CN115957271A - 一种中药组合物在制备治疗帕金森症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药领域，提供一种中药组合物的新应用，具体涉及一种中药组合物在制备抗帕金森药物中的应用。本发明的中药组合物包括以下重量比的原料药：蜘蛛香8份，五味子1份，石菖蒲4份，黄芩2份。本发明以秀丽隐杆线虫为药物筛选模型，体内实验结果显示，这种中药组合物能够显著抑制α‑突触核蛋白的表达，促进神经退行性DA神经元的恢复，提示这种中药组合物是一种有效的抗帕金森症药物候选物，可在制备抗帕金森症药物中应用。

Description

一种中药组合物在制备治疗帕金森症药物中的应用

技术领域

本发明属于中药领域，提供一种中药组合物在制备治疗帕金森症药物中的应用，本发明的中药组合物包括以下重量比的原料药：蜘蛛香8份，五味子1份，石菖蒲4份，黄芩2份。本发明以模式生物秀丽隐杆线虫进行的体内实验，结果显示该中药组合物可显著抑制α-突触核蛋白的表达，并促进神经退行性DA神经元的恢复，表明该中药组合物具有治疗帕金森症的潜力，可在制备抗帕金森症的药物中应用。

背景技术

帕金森症(Parkinson’s disease，PD)是第二大神经退行性疾病，表现为运动能力和认识功能下降。运动能力上表现为肌肉僵硬、运动迟缓和震颤；行为和认知能力上表现为痴呆、抑郁、焦虑和睡眠紊乱。这一疾病的发病率在大于60岁的人群中迅速增加。病患生活质量随疾病发展不断下降，直至负累家庭，给社会和家庭带来沉重的负担。

帕金森症的主要病理特征为α-突触核蛋白在脑组织中聚积以及大脑黑质致密部(SNPc)多巴胺能(DA)神经元的死亡。到目前为止，尚无有效的治疗药物。

采用传统帕金森哺乳动物病理模型筛选抗帕金森药物周期长、成本高，而采用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)可使筛选周期从月为单位下降至以天为单位，因此，秀丽隐杆线虫已成为一个非常有用的药物筛选模型。秀丽隐杆线虫廉价、易培养；世代周期短、后代数目多，同时可获得大量背景一致的个体，保证实验重复性和采用大样本量进行实验，从而排除个体差异的影响；另外，秀丽隐杆线虫与高等生物在基因和分子通路方面高度保守。因此，秀丽隐杆线虫越来越受到药学家的青睐。美国DevGen公司利用人源化线虫筛选的抗心律不齐药物已被FDA批准进入临床研究。

同时，通过中药治疗帕金森症，经过多年的发展，也已经出现了较多的药物可供患者使用，例如，中国专利CN104352725A，公开了一种治疗帕金森的中药组合物，由下列重量配比的中药原料组成的：煅龙骨20-40g，煅牡蛎20-40g，鳖甲20-40g，白芍10-20g，川芎5-20g，当归5-20g，地龙5-20g，合欢花10-20g，黄花10-20g，丹参25-40g，炙甘草5-10g，本发明的中药组合物均采用天然的中药原料，具有活血补血，补肝虚，镇肝熄风，滋肾补脑、健脾益气、燥湿化痰的功效，其配制简便、药源广、成本低，疗效显著，药性平和，有效率达98.21％，治愈率达75％。此外，中国专利CN105267410A公开了一种治疗帕金森的中药配方，由柴胡、熟地黄、白芍、甘草按照一定重量份数比例配制而成，通过MPTP诱发小鼠亚急性帕金森模型证明具有改善小鼠帕金森氏病症状的作用。

本发明公开了一种中药组合物，可显著减弱与人源α-突触核蛋白融合的黄色荧光蛋白在秀丽隐杆线虫肌肉组织中呈现的荧光强度，还可以促进神经退行性DA神经元的恢复。表明本发明的中药组合物具有治疗帕金森症的潜力，可在制备抗帕金森症药物中应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗帕金森病的中药组合物，具体涉及一种中药组合物在制备抗帕金森症药物中的应用。本发明所述的中药组合物包含以下重量比的原料药：蜘蛛香8份，五味子1份，石菖蒲4份，黄芩2份。

优选地，所述中药组合物包括以下重量比的原料药：蜘蛛香200mg，五味子25mg，石菖蒲100mg，黄芩50mg。

其中，上述的中药组合物的制备方法如下：按重量比称取蜘蛛香、五味子、石菖蒲和黄芩，加蒸馏水浸泡后，加热煮沸，过滤去药渣，收集药液备用，将药渣再次用蒸馏水浸泡，加热煮沸，再次过滤，得上清液，合并药液，浓缩并定容，离心，取上清液过滤除菌，分装后于冷冻保存。

其中，浸泡时间为30分钟。

其中，加热煮沸时间为每次30分钟。

其中，离心速度为12000rpm。

其中，离心时间为10分钟。

本发明所述的中药组合物在制备治疗抗帕金森症药物中的应用，可以将所述中药组合物制备成注射剂、散剂、颗粒剂、丸剂、口服液、片剂。

附图说明

图1中药组合物水煎液对PD线虫的治疗作用

图2中药组合物水煎液促进神经退行性DA神经元的恢复

具体实施方式

实施例一中药组合物水煎液的制备

称取蜘蛛香200mg、五味子25mg、石菖蒲100mg、黄芩50mg，加蒸馏水200mL，浸泡30分钟后，加热煮沸并保持30分钟，用纱布初步滤去药渣，收集药液备用，将药渣再次用150ml蒸馏水浸泡5-10min，加热煮沸并保持30分钟，再次用纱布滤去药渣获得上清液，将两次药液合并，浓缩并定容至50ml，12000rpm×10min离心2次，弃去不溶沉淀，用0.22μm水系滤头过滤除菌，分装后于-20℃保存。

实施例二中药组合物水煎液对帕金森秀丽隐杆线虫的治疗作用

1.生物材料

(1)秀丽隐杆线虫OW13购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)，为转基因品系，人源α-突触核蛋白与YFP黄色荧光蛋白融合被插入肌肉特异性启动子之下，因此该株系线虫肌肉组织特异性表达人类α-突触核蛋白，以荧光显微镜观察，荧光越强，α-突触核蛋白表达越高。对PD有治疗作用的药物可显著抑制α-突触核蛋白表达产生的荧光，待检药物抑制荧光能力越强，抗PD活性就越好。

(2)大肠杆菌OP50(尿嘧啶渗漏突变株)，购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)，作为秀丽隐杆线虫的食物。

2.试剂

(1)固体NGM(Nematode Growth Mediμm)培养基成分与制作(以1升为例)：

成分	含量
		NaCl	3.00g
K2HPO4	2.60g
		KH2PO4	17.00g
蛋白胨	2.80g
		琼脂	17.00g
<![CDATA[补充H<sub>2</sub>O至]]>	1000mL

固体NGM培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，在无菌操作台下加入5mg/mL胆固醇1mL，1M MgSO₄ 1mL，1M CaCl₂ 1mL摇匀，趁热倒入已灭菌的9cm培养板，约20mL/板，静置等待培养基凝固，备用。

(2)M9液配方

成分	含量
		<![CDATA[Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>]]>	6.00g
<![CDATA[KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>]]>	3.00g
		NaCl	5.00g
<![CDATA[1M MgSO<sub>4</sub>]]>	1.00mL
		<![CDATA[补充H<sub>2</sub>O至]]>	1000mL

(3)裂解液的配制：6.4％NaClO溶液和1M NaOH溶液按体积比1:1混合。

3.配制NGM平板

配置含有单味药的NGM平板：将单味药蜘蛛香加入NGM培养基，使含有单味药蜘蛛香的培养基的终浓度分别为0，25，50，100mg/mL。含有单味药五味子、单味药石菖蒲和单味药黄芩的NGM培养基配置同蜘蛛香。

配置含有中药组合物的NGM平板：将中药组合物提取物(蜘蛛香∶五味子∶石菖蒲∶黄芩＝8∶1∶4∶2)加入NGM培养基，使含有中药组合物的培养基的终浓度为375mg/mL。

配置含有正丁烯基苯酞的NGM平板：将正丁烯基苯酞加入NGM培养基，使含有正丁烯基苯酞培养基的终浓度为60μmol/L，作为阳性对照。

将上述NGM倒入各平板，静置等待培养基凝固。在培养基上均匀涂布大肠杆菌OP50作为线虫的食物。

4.实施步骤

(1)线虫的培养：

将线虫接种在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上，然后置于20℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。

(2)线虫同步化：

挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出的NGM培养基，用M9液将线虫从培养基上冲下，转移到离心管中，静置使线虫自由沉降至管底，弃上清。视线虫量多少向离心管中加入裂解液，在漩祸搅拌器上振荡5-7分钟待线虫全部断裂时停止涡旋，离心4000rpm，3min，小心弃去上清，加入10mL M9液，离心4000rpm，3min。再重复三次，离心4000rpm，3min，弃上清，剩余2mL液体。把收集到的2mL含有虫卵的液体分装到1.5mL离心管中，放到20℃生化培养箱中进行孵化。

(3)中药组合物提取物抑制人源α-突触核蛋白在秀丽隐杆线虫OW13肌肉组织中的表达

将同步化后分装于离心管，M9缓冲中孵化48小时成为同步化的L1期幼体线虫，4000rpm，5min离心除去多余M9，将线虫转移到含药的NGM培养皿中。每个培养皿60条线虫，每个药物浓度三个培养皿作为平行，20℃继续培养72小时。再用M9将冲冼下来，4000rpm，5min离心除去多余M9，加入20mM NaN₃麻醉线虫，在荧光显微镜下观察，拍照。每组随机观察25条线虫，所有图片采用Image J软件定量分析荧光强度。结果见图1。

实验结果表明，在本实施例中，相对于将单味药蜘蛛香、单味药五味子、单味药石菖蒲和单味药黄芩以25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL的浓度给药以及阳性对照正丁烯基苯酞组，本中药组合物显著抑制了人源α-突触核蛋白在线虫肌肉组织的表达，提示其对PD具有显著的治疗作用。

实施例三中药组合物水煎液促进神经退行性DA神经元的恢复

1.生物材料

(1)秀丽隐杆线虫BZ555，购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)，为转基因品系，BZ555转基因线虫用6-OHDA(Sigma，St.Louis，MI)处理以诱导DA神经元的选择性变性。

(2)大肠杆菌OP50(尿嘧啶渗漏突变株)，购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)，作为秀丽隐杆线虫的食物。

2.试剂

(1)固体NGM(Nematode Growth Mediμm)培养基成分与制作(以1升为例)：

成分	含量
		NaCl	3.00g
K2HPO4	2.60g
		KH2PO4	17.00g
蛋白胨	2.80g
		琼脂	17.00g
<![CDATA[补充H<sub>2</sub>O至]]>	1000mL

固体NGM培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，在无菌操作台下加入5mg/mL胆固醇1mL，1M MgSO₄ 1mL，1M CaCl₂ 1mL摇匀，趁热倒入已灭菌的9cm培养板，约20mL/板，静置等待培养基凝固，备用。

(2)M9液配方

成分	含量
		<![CDATA[Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>]]>	6.00g
<![CDATA[KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>]]>	3.00g
		NaCl	5.00g
<![CDATA[1M MgSO<sub>4</sub>]]>	1.00mL
		<![CDATA[补充H<sub>2</sub>O至]]>	1000mL

(3)裂解液的配制：6.4％NaClO溶液和1M NaOH溶液按体积比1:1混合。

3.配制NGM平板

按照固体NGM培养基配方配置未加药物处理的NGM平板，作为阴性对照。

配置含有6-OHDA的NGM平板：将6-OHDA加入NGM培养基，使含有6-OHDA的培养基的终浓度为50mmol/L。

配置含有6-OHDA及单味药的NGM平板：将6-OHDA加入NGM培养基，使含有6-OHDA的培养基的终浓度为50mmol/L。并将单味药蜘蛛香加入NGM培养基，使含有单味药蜘蛛香的培养基的终浓度分别为0，25，50，100mg/mL。含有单味药五味子、单味药石菖蒲和单味药黄芩的NGM培养基配置同蜘蛛香。

配置含有6-OHDA及中药组合物的NGM平板：将6-OHDA加入NGM培养基，使含有6-OHDA的培养基的终浓度为50mmol/L。并将中药组合物提取物(蜘蛛香∶五味子∶石菖蒲∶黄芩＝8∶1∶4∶2)加入NGM培养基，使含有中药组合物的培养基的终浓度为375mg/mL。

配置含有6-OHDA及正丁烯基苯酞的NGM平板：将6-OHDA加入NGM培养基，使含有6-OHDA的培养基的终浓度为50mmol/L。并将正丁烯基苯酞加入NGM培养基，使含有正丁烯基苯酞的培养基的终浓度为60μmol/L，作为阳性对照。

将上述NGM倒入各平板，静置等待培养基凝固。在培养基上均匀涂布大肠杆菌OP50作为线虫的食物。

4.实施步骤

(1)线虫的培养：

将线虫接种在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上，然后置于20℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。

(2)线虫同步化：

挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出的NGM培养基，用M9液将线虫从培养基上冲下，转移到离心管中，静置使线虫自由沉降至管底，弃上清。视线虫量多少向离心管中加入裂解液，在漩祸搅拌器上振荡5-7分钟待线虫全部断裂时停止涡旋，离心4000rpm，3min，小心弃去上清，加入10mL M9液，离心4000rpm，3min。再重复三次，离心4000rpm，3min，弃上清，剩余2mL液体。把收集到的2mL含有虫卵的液体分装到1.5mL离心管中，放到20℃生化培养箱中进行孵化。

(3)中药组合物提取物促进神经退行性DA神经元的恢复

将同步化后分装于离心管，M9缓冲中孵化48小时成为同步化的L1期幼体线虫，4000rpm，5min离心除去多余M9，将线虫转移到含药的NGM培养皿中。每个培养皿60条线虫，每个药物浓度三个培养皿作为平行，20℃继续培养72小时。再用M9将冲冼下来，4000rpm，5min离心除去多余M9，加入20mM NaN₃麻醉线虫，在荧光显微镜下观察，拍照。每组随机观察25条线虫，所有图片采用Image J软件定量分析荧光强度。结果见图2。

实验结果表明，在本实施例中，相对于将单味药蜘蛛香、单味药五味子、单味药石菖蒲和单味药黄芩以25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL的浓度给药以及阳性对照正丁烯基苯酞组，本中药组合物显著促进神经退行性DA神经元的恢复，提示其对PD具有显著的治疗作用。

通过以上实施例证明，本发明提供的中药组合物对PD秀丽隐杆线虫发挥显著的治疗作用，提示本发明提供的中药组合物具有抗PD的潜力，可在制备防治PD的药物中应用。

Claims (4)

1.一种中药组合物在制备抗帕金森症药物中的应用，其特征在于，所述的中药组合物包括以下重量比的原料药：蜘蛛香8份，五味子1份，石菖蒲4份，黄芩2份。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的中药组合物包括蜘蛛香200mg，五味子25mg，石菖蒲100mg，黄芩50mg。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的制备方法如下：按重量比称取蜘蛛香、五味子、石菖蒲和黄芩，加蒸馏水浸泡后，加热煮沸，过滤去药渣，收集药液备用，将药渣再次用蒸馏水浸泡，加热煮沸，再次过滤，得上清液，合并药液，浓缩并定容，离心，取上清液过滤除菌，分装后于冷冻保存。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的剂型为注射剂、散剂、颗粒剂、丸剂、口服液或片剂。

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