 134.29, 132.17, 129.47, 127.84, 127.68, 123.68, 122.46,120.72, 119.08, 118.43, 116.94, 115.89, 113.16, 111.85, 111.21, 50.36, 49.51,40.07, 29.93, 25.36, 16.01.
实施例20
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl pyrrolidine-1-carboxylate(化合物HN-25, R=pyrrolidine, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为四氢吡咯，其余步骤同实施例1制备而得，收率68%。1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 9.31 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.28 (p,J = 9.7, 9.2 Hz, 6H), 7.20 – 7.11 (m, 3H), 7.03 – 6.86 (m, 2H), 6.77 (s, 1H),6.69 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.43 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.57 (q, J = 6.7 Hz, 4H),3.48 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.85 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.94 (p, J = 6.8 Hz, 4H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 169.41, 154.43, 145.05, 144.59, 141.64, 134.01,131.84, 129.19, 127.70, 127.35, 123.42, 122.10, 120.38, 118.83, 118.05,116.58, 115.49, 112.61, 111.58, 110.94, 46.43, 46.30, 39.82, 25.79, 24.98.
实施例21
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl piperidine-1-carboxylate(化合物HN-26, R=piperidine, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为哌啶，其余步骤同实施例1制备而得，收率72%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.28 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 7.33 – 7.27(m, 2H), 7.24 (d, J = 2.6 Hz, 3H), 7.20 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.16 – 7.12 (m,3H), 6.97 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.73 (d, J = 11.6Hz, 1H), 6.68 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 3.55 (dd, J = 25.5, 17.7 Hz,6H), 2.85 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.63 (s, 6H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ169.55, 155.11, 145.17, 144.82, 141.77, 134.12, 131.97, 129.41, 129.30,127.82, 127.48, 123.55, 122.64, 122.22, 120.50, 118.95, 118.20, 116.66,115.64, 112.72, 111.72, 111.02, 45.53, 45.17, 39.96, 25.98, 25.62, 25.08,24.38.
实施例22
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl azepane-1-carboxylate(化合物HN-27, R=azepane, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为氮杂环庚烷，其余步骤同实施例1制备而得，收率70%。1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 9.30 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.36– 7.29 (m, 1H), 7.27 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 7.25 (s, 2H), 7.21 (d, J = 5.7 Hz,1H), 7.17 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.98 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.90 (dd, J = 8.7,2.3 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.69 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.41 (t, J = 5.8 Hz,1H), 3.60 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 3.53 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.88 (t, J = 6.7 Hz,2H), 1.79 (dt, J = 13.1, 6.0 Hz, 4H), 1.64 (d, J = 3.1 Hz, 4H). 13C NMR (75MHz, CDCl3) δ 169.91, 156.36, 145.58, 145.26, 142.18, 134.50, 132.36, 129.69,128.20, 127.89, 123.90, 122.60, 120.88, 119.36, 118.59, 117.10, 116.04,113.12, 112.08, 111.39, 47.83, 47.57, 40.34, 29.16, 28.61, 27.95, 27.42,25.49.
实施例23
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl morpholine-4-carboxylate(化合物HN-28,R=morpholine, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为吗啉，其余步骤同实施例1制备而得，收率75%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.28 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.31 (t, J =7.7 Hz, 1H), 7.26 – 7.22 (m, 3H), 7.22 – 7.12 (m, 4H), 6.98 (t, J = 7.3 Hz,1H), 6.88 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 6.77 (s, 1H), 6.67 (t, J = 7.5 Hz, 1H),6.43 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.75 – 3.70 (m, 4H), 3.67 (s, 2H), 3.57 (q, J = 6.5Hz, 4H), 2.86 (t, J = 6.8 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 169.43, 154.90,145.10, 144.40, 141.57, 134.08, 131.89, 129.20, 127.64, 127.39, 123.55,122.19, 120.41, 118.74, 118.01, 116.29, 115.51, 112.67, 111.65, 110.84,66.54, 44.75, 44.03, 39.87, 24.99.
实施例24
3-(2-(2-(phenylamino)benzamido)ethyl)-1H-indol-5-yl 1H-imidazole-1-carboxylate(化合物HN-31,R=1H-imidazole, R2=H).
将实施例1步骤（3）中的原料乙胺替换为咪唑，其余步骤同实施例1制备而得，收率74%。1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 9.27 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.29 (s,1H), 7.57 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.8 Hz,1H), 7.34 – 7.25 (m, 4H), 7.21 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.15 (s,2H), 7.10 – 6.96 (m, 3H), 6.70 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.40 (t, J = 5.7 Hz, 1H),3.72 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 3.03 (t, J = 6.7 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ169.52, 148.09, 145.19, 143.38, 141.52, 137.44, 134.65, 132.06, 130.84,129.25, 127.61, 127.45, 124.16, 122.30, 120.50, 118.59, 118.00, 117.47,115.59, 115.33, 113.46, 112.08, 110.56, 40.02, 25.18.
实施例25Elmann法测定胆碱酯酶抑制活性
试验方法：
采用改良的Ellman方法评价化合物对AChE和BChE的抑制作用，其操作如下：碘化硫代乙酰胆碱 (ATCI)、碘化硫代丁酰胆碱(BTCI) 和5,5-二硫代（2-硝基苯甲酸） (DTNB)均购买自Sigma Aldrich公司。乙酰胆碱酯酶 (E.C. 3.1.1.7, V-S型，从电鳗中提取)和丁酰胆碱酯酶 (E.C.3.1.1.8，从马血清中提取) 用pH=7.2-7.4的20mM HEPES缓冲液稀释成500 units/mL的母液，-20 ℃冷冻储存，实验前用pH=7.4的磷酸盐缓冲液稀释成所需浓度，比如0.04 units/mL的丁酰胆碱酯酶溶液和0.02 units/mL的乙酰胆碱酯酶溶液。反应在96孔板中进行，先加入10 μL酶溶液（终浓度为0.01-0.05 units/mL），空白孔加入10 μL磷酸盐缓冲液 (pH=7.2-7.4)，再加入25μL待测化合物溶液（将母液用pH=7.4的磷酸盐缓冲液稀释成所需浓度）或者25μL (pH=7.2-7.4) 磷酸盐缓冲液（空白孔和100%酶孔），紧接着每孔再加入65μLpH=7.4的磷酸盐缓冲液。37 ℃ 孵育10 min后，加入100 μL 0.3 mM的DTNB （用pH=7.2-7.4磷酸盐缓冲液稀释），快速加入50 μL底物（ATCI或者BTCI，用pH=7.2-7.4磷酸盐缓冲液稀释成所需浓度，反应终浓度为1 mM），室温反应2-3 min后，立刻采用酶标仪检测在412 nm波长处的吸光度值（OD值）。所有实验至少重复三次。选取多奈哌齐和卡巴拉汀作为阳性对照药物。待测化合物采用DMSO配制成100 mM母液，DMSO终浓度< 0.4% 且不影响试验结果。
抑制率计算公式：抑制率（%）= [(对照组平均OD值-实验组平均OD值)/(对照组平均OD值-空白对照组平均OD值)]×100。IC50为半抑制浓度（或称半抑制率），是用IBMSPSS25.0软件计算得出，具体数据见表1。（上述平行实验均独立重复三次）
试验结果：
上述试验结果显示，本发明的化合物对于乙酰胆碱酯酶的抑制活性很弱，对于丁酰胆碱酯酶具有良好的抑制活性，整体而言，烷基链柔性结构的丁酰胆碱酯酶抑制活性突出，特别是7个碳链长度的胺表现出比阳性对照药更低的IC50值。
表1：所合成的化合物对乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）的抑制活性。
Figure 929801DEST_PATH_IMAGE009
Figure 860848DEST_PATH_IMAGE011
所有数据均通过三组重复的独立实验获得；IC50值由IBM SPSS Statistics 软件计算得到。-:未测试。
选择丁酰胆碱酯酶抑制活性最好的化合物HN-5, HN-6b, HN-7b, HN-24于不同浓度处理，采用改良的Ellman方法每隔2min检测一次，检测90 min内的酶动力曲线，评价其抑制类型及抑制常数。图1为所选化合物对丁酰胆碱酯酶的可逆性抑制类型曲线。图2为所选化合物对丁酰胆碱酯酶的酶动力学曲线。图3为所选化合物对丁酰胆碱酯酶的抑制常数Ki曲线。图中结果显示，所选化合物HN-5、HN-6b、HN-7b、HN-24对于丁酰胆碱酯酶的抑制类型均为混合型（竞争型和非竞争型）可逆抑制剂，其抑制常数Ki分别是52.74 nM (化合物HN-5), 24.66 nM (化合物HN-6b), 5.57 nM (化合物HN-7b), 69.12 nM (化合物HN-24), 且Ki值与IC50值相符。
实施例26MTT法测定细胞生长抑制率
试验方法：
将小鼠小胶质细胞株BV2、小鼠海马神经元细胞株HT22和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2条件下放置在细胞培养箱中培养，待细胞处于对数期时，5×105/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，37℃，5% CO2培养箱中孵育12 h。将试验化合物以不同的浓度 (10, 1.0, 0.1, 0.01μM) 加入到三个复孔中，用0.4% DMSO 作为对照。于37℃，5% CO2培养箱中孵育24 h后，每孔加入 10 μL MTT 染液(5mg/mL)，于培养箱中继续培养4 h。后吸去培养液，每孔加入 100 μLFormanzan溶解液（Formanzan用100 μL的DMSO溶解），摇匀至结晶全部溶解，在570 nm波长下利用酶标仪测定实验中96孔板各孔的吸光值（OD值），计算细胞增殖抑制率(inhibitory rate，IR)，细胞增殖抑制率%=（对照孔平均OD值-实验孔平均OD值）/（对照孔平均OD值-空白OD值），并用SPSS25.0计算半数抑制浓度IC50值(means ± SD, n=3)（上述平行实验均独立重复三次）。图4为所选化合物对小胶质细胞BV2、海马神经元细胞HT22和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的增殖抑制影响。图中结果显示，所选化合物HN-5、HN-6b、HN-7b、HN-24在丁酰胆碱酯酶抑制活性IC50范围浓度内对BV2, HT22和SH-SY5Y没有明显的细胞毒性。
实施例27MTT法测定细胞神经保护活性
试验方法：
将小鼠小胶质细胞株BV2、小鼠海马神经元细胞株HT22和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2条件下放置在细胞培养箱中培养，待细胞处于对数期时，5×105/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，37℃，5% CO2培养箱中孵育12 h。将H2O2 (250 μM), Aβ25-35(20 μM)或Aβ1-42(20 μM)其中的一种加入到三个复孔中，以PBS作为对照。于37℃，5% CO2培养箱中孵育4 h后，将试验化合物以不同的浓度 (20,10, 5, 1μM) 加入到三个复孔中，用 0.4% DMSO 作为对照。于37℃，5% CO2培养箱中孵育24 h后，每孔加入10 μL MTT 染液(5 mg/mL)，于培养箱中继续培养4 h。后吸去培养液，每孔加入 100 μLFormanzan溶解液（Formanzan用100 μL的DMSO溶解），摇匀至结晶全部溶解，在570 nm波长下利用酶标仪测定实验中96孔板各孔的吸光值（OD值），计算细胞增殖抑制率(inhibitory rate，IR)，细胞增殖抑制率%=（对照孔平均OD值-实验孔平均OD值）/（对照孔平均OD值-空白OD值），并用SPSS 25.0计算半数抑制浓度IC50值(means ± SD, n=3)（上述平行实验均独立重复三次）。图5为所选化合物对小胶质细胞BV2、小鼠海马神经元细胞HT22和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的神经保护作用。图中结果显示，所选化合物HN-5、HN-6b、HN-7b、HN-24以及母体化合物16在BV2和SH-SY5Y细胞系中，相比于H2O2刺激模型组，在10,5, 1μM时都表现出良好的神经保护作用，20 μM时可能是由于化合物自身毒性和H2O2的刺激毒性双重作用使得细胞存活率更低。在HT22细胞系中，相比于H2O2, Aβ25-35或Aβ1-42中的任一刺激因素，所选化合物在20, 10, 5, 1μM时均表现出良好的神经保护作用。总之，所选化合物具有良好的神经保护作用。
实施例28 本发明化合物对小胶质细胞BV2活性氧（ROS）爆发的影响
试验方法：
将BV2细胞以5×105个/mL的密度接种在6孔板内，每孔2mL，5% CO2，37℃培养过夜。贴壁后加入被测化合物（5,10,20 μM）。同时，LPS处理孔和control孔加入等体积的DMSO，除control孔外，其余各孔加入1.5μg/mL的LPS。培养6 h后，去除培养基，每孔加入20 μM的DCFH-DA探针溶液（采用无血清培养基配置），37 ℃避光孵育30 min。细胞用PBS洗两次，再用PBS重悬。在荧光显微镜下（485 nm的激发和530 nm发射波长）分析观察ROS爆发情况（上述平行实验均独立重复三次）。图6为所选化合物对小胶质细胞BV2活性氧（ROS）爆发的影响。图中结果显示，所选化合物HN-5、HN-6b、HN-7b、HN-24以及母体化合物16对于LPS刺激后的活性氧爆发有显著的抑制作用。
实施例29本发明化合物清除自由基的能力评价
试验方法：
采用DPPH法测定，以5-羟色胺和褪黑素（Melatonin）为阳性对照，评价化合物的氮自由基猝灭作用。所选化合物和阳性对照化合物用无水乙醇稀释成不同终浓度（20、50、100μM）加入到96孔板中，体积为100 μL/孔，control孔加入100 μL无水乙醇。再向96孔板中加入100 μL的700 μmol/L的DPPH乙醇溶液。将混合溶液震荡，避光条件下，室温反应30 min。520 nm处测量OD值。抗自由基活性计算公式为：[(AbsControl-AbsTest)/AbsControl] ×100%。EC50值由IBM SPSS Statistics 25.0计算。
采用ORAC法测定，以褪黑素和Trolox为阳性对照，评价化合物的氧自由基猝灭作用。ORAC需要设定两种对照，即没有添加自由基的荧光素钠荧光自然衰减对照（-AAPH）和没有抗氧化剂存在时的自由基作用对照（+AAPH）。所选化合物、荧光素钠盐、AAPH、Trolox均用75mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4)溶解并稀释至适当浓度，其中所选化合物、褪黑素和Trolox的测试浓度为0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 μM。ORAC反应在75mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4)体系中进行。在96孔板各微孔中分别加入所选化合物和阳性对照化合物20 μL，对照孔和空白孔加入20 μL磷酸盐缓冲液(pH=7.4)。除去空白孔外，每孔加入120 μL荧光素钠溶液（终浓度为70nM），空白孔加入120 μL磷酸盐缓冲液(pH=7.4)。在37℃下反应15 min后，用多道移液器迅速在每孔中加入60 μL AAPH溶液（终浓度为40 mM）启动反应，并将微孔板置于多功能酶标仪中在37 ℃下以激发波长485 nm，发射波长535 nm 进行连续测定，每隔1min测定一次各孔荧光强度，测定时间90 min。用Graphpad Prism 8.0处理实验数据，具体过程包括：Fluorescence intensity-time (min) 作图，求曲线下面积AUCNet AUC =AUCantioxidant – AUCblankNet AUC-Antioxidant concentration 作图，求出斜率SlopORACvalue = slopeantioxidant / slopeTrolox。
上述平行实验均独立重复三次。表2为所选化合物对自由基的清除能力。表中结果显示，化合物虽由于母体化合物16结构中的羟基被氨基甲酸酯封闭后自由基清除能力减弱，但对氮自由基均保留有一定的清除能力，对氧自由基也保留有一定的清除能力，特别是化合物HN-24具有较好的氧自由基清除能力。
表2：所选化合物对自由基的清除能力。
Figure 756122DEST_PATH_IMAGE013
所有数据均通过三组重复的独立实验获得。
母体化合物16的结构式：
Figure 696397DEST_PATH_IMAGE014
实施例30本发明化合物对海马神经元细胞HT22细胞凋亡的影响
试验方法：
（1）Hoechst染色
取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种1×104个细胞。贴壁后加药处理。实验组加入不同浓度的药物。对照组则加等量不含药物的培养液。每组3个复孔。在37℃、含5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养24h，弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4 %的多聚甲醛固定细胞，15 min后，用PBS洗去多余的固定液，加入10 μg/mL的Hoechst 33342 染液。15 min后，用PBS洗去多余的染液，并在显微镜下观察凋亡细胞的形态。图7为所选化合物对海马神经元细胞HT22细胞凋亡的Hoechst染色结果。图中结果显示，所选化合物HN-5、HN-6b、HN-7b、HN-24以及母体化合物16对凋亡细胞的形态有明显的改善作用。
（2）流式细胞术
取生长状态良好，处于对数生长期的HT22细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种1×104个细胞。在37℃、含5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后加入被测化合物（5,10,20 μM）。同时，LPS处理孔和control孔加入等体积的DMSO，除control孔外，其余各孔加入1.5μg/mL的LPS。培养24 h后收集细胞，用Annexin-V FITC/PI凋亡试剂盒对细胞染色，用流式细胞仪分析细胞凋亡。图8-1~8-4为所选化合物对海马神经元细胞HT22细胞凋亡的流式结果。图中结果显示，所选化合物HN-5、HN-6b、HN-7b、HN-24以及母体化合物16能显著抑制神经元细胞的凋亡。
（3）免疫印迹实验
取生长状态良好，处于对数生长期的HT22细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种1×104个细胞。在37℃、含5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后加入被测化合物（5,10,20 μM）。同时，LPS处理孔和control孔加入等体积的DMSO，除control孔外，其余各孔加入1.5μg/mL的LPS。待细胞培养24 h后，弃去上清液，并用预冷的PBS清洗细胞两次。然后，每孔加入200 μL裂解液，置于冰上裂解15 min后，收集所有裂解液，在4℃，12000 rpm/min的条件下离心10 min。取出10 μL上清液用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量后，将剩余的上清液与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀。然后，在沸水浴中煮10 min完成蛋白质的变性。
SDS-PAGE凝胶柱分离蛋白：将每组以30 μg的蛋白量加到8%的SDS-PAGE的凝胶孔中，冰浴条件下，80 V恒压电泳40 min后，120 V恒压电泳1 h。然后，冰浴条件下，200 mA恒流转膜1 h，将蛋白转到PVDF膜上。
蛋白条带检测：转膜结束后，对应不同分子量的蛋白，裁取相应区域的PVDF膜，用5%的脱脂牛奶封闭2 h后，将其置于一抗稀释液中，4℃孵育过夜。然后用TBST溶液洗2次后，再用二抗稀释液室温孵育2 h。最后，用TBST溶液洗2次后，加入ECL发光液，在天能多功能成像仪化学发光模块成像，并用Image J软件进行灰度分析。
图9为所选化合物对海马神经元细胞HT22细胞凋亡相关蛋白表达的影响。从图中可以看出所选化合物HN-5、HN-6b、HN-7b、HN-24以及母体化合物16能够呈浓度依赖性地抑制凋亡相关蛋白Bax, Bcl-2的表达。
实施例31 本发明化合物对炎症因子表达的影响
试验方法：
（1）所选化合物对COX-2的抑制活性
化合物用DMSO适当稀释，加入孔中的终浓度为2.5、5、10、20、40 μM。在黑色96孔板上加入各反应液，提前设置各类对照和样品孔，并按照表3所示的加样顺序依次加入待测样品和各种溶剂。加样完成后，注意不要让液体溅出板外，37℃孵育10 min。孵育完成后，各孔加入COX-2 Probe 5 μL。
Figure 360727DEST_PATH_IMAGE015
随后向各孔快速加入5μL的Substrate工作液，混匀。注：加入COX-2 Substrate工作液后反应即会开始。37℃避光孵育5min后进行荧光测定。激发波长为560nm，发射波长为590nm。计算每个样品的抑制百分率。计算公式：抑制率(%) = (RFU100%酶活性对照 - RFU样品)/(RFU100%酶活性对照 - RFU空白对照) × 100%。
表4为所选化合物对COX-2的抑制作用。从表中可以看出母体化合物16的羟基被氨基甲酸酯封闭后，所选化合物的COX-2抑制活性减弱，但其中化合物HN-6b，HN-24保留有较好的COX-2抑制活性。
Figure 728255DEST_PATH_IMAGE016
a1 μM; b参考文献: Eur. J. Med. Chem. 193 (2020) 112217; n.t.: 未测试。所有数据均通过三组重复的独立实验获得。
（2）所选化合物对NO和iNOS的抑制活性
a. NO产生抑制实验
Griess试剂盒法：取生长状态良好，处于对数生长期的BV2细胞，培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种1×104个细胞。在37℃、含5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后加入被测化合物（1, 5,10 μM）。同时，LPS处理孔和control孔加入等体积的DMSO，除control孔外，其余各孔加入1.5μg/mL的LPS。待细胞培养24 h后，按照Griess试剂盒说明，取出50 μL上清液置于新的96孔板中，先后加入50 μL Griess试剂A和Griess试剂B，室温反应5 min。最后，用酶标仪在540 nm波长处读出每个孔的OD值，计算出每个化合物的IC50。抑制率(%)=[LPS处理组(OD540)–LPS+化合物处理组(OD540)]/[LPS处理组(OD540)-空白组(OD540)]×100。
b. iNOS活性检测实验
iNOS荧光检测试剂盒法：取生长状态良好，处于对数生长期的BV2细胞，培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种1×104个细胞。在37℃、含5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后加入被测化合物（5, 10,20 μM）。同时，LPS处理孔和control孔加入等体积的DMSO，除control孔外，其余各孔加入1.5μg/mL的LPS。待细胞培养6 h后，取100 μL上清液置于新的96孔板中，每孔加入100 μL1×NOS缓冲液混匀。然后每孔再加入100 μL 1×NOS反应液（包括50 μL 2×NOS缓冲液, 39.8 μL Milli-Q 超纯水, 5 μL-L-精氨酸溶液, 5 μL0.1mM NADPH, 0.2 μL DAF-FM DA）。在培养箱中孵育2 h后，用荧光酶标仪（激发波长（AW）为495 nm和发射波长（EW）为515 nm）读出每个孔的吸光度值，计算出每个化合物的IC50。抑制率(%)=[LPS组(AW495, EW515)–LPS+化合物组(AW495, EW515)]/[LPS组(AW495, EW515)-空白组(AW495, EW515)]×100。
表5为所选化合物对NO产生和iNOS活性的影响。表中结果显示所选化合物HN-5,HN-6b, HN-7b对NO的产生有较强的抑制作用，对iNOS活性也有一定的抑制作用。
Figure 173142DEST_PATH_IMAGE017
所有数据均通过三组重复的独立实验获得。
c. 免疫印迹实验
制样：取生长状态良好，处于对数生长期的BV2细胞，培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种1×104个细胞。在37℃、含5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后加入被测化合物（1, 5,10 μM）。同时，LPS处理孔和control孔加入等体积的DMSO，除control孔外，其余各孔加入1.5μg/mL的LPS。待细胞培养24 h后，弃去上清液，并用预冷的PBS清洗细胞两次。然后，每孔加入200 μL裂解液，置于冰上裂解15 min后，收集所有裂解液，在4℃，12000rpm/min的条件下离心10 min。取出10 μL上清液用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量后，将剩余的上清液与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀。
SDS-PAGE凝胶柱分离蛋白：将与蛋白上样缓冲液混匀的裂解液置于沸水浴中煮10min，得到变性蛋白。将每组以30 μg的蛋白量加到8%的SDS-PAGE的凝胶孔中，冰浴条件下，80 V恒压电泳40 min后，120 V恒压电泳1 h。然后，冰浴条件下，200 mA恒流转膜1 h，将蛋白转到PVDF膜上。
蛋白条带检测：转膜结束后，对应不同分子量的蛋白，裁取相应区域的PVDF膜，用5%的脱脂牛奶封闭2 h后，将其置于一抗稀释液中，4℃孵育过夜。然后用TBST溶液洗2次后，再用二抗稀释液室温孵育2 h。最后，用TBST溶液洗2次后，加入ECL发光液，在天能多功能成像仪化学发光模块成像，并用Image J软件进行灰度分析。
图10为所选化合物对一氧化氮合酶、COX-2表达的影响。图中结果显示所选化合物HN-5、HN-6b、HN-7b、HN-24以及母体化合物16能呈浓度依赖性地抑制一氧化氮合酶、COX-2的表达。
（2）所选化合物对IL-1β, IL-6, TNF-α, PGE2, IL-4, IL-10产生的抑制活性
ELISA实验法：取生长状态良好，处于对数生长期的BV2细胞，培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种1×104个细胞。在37℃、含5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后加入被测化合物（1, 5,10 μM）。同时，LPS处理孔和control孔加入等体积的DMSO，除control孔外，其余各孔加入1.5μg/mL的LPS。待细胞培养24 h后，按照ELISA试剂盒说明书，分别取取100 μL上清液用于LPS诱导细胞因子包括IL-1β, IL-6, TNF-α, PGE2, IL-4,IL-10产生情况的检测。
图11为所选化合物对炎症因子表达的影响。图中结果显示所选化合物HN-5、HN-6b、HN-7b、HN-24以及母体化合物16对IL-1β, IL-6, TNF-α, PGE2的产生有浓度依赖性地抑制作用，所选化合物HN-6b、HN-7b对IL-4, IL-10的产生有良好的促进作用。
实施例32 急性毒性试验的测定
对所选化合物的急性毒性进行了研究。每组3只昆明小鼠，分别给予剂量为1000mg/kg，灌胃给药。在开始的4小时内，这些动物被持续观察，以确定是否有毒性。此后，在24小时内每隔一段时间观察这些动物，然后在接下来的7天内每天观察一次。14天后，给药组全部存活，LD50>1000mg/kg。图12为空白组与给药组（1000 mg/kg，灌胃，单次给药）的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的病理切片结果。图中结果显示与对照组相比，所选化合物处理后的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的组织病理学研究均无明显的病理变化。
实施例33 小鼠药代动力学参数的测定
试验方法：
（1）实验动物准备
C57BL/6小鼠首先在本动物房中适应一周左右，自由饮食，以消除环境对其产生的影响。选取健康雄性小鼠（20-25 g）3只，分别称取体重，釆用灌胃给药方式，剂量为10 mg/kg。在给药后取9个时间点（0.0833, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, 8 and 24 h）分别测定血药浓度，取后立即冻存至-80 ℃。小鼠在实验中禁食不禁水。且给药前禁食6-8 h。
（2）小鼠血浆样品处理
精密量取血浆样品10 µL加入2 μL甲醇，再加入200 μL 5 ng/mL（甲醇：乙腈=1:1）的内标溶液（特非那定）进行沉淀，涡旋振荡混匀60 s，低温（4 ℃）4000 rpm离心15 min。离心后每个样品精密吸取有机相转移至蒸发管中，用氮气流挥干；挥干后其残渣用甲醇/乙腈（1:1）溶解，涡混匀后用0.22μM的滤膜过滤后转移至样品瓶中，以内标法进行定量。
（3）数据统计分析
所得数据采用药代专业软件Pksolver2.0进行处理，得到准确的药代动力学参数和房室模型。
实验结果：
Figure 385949DEST_PATH_IMAGE018
化合物经小鼠药代动力学实验显示，该类化合物药代动力学参数较优。
实施例34 小鼠血脑屏障通透性测定
试验方法：
（1）实验动物准备
C57BL/6小鼠首先在本动物房中适应一周左右，自由饮食，以消除环境对其产生的影响。选取健康雄性小鼠（20-25 g）3只，分别称取体重，釆用灌胃给药方式，剂量为10 mg/kg。在给药后取1个时间点（0.75 h）测定血药浓度、脑组织中药物浓度以及脑脊液中药物浓度。样品采集后立即冻存至-80 ℃。小鼠在实验中禁食不禁水。且给药前禁食6-8 h。
（2）小鼠血浆样品处理
精密量取血浆样品10 µL加入2 μL甲醇，再加入200 μL 5 ng/mL（甲醇：乙腈=1:1）的内标溶液（特非那定）进行沉淀，涡旋振荡混匀 60 s，低温（4 ℃）4000 rpm离心15 min。离心后每个样品精密吸取有机相转移至蒸发管中，用氮气流挥干；挥干后其残渣用甲醇/乙腈（1:1）溶解，涡混匀后用0.22 μM的滤膜过滤后转移至样品瓶中，以内标法进行定量。
（3）小鼠脑组织样品处理
精密量取脑组织体积后加入其4倍体积的生理盐水，用组织匀浆仪匀浆3~5 min。精密量取上清50 μL，加入5 μL甲醇，再加入200 μL 5 ng/mL（甲醇：乙腈=1:1）的内标溶液（特非那定）进行沉淀，涡旋振荡混匀 60 s，低温（4 ℃）4000 rpm离心15 min。离心后每个样品精密吸取有机相转移至蒸发管中，用氮气流挥干；挥干后其残渣用甲醇/乙腈（1:1）溶解，涡混匀后用0.22 μM的滤膜过滤后转移至样品瓶中，以内标法进行定量。
（4）小鼠脑脊液样品处理
精密量取脑脊液3 µL加入3μL甲醇，再加入200 μL 5 ng/mL（甲醇：乙腈=1:1）的内标溶液（特非那定）进行沉淀，涡旋振荡混匀 60 s，低温（4 ℃）4000 rpm离心15 min。离心后每个样品精密吸取有机相转移至蒸发管中，用氮气流挥干；挥干后其残渣用甲醇/乙腈（1:1）溶解，涡混匀后用0.22 μM的滤膜过滤后转移至样品瓶中，以内标法进行定量。
实验结果：
Figure DEST_PATH_IMAGE019
化合物经小鼠血脑屏障通透性实验显示，该类化合物能透过血脑屏障。

Claims (9)

1.一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物，其结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中，R为甲胺，乙胺，正丙胺，正丁胺，戊胺，正己胺，庚胺，环丁胺，环戊胺，环己胺，环己甲胺，苯胺，二甲胺，二乙胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，甲基甲氧基胺，甲基苯胺，杂氮环丁烷，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，N-甲基哌嗪或咪唑；R1为苯基；R2为F、Cl、Br、烷基、烷氧基中的一种，R2在苯环上的取代位置为3位、4位、5位、6位，取代基数量为单取代。
2.根据权利要求1所述一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以5-甲氧基色胺和溴化苄为原料，以碳酸氢钠为碱，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，在氩气保护下，25~45 ℃下反应2~12 h，反应完成后，用水和乙酸乙酯萃取洗去N,N-二甲基甲酰胺，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物1；
化合物1的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
；
（2）以化合物1和三溴化硼为原料，以二氯甲烷为溶剂，在氩气保护的条件下，于-78~-20 ℃反应1~4 h，转移至室温反应2~6 h，反应完成后，缓慢滴加冰水淬灭，再加饱和碳酸氢钠中和反应液，用二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物2；
化合物2的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
；
（3）以化合物2和双(三氯甲基)碳酸酯为原料，以吡啶为碱，以二氯甲烷为溶剂，在氩气保护的条件下，于0~10 ℃反应0.5~2h后，加入胺类化合物，转移至室温反应0.5~3 h，反应完成后，缓慢滴加冰水淬灭，用二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物3；
化合物3的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
，R为甲胺，乙胺，正丙胺，正丁胺，戊胺，正己胺，庚胺，环丁胺，环戊胺，环己胺，环己甲胺，苯胺，二甲胺，二乙胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，甲基甲氧基胺，甲基苯胺，杂氮环丁烷，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，N-甲基哌嗪或咪唑；
（4）以化合物3为原料，以钯碳为催化剂，以甲醇为溶剂，在氢气条件下，于25~60 ℃反应2~12 h，反应完成后，抽滤收集滤液旋干，柱层析分离得到化合物4；
化合物4的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
，R为甲胺，乙胺，正丙胺，正丁胺，戊胺，正己胺，庚胺，环丁胺，环戊胺，环己胺，环己甲胺，苯胺，二甲胺，二乙胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，甲基甲氧基胺，甲基苯胺，杂氮环丁烷，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，N-甲基哌嗪或咪唑；
（5）以化合物4和邻氨基苯甲酸类化合物为原料，以1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐为缩合剂，以1-羟基苯并三氮唑为催化剂，以三乙胺为碱，以二氯甲烷为溶剂，在氩气条件下，于室温反应1~6 h，反应完成后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到目标产物氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物；
目标产物的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
，R为甲胺，乙胺，正丙胺，正丁胺，戊胺，正己胺，庚胺，环丁胺，环戊胺，环己胺，环己甲胺，苯胺，二甲胺，二乙胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，甲基甲氧基胺，甲基苯胺，杂氮环丁烷，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，N-甲基哌嗪或咪唑；R1为苯基；R2为F、Cl、Br、烷基、烷氧基中的一种；R2在苯环上的取代位置为3位、4位、5位、6位，取代基数量为单取代；
邻氨基苯甲酸类化合物的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
，R1为苯基；R2为F、Cl、Br、烷基、烷氧基中的一种，R2在苯环上的取代位置为3位、4位、5位、6位，取代基数量为单取代。
3.根据权利要求2所述一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，溴化苄的用量为5-甲氧基色胺摩尔量的1.5~2.0倍；碳酸氢钠的用量为5-甲氧基色胺摩尔量的2.0~2.5倍。
4.根据权利要求2所述一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，三溴化硼的用量为化合物1摩尔量的2.5~3.0倍。
5.根据权利要求2所述一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，双(三氯甲基)碳酸酯的用量为化合物2摩尔量的0.3~0.4倍；吡啶的用量为化合物2摩尔量的1~2倍。
6.根据权利要求2所述一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，胺类化合物为甲胺，乙胺，正丙胺，正丁胺，戊胺，正己胺，庚胺，环丁胺，环戊胺，环己胺，环己甲胺，苯胺，二甲胺，二乙胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，甲基甲氧基胺，甲基苯胺，杂氮环丁烷，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，N-甲基哌嗪或咪唑；胺类化合物的用量为化合物2摩尔量的1.0~1.5倍。
7.根据权利要求2所述一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，钯碳的用量为化合物3摩尔量的0.2~0.5倍。
8.根据权利要求2所述一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（5）中，邻氨基苯甲酸类化合物的用量为化合物4摩尔量的1.0倍；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐的用量为化合物4摩尔量的1.0~1.2倍；1-羟基苯并三氮唑的用量为化合物4摩尔量的0.5~1.2倍；三乙胺的用量为化合物4摩尔量的1.5~2.5倍。
9.根据权利要求1所述一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物在制备抗阿尔兹海默症药物中的应用。
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