CN114380883B - 胺烷氧基雷公藤红素衍生物及制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种胺烷氧基雷公藤红素衍生物及制备方法和用途，所述的胺烷氧基雷公藤红素衍生物的用途为制备治疗和/或预防神经退行性的相关疾病的药物；所述相关疾病为神经退行性疾病，包括：阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、血管性痴呆、神经性疼痛或进行性脊髓侧索硬化病。本发明胺烷氧基雷公藤红素衍生物具有多靶点抗AD作用、且毒性较低、可透过血脑屏障进入中枢，为研发新型安全有效的AD治疗药物奠定基础。

Description

胺烷氧基雷公藤红素衍生物及制备方法和用途
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种胺烷氧基雷公藤红素衍生物及制备方法和用途。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)，又称早老性痴呆，是一种以进行性认知功能障碍和记忆损伤为主要特征的中枢神经系统退行性疾病，现已成为继心脑血管疾病、肿瘤和中风之后的第四大威胁老年人生命的高发性疾病。我国AD患者人数已经达到600万，发病率超过5％，随着全球人口老龄化加剧及发病日趋年轻化，其发病率呈显著上升趋势，根据阿尔茨海默病国际协会(Alzheimer’s Disease International)报道，2015年全球AD患者人数约4680万，预计到2050年将达到1.315亿。由于AD临床表现主要为记忆力减退，认知和行为功能障碍，并伴有各种神经精神症状，最终导致死亡，不仅严重影响患者的日常行为能力，还给家庭和社会带来沉重的经济和心理负担。目前已批准用于治疗AD的药物包括乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，它们通过提高患者脑内乙酰胆碱水平或抑制兴奋性氨基酸的兴奋毒性缓解AD症状，但不能从根本上阻止病情的发展，并且长期服用还会出现幻觉、意识混沌、头晕、头痛、肝脏毒性和疲倦等不良反应。因此，临床上迫切需要研发出新型有效的AD治疗药物。
AD的发病机制复杂，至今尚未完全阐明。但研究表明，患者脑内乙酰胆碱水平降低、氧化应激与自由基损伤、β-淀粉样肽(β-amyloid,Aβ)的过度生成和沉积、tau蛋白过度磷酸化、金属离子代谢紊乱、Ca2+平衡失调及神经炎症反应等多种因素在AD的发病过程中具有重要作用，并以此为出发点对AD治疗药物展开大量研究。然而结果大都不尽如意，未能有效阻止疾病进程。因此，探寻新的AD治疗靶点及活性化合物迫在眉睫。
由于AD的发生发展是多种分子机制和因素共同作用的结果，传统针对单一靶点或作用机制发现的活性化合物并不能有效起到治疗作用。而中药单体大都作用于机体不同途径，具有多种药理活性，因此从中药单体出发寻找适宜的抗AD先导化合物具有很大的研究空间。雷公藤红素(celastrol)又名南蛇藤素，是从传统中药雷公藤根部分离获得的第一个五环三萜类单体化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、减肥、神经保护及抗神经退行性疾病等多种活性。其中，雷公藤红素在神经退行性相关疾病的治疗中显示出很大潜力，作用机制主要包括抑制NF-κB炎性通路和Aβ聚集、增加热休克蛋白70水平、抗氧化及神经保护，然而其作用的直接靶点并不明确。本发明人研究发现，IL1R1是雷公藤红素抗AD等神经退行性疾病的靶点。但其毒性大，且溶解性较差，限制了进一步应用，因此以雷公藤红素为先导化合物进行结构修饰改造，在改善其对IL1R1活性的基础上，增加抗乙酰胆碱酯酶活性，以期得到毒性较低、溶解性较好及活性更强的抗AD候选化合物。
发明内容
本发明提供一种胺烷氧基雷公藤红素衍生物及制备方法和用途，此种胺烷氧基雷公藤红素衍生物具有包含IL1R1在内的多靶点作用，可用于制备治疗和/或预防神经退行性相关疾病的药物。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种胺烷氧基雷公藤红素衍生物，具有如通式I所示的结构：
Figure BDA0003432448730000031
式中：n表示2-10，R1表示H、C1-10烷基；R2表示C1-10烷基、苄基或取代苄基；NR1R2也可以表示四氢吡咯基、吗啉基、哌嗪基、4-位被C1-10烷基所取代的哌嗪基、4-位被苄基或取代苄基所取代的哌嗪基、哌啶基、4-位被C1-10烷基所取代的哌啶基、4-位被苄基或取代苄基所取代的哌啶基；上述“取代苄基”是指苯环上被1～4个选自下组的基团所取代的苄基：F、Cl、Br、I、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二甲氨基、硝基、氰基等，这些取代基可在苯环的任意可能位置；R3表示甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、苄氧基、氨基、二甲氨基、二乙胺基、
Figure BDA0003432448730000032
优选的胺烷氧基雷公藤红素衍生物的制备方法包括以下步骤：
(1)雷公藤红素与A在催化剂条件下直接缩合，再与亚硫酸氢钠加成得相应的中间体B：
Figure BDA0003432448730000033
(2)由步骤(1)得到的中间体B，在溶剂和碱性条件下与二卤烷基化合物C反应，得相应的中间体D：
Figure BDA0003432448730000041
(3)由步骤(2)得到的中间体D与有机胺类化合物NHR1R2在溶剂中反应，得相应的目标物I：
Figure BDA0003432448730000042
式中：X表示为H、Cl、Br、I；Y表示为Cl、Br、I；n、R1、R2和R3的定义与胺烷氧基雷公藤红素衍生物(I)的化学结构通式相同。
优选的，所述步骤(1)中，当R3表示甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、苄氧基时，反应所用溶剂为：乙醚、乙腈、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、C3-8脂肪酮、C1-8醇；反应所用碱为：碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、三乙胺、三丁胺、三辛胺、吡啶、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、四丁基氢氧化铵；雷公藤红素：R3-X：碱的摩尔投料比为1.0:0.1～1.0:2.0～10.0；反应温度为室温～200℃；反应时间为2～72小时。
优选的，所述步骤(1)中，当R3表示氨基、二甲氨基、二乙胺基、
Figure BDA0003432448730000043
Figure BDA0003432448730000044
时，反应所用缩合剂为：DCC、DIC、EDCI、DPP、DPP-Cl、DPPA、HATU、HBTU、HCTU、TBTU、TSTU、TNTU、BOP、PyBOP；反应所用催化剂为：HOAT、HOBT、DMAP、DIPEA、4-PPY、NHPI、NHNI；反应所用溶剂为：乙醚、乙腈、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、C3-8脂肪酮、C1-8醇；雷公藤红素：缩合剂：催化剂：R3-X的摩尔投料比为1.0:2.0～10.0:2.0～10.0:1.0～10.0；反应温度为室温～200℃；反应时间为2～72小时。
优选的，所述步骤(2)中，反应所用溶剂为：乙醚、乙腈、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、C3-8脂肪酮；反应所用碱为：碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、三乙胺、三丁胺、三辛胺、吡啶、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、四丁基氢氧化铵；中间体B：二卤烷基化合物C：碱的摩尔投料比为1.0:1.0～10.0:1.0～10.0；反应温度为室温～200℃；反应时间为1～72小时。
优选的，所述步骤(3)中，反应所用溶剂为：乙醚、乙腈、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、C3-8脂肪酮、C1-8醇；中间体D：有机胺类化合物NR1R2的摩尔投料比为1.0:1.0～10.0；反应温度为室温～200℃；反应时间为1～72小时。
优选的，一类药物组合物，包含所述的胺烷氧基雷公藤红素衍生物。
优选的，该药物组合物进一步含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
优选的，所述的胺烷氧基雷公藤红素衍生物作为活性成分占总重量比5％～99.5％。
优选的，胺烷氧基雷公藤红素衍生物的用途为制备治疗和/或预防神经退行性的相关疾病的药物；所述相关疾病为神经退行性疾病，包括：阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、血管性痴呆、神经性疼痛或进行性脊髓侧索硬化病。
本发明有益效果为：所公开的药物组合物包括治疗有效剂量的一种或多种胺烷氧基雷公藤红素衍生物，该药物组合物可进一步含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。所述“治疗有效量”是指引起研究人员或医生所针对的组织、动物的生物或医药反应的药物或药剂的量；所述“组合物”是指将一种以上的物质或组分混合而成的产品；所述“药学上可接受的载体或赋形剂”是指药学上可接受的物质、组合物或载体，如：液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊物质；本发明提供的药物组合物理想比例为，胺烷氧基雷公藤红素衍生物作为活性成分占总重量比2％～99.5％，其余部分为占总重量比98％以下。
本发明首次公开了一种胺烷氧基雷公藤红素衍生物、其制备方法、及新的作用靶点IL1R1，药理实验表明，本发明胺烷氧基雷公藤红素衍生物具有多靶点抗AD作用、且毒性较低、可透过血脑屏障进入中枢，为研发新型安全有效的AD治疗药物奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1、雷公藤红素与受体a活性位点相互作用图；
图2、雷公藤红素与受体b活性位点相互作用图；
图3、雷公藤红素与受体c活性位点相互作用图；
图4、胺烷氧基雷公藤红素衍生物对APP/PS-1双转基因AD小鼠行为学的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：中间体B的制备通法
将雷公藤红素(0.2mmol)搅拌溶解于DMF(4mL)中，随后加入碳酸氢钠(1.0mmol)和R3-Br(0.1mmol)，室温搅拌12.0～48.0小时，TLC监测反应进程。反应结束后，加入1mol/L盐酸淬灭，加入去离子水，用乙酸乙酯萃取，有机层合并后用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝20/1)；当羧基端进行酰胺化反应时，将雷公藤红素(0.2mmol)搅拌溶解于DMF(4mL)中，随后加入EDCI(1.0mmol)、HOBT(1.0mmol)和胺类化合物(0.2mmol)，其余步骤同前；随后将上述纯化残余物溶解于甲醇中，氮气条件下加入亚硫酸氢钠水溶液，室温反应2.0～12.0小时，TLC监测反应进程。反应结束后，减压蒸除溶剂，残余物经吡啶溶解后过滤，滤液减压蒸除溶剂，得中间体B。
实施例2：中间体D的制备通法
将雷公藤红素(1.0mmol)、无水碳酸钾(3.0mmol)和丙酮(5mL)加入反应瓶中，搅拌均匀后滴加相应的二溴代烷(3.0mmol)，滴毕，氩气保护下回流搅拌2.0～24.0小时，TLC监测反应进程。反应结束后，趁热过滤，适量丙酮洗涤滤饼，滤液减压蒸除溶剂，残余物加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机层合并后用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝15/1)，得中间体D。
实施例3：胺烷氧基雷公藤红素衍生物(I)的制备通法
将中间体D(1.0equiv.)、无水碳酸钾(1.5equiv.)、乙腈和有机胺类化合物(1.5equiv.)加入反应瓶中，氩气保护下回流搅拌4.0～24.0小时，TLC监测反应进程。反应结束后，减压蒸除溶剂，残余物中加入二氯甲烷，依次用5％氢氧化钠水溶液、去离子水和饱和氯化钠水溶液洗涤，有机层经无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压蒸除溶剂，所得粗品经制备薄层分离纯化得相应的胺烷氧基雷公藤红素衍生物(I)，收率40.0～80.0％，化学结构均经1H-NMR和HR-MS确证，所得目标物的纯度经HPLC检测均大于95％。采用此通法制备得到的目标物结构如下(只列举了n＝2时的化合物，n＝3,4,6时，R1、R2、R3的取代基与n＝2时相同)：
Figure BDA0003432448730000081
Figure BDA0003432448730000091
Figure BDA0003432448730000101
Figure BDA0003432448730000111
Figure BDA0003432448730000121
部分化合物分析数据：
(1)化合物I-1:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.60(s,1H),5.68(s,1H),5.35(s,3H),4.96(s,1H),4.11(t,J＝6.8Hz,2H),3.68(s,3H),2.76(t,J＝6.8Hz,2H),2.64(q,J＝6.5Hz,2H),2.26(s,3H),2.13(t,J＝5.8Hz,1H),2.08(s,3H),1.78(s,3H),1.74(s,3H),1.59(t,J＝5.4Hz,1H),1.57(t,J＝5.8Hz,1H),1.56(t,J＝6.8Hz,2H),1.53(t,J＝6.8Hz,2H),1.46(t,J＝6.8Hz,2H),1.39(t,J＝5.4Hz,1H),1.38(s,3H),1.32-1.35(m,2H),1.09(s,3H),1.04(s,3H),1.02(t,J＝6.6Hz,3H).HR-ESI-MS:Calcd.for C40H55NNaO7S[M+H]+:716.3597,found:716.3593.
(2)化合物I-6:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.60(s,1H),5.68(s,1H),5.35(s,3H),4.96(s,1H),4.11(t,J＝6.8Hz,2H),3.24(q,J＝6.5Hz,2H),3.24(q,J＝6.5Hz,2H),2.76(t,J＝6.8Hz,2H),2.64(q,J＝6.5Hz,2H),2.26(s,3H),2.13(t,J＝5.8Hz,1H),2.08(s,3H),1.78(s,3H),1.74(s,3H),1.59(t,J＝5.4Hz,1H),1.57(t,J＝5.8Hz,1H),1.56(t,J＝6.8Hz,2H),1.53(t,J＝6.8Hz,2H),1.46(t,J＝6.8Hz,2H),1.39(t,J＝5.4Hz,1H),1.38(s,3H),1.32-1.35(m,2H),1.09(s,3H),1.08(t,J＝6.6Hz,3H),1.08(t,J＝6.6Hz,3H),1.04(s,3H),1.02(t,J＝6.6Hz,3H).HR-ESI-MS:Calcd.for C43H61N2NaO6S[M+H]+:756.4148,found:756.4153.
(3)化合物I-9:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.22(s,1H),7.01(s,1H),6.80(s,1H),6.79(s,1H),6.60(s,1H),5.68(s,1H),5.35(s,3H),4.96(s,1H),4.11(t,J＝6.8Hz,2H),3.83(s,3H),3.68(s,3H),3.66(s,J＝6.5Hz,2H),2.76(t,J＝6.8Hz,2H),2.26(s,3H),2.13(t,J＝5.8Hz,1H),2.08(s,3H),1.78(s,3H),1.74(s,3H),1.59(t,J＝5.4Hz,1H),1.57(t,J＝5.8Hz,1H),1.56(t,J＝6.8Hz,2H),1.53(t,J＝6.8Hz,2H),1.46(t,J＝6.8Hz,2H),1.39(t,J＝5.4Hz,1H),1.38(s,3H),1.32-1.35(m,2H),1.09(s,3H),1.04(s,3H).HR-ESI-MS:Calcd.for C41H56NNaO8S[M+H]+:745.3624,found:745.3621.
(4)化合物I-14:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.22(s,1H),7.01(s,1H),6.80(s,1H),6.79(s,1H),6.60(s,1H),5.68(s,1H),5.35(s,3H),4.96(s,1H),4.11(t,J＝6.8Hz,2H),3.83(s,3H),3.68(s,3H),3.66(s,J＝6.5Hz,2H),3.24(q,J＝6.5Hz,2H),3.24(q,J＝6.5Hz,2H),2.76(t,J＝6.8Hz,2H),2.26(s,3H),2.13(t,J＝5.8Hz,1H),2.08(s,3H),1.78(s,3H),1.74(s,3H),1.59(t,J＝5.4Hz,1H),1.57(t,J＝5.8Hz,1H),1.56(t,J＝6.8Hz,2H),1.53(t,J＝6.8Hz,2H),1.46(t,J＝6.8Hz,2H),1.39(t,J＝5.4Hz,1H),1.38(s,3H),1.32-1.35(m,2H),1.09(s,3H),1.08(t,J＝6.6Hz,3H),1.08(t,J＝6.6Hz,3H),1.04(s,3H).HR-ESI-MS:Calcd.for C44H63N2NaO7S[M+H]+:786.4254,found:786.4258.
(5)化合物I-33:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.60(s,1H),5.68(s,1H),5.35(s,3H),4.96(s,1H),4.11(t,J＝6.8Hz,2H),3.68(s,3H),2.82(s,3H),2.82(s,3H),2.76(t,J＝6.8Hz,2H),2.64(q,J＝6.5Hz,2H),2.13(t,J＝5.8Hz,1H),2.08(s,3H),1.78(s,3H),1.74(s,3H),1.59(t,J＝5.4Hz,1H),1.57(t,J＝5.8Hz,1H),1.56(t,J＝6.8Hz,2H),1.53(t,J＝6.8Hz,2H),1.46(t,J＝6.8Hz,2H),1.39(t,J＝5.4Hz,1H),1.38(s,3H),1.32-1.35(m,2H),1.09(s,3H),1.04(s,3H),1.02(t,J＝6.6Hz,3H).HR-ESI-MS:Calcd.for C34H51NNaO7S[M+H]+:640.3284,found:640.3289.
(6)化合物I-38:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.60(s,1H),5.68(s,1H),5.35(s,3H),4.96(s,1H),4.11(t,J＝6.8Hz,2H),3.24(q,J＝6.5Hz,2H),3.24(q,J＝6.5Hz,2H),2.82(s,3H),2.82(s,3H),2.76(t,J＝6.8Hz,2H),2.64(q,J＝6.5Hz,2H),2.13(t,J＝5.8Hz,1H),2.08(s,3H),1.78(s,3H),1.74(s,3H),1.59(t,J＝5.4Hz,1H),1.57(t,J＝5.8Hz,1H),1.56(t,J＝6.8Hz,2H),1.53(t,J＝6.8Hz,2H),1.46(t,J＝6.8Hz,2H),1.39(t,J＝5.4Hz,1H),1.38(s,3H),1.32-1.35(m,2H),1.09(s,3H),1.08(t,J＝6.6Hz,3H),1.08(t,J＝6.6Hz,3H),1.04(s,3H),1.02(t,J＝6.6Hz,3H).HR-ESI-MS:Calcd.for C37H57N2NaO6S[M+H]+:680.3835,found:680.3830.
(7)化合物I-89:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.60(s,1H),5.68(s,1H),5.35(s,3H),4.96(s,1H),4.11(t,J＝6.8Hz,2H),3.68(s,3H),2.76(t,J＝6.8Hz,2H),2.64(q,J＝6.5Hz,2H),2.45(t,J＝6.8Hz,2H),2.45(t,J＝6.8Hz,2H),2.13(t,J＝5.8Hz,1H),2.08(s,3H),1.78(s,3H),1.74(s,3H),1.59(t,J＝5.4Hz,1H),1.57(t,J＝5.8Hz,1H),1.56(t,J＝6.8Hz,2H),1.53(t,J＝6.8Hz,2H),1.53-1.59(m,2H),1.46(t,J＝6.8Hz,2H),1.39(t,J＝5.4Hz,1H),1.38(s,3H),1.32-1.35(m,2H),1.09(s,3H),1.04(s,3H),1.02(t,J＝6.6Hz,3H).HR-ESI-MS:Calcd.for C37H55NNaO7S[M+H]+:680.3597,found:680.3591.
(8)化合物I-94:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.60(s,1H),5.68(s,1H),5.35(s,3H),4.96(s,1H),4.11(t,J＝6.8Hz,2H),3.24(q,J＝6.5Hz,2H),3.24(q,J＝6.5Hz,2H),2.76(t,J＝6.8Hz,2H),2.64(q,J＝6.5Hz,2H),2.45(t,J＝6.8Hz,2H),2.45(t,J＝6.8Hz,2H),2.13(t,J＝5.8Hz,1H),2.08(s,3H),1.78(s,3H),1.74(s,3H),1.59(t,J＝5.4Hz,1H),1.57(t,J＝5.8Hz,1H),1.56(t,J＝6.8Hz,2H),1.53(t,J＝6.8Hz,2H),1.53-1.59(m,2H),1.46(t,J＝6.8Hz,2H),1.39(t,J＝5.4Hz,1H),1.38(s,3H),1.32-1.35(m,2H),1.09(s,3H),1.08(t,J＝6.6Hz,3H),1.08(t,J＝6.6Hz,3H),1.04(s,3H),1.02(t,J＝6.6Hz,3H).HR-ESI-MS:Calcd.for C40H61N2NaO6S[M+H]+:720.4148,found:720.4152.
实施例4：胺烷氧基雷公藤红素衍生物(I)体外生物活性测试
1、胺烷氧基雷公藤红素衍生物(I)对AChE的抑制活性
参照文献(Luo，L.et al.Bioorganic&Medicinal Chemistry,2017,25,1997-2009)报道的方法进行测定：将待测化合物用DMSO配成2.5×10-3mol/L的储备液，测定时根据需要用PBS缓冲液(pH＝7.4)稀释至不同浓度，向96孔板中依次加入1mmol/L碘化硫代乙酰胆碱30μL，pH＝8.0的PBS缓冲液40μL，待测化合物溶液20μL(DMSO含量小于1％)和0.05U/mL电鳗乙酰胆碱酯酶10μL，加毕混匀后，37℃孵育15min，取出，向各孔中加入0.2％的5,5'-二硫代-双(2-硝基)苯甲酸溶液30μL显色，酶标仪测定412nm处各孔的光密度(OD值)。以未加化合物的测定组作为空白组，化合物测定组OD值与空白组OD相比，降低的百分率即为酶抑制率[酶抑制率＝(1－样品组OD值/空白组OD值)×100％]。测定化合物多个不同浓度下的酶抑制率，计算IC50值，每组实验独立重复三次。测试结果表明，本发明实施例中所公开的胺烷氧基雷公藤红素衍生物(I)对AChE具有较好的抑制活性，部分受试化合物的IC50值见下表，所用对照药物雷公藤红素和多奈哌齐在相同浓度下对AChE的抑制率分别为50.90±2.81μM和0.022±0.001μM。
Figure BDA0003432448730000161
2、胺烷氧基雷公藤红素衍生物(I)对Aβ1-42自身聚集的抑制活性
参照文献(Luo，L.et al.Bioorganic&Medicinal Chemistry,2017,25,1997-2009)报道的方法进行测定：在室温条件下将Aβ1-42三氟乙酸盐(1mg)溶于1mL六氟异丙醇中，超声5min后，室温孵育24h，减压蒸除溶剂，用1mL DMSO溶解，配成200μM的Aβ1-42储备液，于-80℃储存备用，使用前用50mM的PBS缓冲液(pH＝7.4)稀释至50μM；待测化合物用1mLDMSO溶解，配成2.5mM储备液，使用前用50mM的PBS缓冲液(pH＝7.4)稀释至50μM；取Aβ1-42溶液20μL+待测化合物溶液20μL、Aβ1-42溶液20μL+PBS缓冲液20μL(含2％DMSO)、PBS缓冲液20μL(含2％DMSO)+PBS缓冲液20μL(含25％DMSO)于黑色96孔板中，化合物和Aβ1-42的最终浓度均为25μM。37℃孵育24h，然后加入160μL含有5μM硫黄素T的50mM的甘氨酸-NaOH缓冲液(pH＝8.5)，振摇5s后立即用多功能酶标仪在446nm激发波长和490nm发射波长下固定5min扫描，并记录结果。Aβ1-42+待测化合物的荧光值记录为IFi，Aβ1-42+PBS缓冲液的荧光值记录为IFc，只含有PBS缓冲液的荧光值记录为IF0，化合物抑制Aβ1-42自身聚集的抑制率计算公式为：100-(IFi-IF0)/(IFc-IF0)×100，以姜黄素为阳性对照，每个化合物每个浓度平行测定两孔。测试结果表明，本发明实施例中所公开的胺烷氧基雷公藤红素衍生物(I)对Aβ1-42自身聚集具有较好的抑制活性，在25μM浓度下部分受试化合物抑制率见下表，所用对照药物雷公藤红素和姜黄素在相同浓度下对Aβ1-42自身聚集的抑制率分别为44.8％和38.2％。
Figure BDA0003432448730000171
3、胺烷氧基雷公藤红素衍生物(I)的抗氧化活性
参照文献(Luo，L.et al.Bioorganic&Medicinal Chemistry,2017,25,1997-2009)报道的方法进行测定：6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)用75mM的PBS缓冲液(pH＝7.4)配成10-80μmol/L的溶液，现配现用；2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(AAPH)在使用前用75mM的PBS缓冲液(pH＝7.4)配成40mmol/L的溶液，现配现用；荧光素(Fluorescein)用75mM的PBS缓冲液(pH＝7.4)配成250nmol/L的溶液，现配现用。向黑色96孔板中加入50或10μmol/L的化合物溶液20μL和荧光素溶液120μL，混匀，37℃孵育15min，加入AAPH溶液60μL，使每孔总体积为200μL，放置振荡器上振荡1min混匀，37℃孵育15min后，通过Varioskan Flash Multimode Reader(Thermo Scientific)酶标仪的自动加样器加入40mmol/L的AAPH溶液60μL，振摇30s后，在激发波长485nm和发射波长535nm条件下每分钟读取一次荧光值，连续测定90min。通过仪器自动计算出荧光衰减曲线下面积AUC，其中以1-8μmol/L的Trolox作为标准，FL+PBS缓冲液+AAPH为空白，化合物的抗氧化活性结果表达为Trolox的当量，计算公式为：[(AUC Sample-AUC blank)/(AUC Trolox-AUC blank)]/[(concentration of Trolox/concentration of sample)]，每个化合物每个浓度平行测定两孔，每组实验独立重复三次。测试结果表明，本发明实施例中所公开的部分胺烷氧基雷公藤红素衍生物(I)的抗氧化活性见下表，所用对照药物雷公藤红素和姜黄素在相同浓度下的抗氧化活性分别为1.48和2.41。
Figure BDA0003432448730000181
其中图1示出了雷公藤红素与受体a活性位点相互作用图，图2示出了雷公藤红素与受体b活性位点相互作用图，图3示出了雷公藤红素与受体c活性位点相互作用图。
实施例5：胺烷氧基雷公藤红素衍生物(I)对动物行为的影响
1、实验材料
实验动物为APP/PS-1双转基因AD小鼠和野生型正常对照鼠(WT)。饲养于恒温(24±2℃)、恒湿(50-60％)、自然光照明及通风良好的动物室内，自由进水进食。所有实验程序符合空军军医大学动物使用与管理委员会规定。
2、实验方法
(1)旷场实验(open field test)：旷场反应箱是一个配有光照和换气装置的隔音箱，尺寸为30×30×30cm3。四周和底部为透明的树脂玻璃的方形盒子，共四个，在箱子内部上方有一视野可覆盖整个旷场内部的数码摄像头，实验前，先设置好相关参数，实验时，小鼠被放于盒子中央区，同时开启摄像头记录小鼠的活动情况，每个箱子每次放一只小鼠。让小鼠自由活动15min，识别轨迹，导出相关指标，记录的指标包括小鼠在实验箱总活动路程、平均速度和中央区活动时间。我们定义实验箱底部正中间的15×15cm2区域为中央区，约占整个面积的四分之一。每次实验结束后，用酒精清洗箱子内壁，以免动物残留的气味对后续实验造成影响。
(2)Morris水迷宫实验(Morris water maze test)：将水池分成东南西北四个区域，倒入不透明剂Lytron621，使液面高出其下隐藏的小平台1-2cm。训练时每次把小鼠随机的从其中一个区域面朝池壁放入水池中，让动物在水池内游泳直到找到隐藏在水面下的平台为止。每次训练时间为90s，找到平台后允许动物在平台上滞留30s，如果动物在规定时间内没有找到平台，则帮助其找到平台，每次训练间隔时间为30s，每天训练两次，实验一共进行7d。摄像记录动物的行为，软件分析动物找到平台每次所花的时间、游泳轨迹和游泳速度等。
(3)高架十字迷宫实验(elevated plus-maze test,EPM)：测试前，先用手抚摸小鼠5min，消除其紧张情绪，检测时，将小鼠头部正对开臂放置于高架十字迷宫的中央区，立即拉紧布帘，离开测试区，保持实验区安静，开始检测，高架上方的摄像头记录5min内小鼠进入开、闭臂次数和滞留时间。采用小鼠进入开、闭臂的次数和小鼠在开臂活动时间占在两臂活动总时间的百分比两个行为学指标评价小鼠焦虑样作用。实验过程中小鼠一足撤出某一臂则表示本次活动的完成，每次测试完要及时清洁迷宫，减少对下一次测试的影响。
3、实验结果
图4示出了胺烷氧基雷公藤红素衍生物对APP/PS-1双转基因AD小鼠行为学的影响。将上述综合活性较好的化合物I-1用生理盐水溶解后，分别制成1.0mg/kg(低剂量)、10.0mg/kg(中剂量)和100mg/kg(高剂量)浓度，对5月龄的正常或APP/PS-1双转基因AD小鼠连续灌胃化合物I-1四周，每天1次。我们发现在旷场实验中，中、高剂量的化合物I-1能明显减少AD模型小鼠的总路程和中央活动时间，图4中的A，B，C显示旷场实验，胺烷氧基雷公藤红素衍生物降低AD模型小鼠的总路程和中央活动时间；在Morris水迷宫实验中，随着训练次数的增加，灌胃不同剂量化合物I-1的AD模型小鼠能快速找到隐藏于水面的平台，并且穿越平台的次数和停留时间也明显增加，说明其空间记忆得到提高，图4中的D，E，F显示Morris水迷宫实验，胺烷氧基雷公藤红素衍生物提高AD模型小鼠的空间记忆；在高架十字迷宫实验中，中、高剂量的化合物I-1可以显著增加AD模型小鼠的开臂滞留时间和进入开臂次数，但进入开臂和闭臂的总次数没有明显改变，图4中的G，H，I显示高架十字迷宫实验，胺烷氧基雷公藤红素衍生物增加AD模型小鼠的开臂滞留时间和进入开臂次数，但进入闭臂总次数没有明显改变。这些行为学结果表明，长期给予胺烷氧基雷公藤红素衍生物可以明显减少AD小鼠的活动过度，改善小鼠认知功能。通过合理开发胺烷氧基雷公藤红素衍生物，制成适当剂型，可望在临床治疗AD提供新的药物。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种胺烷氧基雷公藤红素衍生物，其特征在于：具有如通式I所示的结构：
Figure QLYQS_1
式中：n表示2-10，R1表示H、C1-10烷基；R2表示C1-10烷基、苄基或取代苄基；NR1R2也可以表示四氢吡咯基、吗啉基、哌嗪基、4-位被C1-10烷基所取代的哌嗪基、4-位被苄基或取代苄基所取代的哌嗪基、哌啶基、4-位被C1-10烷基所取代的哌啶基、4-位被苄基或取代苄基所取代的哌啶基；上述“取代苄基”是指苯环上被1~4个选自下组的基团所取代的苄基：F、Cl、Br、I、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二甲氨基、硝基、氰基，这些取代基可在苯环的任意可能位置；R3表示甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、苄氧基、氨基、二甲氨基、二乙胺基、/>
Figure QLYQS_2
、/>
Figure QLYQS_3
。
2.一种制备方法，用于制备权利要求1所述的胺烷氧基雷公藤红素衍生物，其特征在于包括以下步骤：
（1）雷公藤红素与A在催化剂条件下直接缩合，再与亚硫酸氢钠加成得相应的中间体B：
Figure QLYQS_4
（2）由步骤（1）得到的中间体B，在溶剂和碱性条件下与二卤烷基化合物C反应，得相应的中间体D：
Figure QLYQS_5
（3）由步骤（2）得到的中间体D与有机胺类化合物NHR1R2在溶剂中反应，得相应的目标物I：
Figure QLYQS_6
式中：X表示为H、Cl、Br、I；Y表示为Cl、Br、I；n、R1、R2和R3的定义与胺烷氧基雷公藤红素衍生物（I）的化学结构通式相同；
所述步骤（1）中，当R3表示氨基、二甲氨基、二乙胺基、
Figure QLYQS_7
、/>
Figure QLYQS_8
时，反应所用缩合剂为：DCC、DIC、EDCI、DPP、DPP-Cl、DPPA 、HATU、HBTU、HCTU、TBTU、TSTU、TNTU、BOP、PyBOP；反应所用催化剂为：HOAT、HOBT、DMAP、DIPEA、4-PPY、NHPI、NHNI；反应所用溶剂为：乙醚、乙腈、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、N, N-二甲基甲酰胺、C3-8脂肪酮、C1-8醇；雷公藤红素：缩合剂：催化剂：R3-X的摩尔投料比为1.0:2.0~10.0:2.0~10.0:1.0~10.0；反应温度为室温~200℃；反应时间为2~72小时。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，当R3表示甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、苄氧基时，反应所用溶剂为：乙醚、乙腈、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、N, N-二甲基甲酰胺、C3-8脂肪酮、C1-8醇；反应所用碱为：碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、三乙胺、三丁胺、三辛胺、吡啶、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、四丁基氢氧化铵；雷公藤红素：R3-X：碱的摩尔投料比为1.0: 0.1~1.0:2.0~10.0；反应温度为室温~200℃；反应时间为2~72小时。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，反应所用溶剂为：乙醚、乙腈、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、N, N-二甲基甲酰胺、C3-8脂肪酮；反应所用碱为：碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、三乙胺、三丁胺、三辛胺、吡啶、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、四丁基氢氧化铵；中间体B：二卤烷基化合物C：碱的摩尔投料比为1.0:1.0~10.0:1.0~10.0；反应温度为室温~200℃；反应时间为1~72小时。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，反应所用溶剂为：乙醚、乙腈、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、N, N-二甲基甲酰胺、C3-8脂肪酮、C1-8醇；中间体D：有机胺类化合物NR1R2的摩尔投料比为1.0:1.0~10.0；反应温度为室温~200℃；反应时间为1~72小时。
6.一类药物组合物，其特征在于：包含权利要求1所述的胺烷氧基雷公藤红素衍生物；所述的胺烷氧基雷公藤红素衍生物作为活性成分占总重量比5%~99.5%。
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