CN108272791A - 漆黄素在制备抑制Tau蛋白异常聚集的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化合物漆黄素的新用途，特别是在多种由Tau蛋白异常聚集而引起的神经退行性疾病中的应用。本发明通过实验证明了漆黄素能够有效抑制Tau蛋白纤维的形成，并且对已成型的纤维具备解聚作用，同时利用计算机分子对接，确认了漆黄素不仅能跟Tauk18蛋白单体结合，同时能够结合在Tau蛋白纤维的核心部分。以上结果表明，漆黄素可用于制备预防或治疗与Tau蛋白异常聚集相关的多种神经退行性疾病的药物、功能食品和保健品。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，特别涉及漆黄素在制备抑制Tau蛋白异常聚集的药物中的应用。
背景技术
我国目前老龄化程度越来越高，老年神经退行性疾病患者逐年递增，给患者家庭和社会带来沉重痛苦和负担。研究开发有效地预防和治疗神经退行性疾病的药物刻不容缓。神经退行性疾病往往是由于神经元结构改变、功能退化、甚至凋亡等所造成，而引发这些神经元病变的原因之一就是相关蛋白异常聚集纤维化，包括α-突触核蛋白、Tau蛋白、β-淀粉样蛋白等。常见的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹、皮克病、帕金森病等。
Tau蛋白是一种微管相关蛋白，其主要生理功能是诱导促进微管成束，维持微管的稳定，驱动神经元轴突的生长等。一旦发生异常修饰化、基因突变、其他分子诱导等，Tau 蛋白将直接参与病理进程，转变为寡聚体或纤维丝或神经纤维缠结，从而损害神经系统的正常功能执行。随着针对清除Aβ以及其淀粉样聚集物的相关药物的临床实验相继失败，近几年的研究重点逐渐从Aβ蛋白转移到Tau蛋白上。针对Tau蛋白的病理进行治疗或许比针对Aβ更有利于改善疾病症状。
Tau蛋白在体外可以由肝素钠诱导，自身聚集形成纤维，从而模拟体内Tau蛋白异常聚集产生神经纤维缠结。硫黄素T(ThT)能够结合在纤维的β结构上从而发射荧光，故可以通过ThT的荧光值追踪Tau蛋白的纤维化过程。因此，可以通过往体外Tau蛋白纤维化的过程中添加目标化合物，再通过荧光和显微镜技术，观察纤维的形成或解聚情况，从而可作为体外药物筛选的依据。Tau k18是Tau蛋白中很重要的一段，既是Tau结合微管蛋白的重要区域，还是其纤维化的核心部分。因此选择Tau k18蛋白作为抗聚集或纤维化的药物筛选模型，可以代表Tau蛋白。
多种黄酮类化合物可通过拮抗淀粉样蛋白的纤维化、寡聚化作用，影响其稳定性，能够减缓神经元的凋亡、神经炎症、抗氧化应激、突触连接的丧失等。因此，以黄酮为骨架的化合物类具备作为神经退行性疾病药物开发的良好潜能。
漆黄素是一种植物多酚，也是黄酮类化合物，像其他类黄酮，具有平面结构，具有多个碳环。由于其提供电子的能力，也能够清除自由基，漆黄素也能够增强学习和记忆，减少神经元细胞死亡并抑制氧化应激。这些文献均证明了漆黄素对痴呆具有一定的医疗用途，但是目前漆黄素对于以Tau蛋白为靶点的作用尚未清楚，所以对于引入漆黄素治疗神经退行性疾病具有重大的现实意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种漆黄素在Tau蛋白异常聚集引起的神经退行性疾病中的应用，其旨在提供一种预防或治疗神经退行性疾病中的药物、功能食品或保健品。同时提供一种漆黄素的新用途。
本发明的有益技术效果是：发明人以Tau蛋白的生理和病理核心—Tauk18片段为研究对象，通过实验证明了漆黄素在抑制Tau蛋白自身聚集和促使Tau蛋白纤维解聚方面的作用显著。
通过建立体外ThT荧光检测Tauk18蛋白聚集的实验，发现漆黄素加入后能够显著降低ThT荧光值，并且呈现良好的剂量相关性。同时利用透射电镜观察到，在漆黄素的作用下，肝素钠诱导的Tauk18蛋白纤维数量显著减少，并且纤维的完整性被破坏。同时，为模拟Tau蛋白纤维化的不同病理阶段，在Tauk18聚集过程中不同时间段加入漆黄素，发现从几个时间段加入漆黄素后均能降低ThT荧光值，即抑制Tauk18纤维的增长，尤其在纤维未充分形成之前效果最显著。最后，通过了计算机仿真模拟分子对接，获取了漆黄素对接Tau k18蛋白单体和Tau蛋白纤维的核心结构部分，辅助证明了漆黄素和二者之间均具有结合作用和潜在的结合位点。这些结果表明，漆黄素能够抑制Tau蛋白聚集并解聚Tau 蛋白纤维，可用于预防或治疗由Tau蛋白异常聚集而引发的神经退行性疾病。
附图说明
图1为漆黄素化学结构式。
图2为不同浓度的漆黄素对Tauk18蛋白纤维化的抑制作用结果。
图3为漆黄素抑制Tau K18蛋白纤维化的透射电镜图。
图4为不同时间段加药对Tau K18纤维化的抑制结果。
图5为漆黄素与Tau k18蛋白单体的分子对接结果。
图6为漆黄素与Tau蛋白纤维核心部分的分子对接结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步说明。
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
主要实验仪器：全波长多功能酶标仪(美国，Biotek)，冷冻离心机(美国，Labconco)，电子天平(德国，Sartorius)，多通道移液器(德国，Eppendorf)，酸度计(美国，Mettler Toledo)。
主要实验材料：Tauk18蛋白(深圳大学化学生物学实验室表达纯化)，漆黄素(美国，Med Chem Express)，硫磺素T(上海源叶生物科技有限公司)，肝素钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，DTT(生工生物工程股份有限公司)，Tris碱(北京索莱宝科技有限公司)。
实施例1不同浓度的漆黄素对Tau K18蛋白纤维化的抑制作用。
获取纯化的Tauk18蛋白冻干品，精密称量，用Tris-HCl Buffer(pH7.4)溶解，配制成3mg/mL左右的蛋白母液，再用BCA定量，记录准确浓度。精密称量漆黄素，用DMSO 配制成高浓度药物母液(约20mg/mL)，再依次用DMSO稀释成表2中5种浓度。然后，按照表2中实验设计，将其余相应试剂加入96孔黑色板中，每种浓度设置3个复孔。并按照表1中相关设置程序，将样品放进酶标仪(Biotek SynergyH1)中连续孵育，定时跟踪监测各孔中样品对应的动态荧光值。导出数据，绘制动力学反应曲线。
表1酶标仪关键参数设置
表2不同浓度漆黄素对肝素钠诱导Tau k18蛋白纤维化实验分组
结果如图1(A)所示，不同浓度的漆黄素加入后，均可降低ThT荧光值，说明对抑制Tauk18纤维化均有效果。并且该抑制效果与漆黄素的剂量呈明显的相关性，如图2(B) 所示。在对荧光实验数据进一步统计后，绘制了图2(C)，获取剂量相应曲线，线性相关系良好，并通过拟合公式，求得漆黄素对Tauk18纤维化的IC50值为51.2μM。
实施例2漆黄素抑制Tauk18蛋白纤维化的透射电镜实验。
利用透射电镜(TEM)可以直观观察到经过不同加药处理的样品纤维化情况，可作为 ThT荧光实验的有力佐证。从实施例1的ThT实验中，分别收集DMSO对照组、低浓度漆黄素组(11.7μM)、中浓度漆黄素组(46.7μM)和高浓度漆黄素组(186.7μM)的样品各5μL，滴到干净的铜网上，然后用滤纸吸去多余的样品，干燥一个小时后，取出铜网，再分别滴上5μL的醋酸双氧铀，并继续放置于真空干燥器中过夜，次日取出，放置于透射电镜(NIPPON TEKNO，JEM-1230)中，在100kV或200kV的加速电压下进行观察，拍照并保存图像。
图3中，A为添加DMSO对照组，电镜观察到密集的Tauk18蛋白纤维，说明DMSO 作为溶解漆黄素的溶剂，等体积添加入反应模型中并不会造成蛋白纤维的溶解。B为添加了低浓度漆黄素组，纤维密集程度还是较高，说明低浓度的漆黄素能够部分抑制Tauk18 纤维化，但效果不够显著。C和D分别为中浓度和高浓度的漆黄素组，从中浓度开始，对阻止Tauk18纤维的形成发挥了药效作用。特别是高浓度的漆黄素组(图3D)，电镜图显示很多零散断裂的短纤维，说明高浓度漆黄素阻碍纤维形成的效果明显，并且药效发挥与其浓度具有良好的依赖性关系。
实施例3不同时间段加药对Tau K18纤维化模型的抑制作用。
肝素钠诱导Tauk18蛋白体外聚集的动力学反应是符合“S”型曲线的模型，因此我们选择通过不同时间点往该反应体系中加入漆黄素，探索在哪一个Tau病理阶段给药对抑制其纤维化的效果最好。纤维化反应体系的第0小时，第2小时，第4小时和第6小时有各自不同的动力学趋势，其中第0小时是纤维化的起始阶段，也是成核阶段；而第2和第4 小时是快速纤维化阶段；第6小时是纤维化结束阶段。
按照前期ThT荧光实验的构建方法(表2)，先在体外37℃孵育出0、2、4、6小时等不同时间段的纤维化反应体系，然后往各个体系中分别添加5μL漆黄素(终浓度50μ M)或等体积的DMSO作为对照，继续放进酶标仪中37℃恒温孵育16小时，定时跟踪监测各孔中样品对应的荧光值变化。
由于漆黄素是溶解在DMSO中，因此选择DMSO作为对照组，从图4(E)中可以看出，高浓度的DMSO对Tau K18蛋白纤维化的过程是促进作用，说明DMSO不会干扰漆黄素的药效评判。图4中，A-D分别为不同时间加药的效果，与各组中DMSO对照组相比，无论在哪一个阶段加药，都能够促使反应体系中ThT荧光值降低，说明漆黄素对Tau蛋白单体和纤维都有结合作用。在纤维化的不同阶段加药，都能对最终的纤维形成起一定抑制效果。取各组中加药后荧光峰值与DMSO组荧光峰值之差，除以DMSO组荧光峰值，再乘以100％，作为不同时间加药的抑制率，统计结果如图4(F)。发现在纤维化完成之前 (第4小时)加药的效果最佳。
实施例4漆黄素与Tauk18蛋白单体的分子对接。
通过在线服务器I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER)建模得到Tauk18蛋白结构，用pdb2pqr程序预测蛋白初始结构中残基的质子化状态，然后用AutoDockTools 1.5.6除去非极性氢，赋予原子类型和gasteiger电荷等，处理后生成receptor.pdbqt文件用于对接。
通过PubChem数据库下载漆黄素分子三维结构(PubChem CID编号为5281614)。用AutoDock Tools 1.5.6除去非极性氢，赋予原子类型和gasteiger电荷等，处理后生成ligand.pdbqt文件用于对接。对接口袋中心点坐标为(56.444，60.296，56.698)，size_x、size_y 和size_z分别为57.395、52.697和49.200(各边界距离Tau k18蛋白最小距离为)。由AutoDock Vina 1.1.2程序完成，全局搜索穷尽度(exhaustiveness)设置为16，最大结合构象生成数(num_modes)设置为20，其它参数采用默认值。
如图5(A)所示，漆黄素分子的对接构象分布在4个区域(a、b、c和d)，其中a 和b两个区域分布有较多的构象，c和d区域仅分布了2个和1个构象，这表明漆黄素更可能结合在a或者b区域。从图5(B)来看，对接构象的打分值分布在-6.3～-7.7kcal/mol 之间，一定程度上反应了漆黄素分子能稳定结合Tauk18蛋白。进一步分析发现，在b区域的结合构象具有更高的打分值，这表明漆黄素分子在Tau蛋白上最有可能是结合位置是 b区域。我们进一步分析了漆黄素分子和Tauk18蛋白之间的相互作用。我们对漆黄素分子打分最佳的构象和Tauk18蛋白之间的氢键作用进行了分析。如图5(C)和图5(D)所示，漆黄素分子上苯环上羟基氧原子可以和Tauk18蛋白上的组氨酸268(His268)、缬氨酸309(Val309)、赖氨酸311(Lys311)和丝氨酸320(Ser320)形成氢键相互作用(氨基酸编号按全长Tau蛋白排序)，均为较高强度的氢键。这4个氢键作用是漆黄素分子和 Tauk18蛋白结合的主要驱动力之一。
根据上面分子对接的结果分析，漆黄素可以较好地与Tauk18蛋白的单体结合，极有可能阻止蛋白单体之间自身纤维化或者寡聚化。通过该分子对接，佐证了实施例1和实施例2中，漆黄素能够抑制Tauk18蛋白纤维的形成。Tauk18蛋白正是Tau蛋白纤维化的核心组成部分，漆黄素能够结合Tauk18蛋白单体，很有可能阻止其异常聚集，对于由Tau 蛋白异常聚集而引起的神经退行性疾病可以起着预防作用。
实施例5漆黄素与Tau蛋白纤维核心部分的分子对接。
Tau蛋白纤维的核心结构下载自蛋白质数据库(PDB编号为5O3L)。如图6(A)所示，该聚集体结构由2个反向对称的结构单元组成，每个结构含5条Tau蛋白链。用pdb2pqr 程序预测蛋白聚合体初始结构中残基的质子化状态，然后用AutoDockTools 1.5.6中的prepare_receptor4.py脚本处理，除去非极性氢，赋予原子类型和gasteiger电荷之后用于对接。
通过PubChem数据库下载漆黄素分子三维结构(PubChem CID编号为5281614)。用AutoDock Tools 1.5.6除去非极性氢，赋予原子类型和gasteiger电荷等，处理后生成ligand.pdbqt文件用于对接。对接口袋中心点坐标为(125.068，101.639，53.638)，size_x、size_y和size_z分别为180.323，141.046和147.979(各边界距离Tau蛋白纤维核心结构最小距离为)。由AutoDock Vina 1.1.2程序完成，全局搜索穷尽度(exhaustiveness)设置为 16，最大结合构象生成数(num_modes)设置为20，其它参数采用默认值。
如图6(A)所示，漆黄素分子的对接构象主要分布在4个区域(a、b、c和d)，不难发现这个4个区域所在位置分别两两对称(a和b，c和d)，这与Tau蛋白聚集体结构本身的对称性一致，也表明分子对接过程中对接结合位置的搜索较为合理。从图6(B) 来看，对接构象的打分值分布在-6.4～-7.3kcal/mol之间，一定程度上反应了漆黄素分子能稳定结合Tau蛋白纤维。进一步分析发现，在a和b区域的结合构象具有更高的打分值，这表明漆黄素分子在Tau蛋白纤维上最有可能是结合位置是a(b)区域。
如图6(C)和图6(D)所示，漆黄素分子上苯环上羟基氧原子可以和Tau蛋白聚合体上E链上的赖氨酸-331(Lys331E)和G链上的赖氨酸-331(Lys331G)形成氢键相互作用，发现其为强度较大的氢键。这2个氢键作用是漆黄素分子和Tau蛋白纤维核心部分结合的主要驱动力之一。
根据上面分子对接的结果分析，漆黄素不仅可以跟Tauk18蛋白单体结合，而且可以和 Tau蛋白纤维核心部分结合。因此，对于促使Tau蛋白纤维解聚，减轻神经毒性，治疗神经退行性疾病有较强的潜力。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
Claims (4)
1.漆黄素在预防或治疗由Tau蛋白异常聚集而引起的神经退行性疾病中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的神经退行性疾病是由Tau蛋白异常聚集而引起的。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹和皮克病。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的Tau蛋白异常聚集包括由基因突变引起或者异常修饰所导致的寡聚化或者纤维化。
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