CN104610025A - 石菖蒲中分离的木脂素类化合物、其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由石菖蒲中提取分离得到的2个木脂素类化合物tatarinan S-T、其药物组合物以及其用途。通过实验证明，化合物tatarinan S和tatarinan T具有明显的抗老年痴呆活性，可以用于制备抗老年痴呆药物。

Description

石菖蒲中分离的木脂素类化合物、其制备与应用

技术领域

本发明涉及木脂素类化合物，尤其是涉及石菖蒲中分离的木脂素类化合物、其制备与应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又名早老性痴呆症，由AloisAlzheimer于1907年首先报道，是一种进行性的神经退行性疾病，其临床早期表现主要为患者记忆力的减退和生活自理能力的下降，最终导致发生进行的认知功能障碍和缺失、神经行为异常，出现精神状况及生活自理能力的完全丧失。AD发病率与人类的衰老有着密不可分的关系，随着全世界人口的老龄化程度的加重，AD的发病率日趋增高，60岁左右人群的发病率约为1％，之后约每5-6年翻一番。目前，全世界范围内AD患者约有3600万，预计到2050年则急剧增加到1.15亿(Alzheimer’s disease International.World Alzheimer Report 2010.London,2009；Defina P.A.et al.Journal of Aging Research,2013,1-9；Sutherland G.T.et al.RedoxReport,2013,18:134-141)。AD已成为老年人中仅次于心脑血管疾病和恶性肿瘤的主要致残致死疾病之一。AD的病因及发病机制尚未完全阐明，但经过研究发现淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)在脑内异常代谢导致β淀粉样蛋白(βamyloid,Aβ)的产生和清除失衡，从而造成过多的Aβ在海马沉积，是AD的主要发病机制。Aβ在脑内位于细胞外，主要以Aβ^1-40和Aβ^1-42两种形式存在，其中Aβ^1-42虽然含量低(不足10％)，但易于聚集为原纤维而沉积，从而形成弥漫性老年斑(SP)。此外，Aβ自我积聚形成的各种寡聚体，也具有神经毒作用，导致突触功能紊乱，从而导致AD的发生(Grill J.D.et al.Expert Rev.Neurother.,2010,10(5):711-728；付剑亮，邵福源.世界临床药物，2010，31(7)：390-394)。目前已有一些治疗AD的药物，如目前临床治疗AD的主要药物是乙酰胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体非竞争性拮抗剂，这两类药物可以通过增强胆碱能神经传导活性，改善中枢神经递质代谢障碍和NMDA受体激活后诱发的兴奋性毒性，缓解轻度、中度AD患者行为症状，但不能停止或逆转AD病程发展，并不能从根本上治疗AD。目前针对AD药物的筛选绝大多数是通过体外筛选单靶点抑制剂或在哺乳动物模型中进行筛选。鉴于AD疾病致病因素的多样性，单靶点体外筛选并不能很好的反映生物体AD疾病的复杂性。近年来，一种模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)以其结构简单、生命周期短暂、繁殖迅速和易于培养的独特优势，被广泛用于系统发育、衰老以及衰老相关疾病的研究。目前，转基因的AD模型线虫(CL2006，CL4176)可以在体内表达人源β淀粉样蛋白。该β淀粉样蛋白在肌肉细胞之间聚集，随着线虫的老化或培养温度的改变最终可以导致其瘫痪。从而可以用于抗老年痴呆药物的在体筛选。因此，线虫以其生长周期和生命周期短易于繁殖、体积小巧易于高通量筛选、通体透明且可以融合荧光蛋白易于观察、价格较哺乳动物低廉易于降低新药开发成本而逐渐受到科研人员的关注。

石菖蒲是一味传统常用中药，为天南星科多年生草本植物石菖蒲(Acorustatarinowii Schott)的干燥根茎，具有化痰开窍、化湿和胃、醒神益智等功效。临床上广泛应用于健忘、中风失语、耳鸣、老年性痴呆等疑难病症(国家药典委员会.中华人民共和国药典.北京：中国医药科技出版社，2010：85)。据统计，石菖蒲属于临床上治疗老年痴呆使用次数和频率最高的中药(胡增峣等，中药药理与临床，2012，28(5)：252-256)。

中国专利CN 102895439A公开了一种石菖蒲提取物，由下列方法制备得到：通过将石菖蒲进行超声提取和阳离子交换树脂解析步骤获得第一部分提取物和对残渣通过有机溶剂提取的第二部分提取物组成，其中超声提取的溶剂为水，超声频率为30-40kHz，阳离子换树脂柱的解析用氢氧化钠水溶液，解析液用盐酸解析，有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯和正丁醇。该发明提供的石菖蒲提取物作为防治老年痴呆症疾病具有优异的效果，防治老年痴呆症效果明显。但是该专利没有公开其提取物具体为何种物质。

中国专利CN 101785816A公开了一种石菖蒲提取物，由下列方法制备得到：将石菖蒲用水提取，然后向提取液中加入醇类溶剂进行沉降，收集沉淀，干燥，即可得石菖蒲提取物。该石菖蒲提取物具有显著的改善学习和记忆能力的效果。但是该专利也没有公开其提取物具体为何种物质。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供石菖蒲中分离的木脂素类化合物、其制备与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面提供一类石菖蒲中分离的木脂素类化合物tatarinan S-T，其化学结构如下：

本发明第二方面提供石菖蒲中分离的木脂素类化合物tatarinan S-T的制备方法，包括以下步骤：

1)将粉碎后的石菖蒲药材，用95％乙醇加热回流提取2次，合并提取液，浓缩后得到浸膏；将该浸膏中加入适量温水，依次用石油醚、氯仿、正丁醇萃取3次，合并萃取液得到石油醚、氯仿、正丁醇萃取部位；

2)将步骤1)中的氯仿萃取部位用100-200目硅胶层析，以石油醚-丙酮作为流动相进行梯度洗脱，获得6个流分Fr.1-Fr.6；其中流分Fr.2分别用硅胶柱、反相柱、凝胶柱进行分离纯化后，获得化合物tatarinan S-T。

作为流动相的石油醚-丙酮中，石油醚与丙酮的体积比为10:1～1:1。

步骤(2)中，用硅胶柱使用硅胶H，流动相使用体积比为5:1的石油醚-丙酮溶液；反相柱使用色谱柱RP C-18，流动相使用体积比为3:1的甲醇-水溶液；凝胶柱使用Sephadex LH-20，流动相使用甲醇。

本发明第三方面提供一种药物组合物，含有有效剂量的至少一种tatarinan S-T化合物以及药学上可接受的载体。

所述药物组合物可以是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂或微粒给药系统。

本发明第四方面提供石菖蒲中分离的木脂素类化合物tatarinan S-T在制备预防和/或治疗老年痴呆的药物中的应用。

在以转基因AD线虫模型为筛选模型对石菖蒲的抗老年痴呆活性物质展开研究，经过一系列生物活性跟踪的化学分离，从石菖蒲中分离得到的木脂素类化合物tatarinan T和tatarinan S具有显著的抑制Aβ模型线虫瘫痪作用，提示该类化合物可用于治疗或预防老年痴呆疾病。

与现有技术相比，本发明首次发现中药石菖蒲中的2个单体化合物具有抗老年痴呆作用，将来开发成的产品有望用于老年痴呆疾病的预防与治疗。

附图说明

附图1为tatarinan S的X单晶衍射分子结构；

附图2为tatarinan T的X单晶衍射分子结构；

附图3为tatarinan S对AD模型线虫CL4176的抑制瘫痪曲线图；

附图4为tatarinan T对AD模型线虫CL4176的抑制瘫痪曲线图；

图5为以PT50表述的延缓瘫痪时间柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例

1、从石菖蒲根茎中提取分离tatarinan S-T的方法：

中药石菖蒲药材10kg，经粉碎后，以95％的乙醇回流提取2次，合并2次提取液，减压浓缩，真空干燥，得浸膏700g。以约5倍量水混悬浸膏，依次以石油醚、氯仿、正丁醇萃取。回收溶剂后，得各部分萃取物。氯仿萃取部位(共190g)用100-200目硅胶层析，以体积比为5:1的石油醚-丙酮溶液，作为流动相进行梯度洗脱，得到6个流分Fr.1-Fr.6；对其中的Fr.2依次分别用硅胶柱、反相柱、凝胶柱进行分离纯化后，获得化合物tatarinan S-T。其中，用硅胶柱使用硅胶H，流动相使用体积比为5:1的石油醚-丙酮溶液；反相柱使用色谱柱RP C-18，流动相使用体积比为3:1的甲醇-水溶液；凝胶柱使用Sephadex LH-20，流动相使用甲醇。

通过质谱、核磁共振和X-单晶衍射技术对上述化合物进行鉴定，并确定了上述化合物的结构。化合物tatarinan S-T具体的波谱数据如下：

Tatarinan S(1)：块状结晶(石油醚-丙酮)，mp 95～97℃,ESI-MS m/z 416[M]⁺。¹HNMR

(CDCl₃,400MHz)δ：0.90(3H,t,J＝7.28,9'-H),1.60(3H,s,9-H),1.71(1H,m,8'-H),1.93(1H,m,8'-H),3.70(3H,m,7'-H),3.78,3.81,(3H,each,s,OMe),3.82,(6H,overlap,OMe),3.88(6H,overlap,OMe),6.46(1H,s,7-H),6.52(1H,s,3-H),6.53(1H,s,3'-H),6.70(1H,s,6-H),6.80(1H,s,6'-H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz),δ：120.0(C-1),151.8(C-2),98.2(C-3),148.3(C-4),147.7(C-5),114.7(C-6),120.0(C-7),140.0(C-8),17.5(C-9),124.7(C-1'),152.2(C-2'),98.2(C-3'),147.7(C-4'),143.4(C-5'),112.0(C-6'),47.1(C-7'),26.5(C-8'),12.6(C-9'),56.2,56.3,56.7,56.8,56.8,57.1(each,OMe).X-单晶衍射见图1。化合物Tatarinan S为天然来源首次分离得到(刘布鸣等，分析化学，1994，22(4)：355-358)。

Tatarinan T(2)：块状结晶(石油醚-丙酮)。HREIMS m/z 855.4282[M+Na]⁺,¹HNMR(CDCl₃,400MHz)δ：0.23(3H,d,J＝7.24,9-H),0.56(3H,t,J＝7.08,9″'-H),0.85(3H,d,J＝6.62,9″-H),0.90(3H,d,J＝6.43,9'-H),1.25(1H,m,H-8),1.67(1H,m,7″-H),1.80(1H,m,8″'-H),1.56(1H,m,8″'-H),2.58(1H,m,8″-H),2.76(1H,m,8'-H),3.00(1H,d,7'-H),3.57(1H,m,7″'-H),3.95(1H,m,7-H),6.27(1H,s,6″'-H),6.41(1H,s,),6.45(1H,s,3″'-H),6.47(1H,s,3-H),6.48(1H,s,3″-H),6.56(1H,s,6″-H),6.69(1H,s,6'-H),3.47,3.64,3.80,3.87,3.92(3H,each,s,OMe),3.82,3.85(6H,overlap,OMe),3.57(9H,overlap,OMe)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz),δ：128.9(C-1),152.4(C-2),97.6(C-3),151.7(C-4),140.4(C-5),137.5(C-6),52.4(C-7),42.4(C-8),12.7(C-9),123.2(C-1'),152.7(C-2'),98.5(C-3'),147.3(C-4'),142.5(C-5'),113.4(C-6'),53.8(C-7'),35.8(C-8'),24.4(C-9'),125.3(C-1″),152.4(C-2″),96.0(C-3″),147.1(C-4″),141.8(C-5″),114.8(C-6″),40.8(C-7″),40.4(C-8″),12.5(C-9″),125.1(C-1″'),151.5(C-2″'),96.8(C-3″'),147.2(C-4″'),141.1(C-5″'),114.1(C-6″'),43.1(C-7″'),17.8(C-8″'),12.8(C-9″'),55.5,55.6,55.7,56.1,56.4,56.5,56.8,56.8,57.2,57.6,60.2(each,OMe)。X-单晶衍射见图2。

2.活性实验

通过转基因AD线虫模型(CL4176)，检测上述2个化合物的抗老年痴呆活性，具体过程如下：

2.1.线虫传代培养(平板)

(1)线虫生长培养基的配置：按配方配置线虫生长培养基，无菌状态铺板，室温保存；1-2天后将平板倒置；1-2天后涂上适量无抗性大肠杆菌OP50，4℃保存备用。

(2)无菌操作下，将原平板(含CL4176转基因线虫，美国CGC中心)切成小块(约10条左右)，具有线虫的一面向下放置转移到新的培养皿中。

(3)每个平板放入2-3小块，封口膜封口，16℃保存。

2.2.线虫的同步化

同步化的原理是选择体内含有虫卵的线虫，用裂解液将虫体裂解后，体内虫卵释放，进行培养，此时所得到同步化的线虫，具体步骤如下：

(1)培养皿的选取：选择培养皿中线虫成虫较多培养皿，并且成虫体内含有较多虫卵(选择刚长到成虫1-3天的线虫最佳)。CL4176线虫生长周期较缓慢约为7天，所以转板约7天后就可以对线虫进行观察，准备裂虫。

(2)用M9buffer将NGM培养基上线虫冲洗下来，收集于离心管中，1200rpm，2min，弃上清，此步骤进行两次。

(3)加入1ml新鲜配制裂解液，涡旋约3-5min，虫体裂解，立即加入1ml M9buffer。(注：进行裂解时，每裂解一分钟，在显微镜下观察虫体裂解情况，待虫体裂解后立即加入M9Buffer，裂解时间不可超过10分钟)

(4)用M9Buffer将裂解所得虫卵冲洗，3400rmp，3min，三次。

(5)加入S-完全培养基(S-complete)，将卵重悬，3400rpm，离心3分钟，弃上清。(注：此步骤将洗去较多虫卵，如量少，可省去)

(6)用S-完全培养基(S-complete)将卵重悬，加入量根据卵数多少，不宜过多，一般1-3ml。

(7)16℃过夜后，观察幼虫是否孵出，如有幼虫孵出，同步化成功，可进行相关实验。

2.3.线虫瘫痪实验

(1)虫卵孵化后调整浓度：计数培养瓶内幼虫浓度，将已经孵化成幼虫的虫体浓度调整至30条/100μL。

(2)根据实验设计向线虫固体培养基中加入不同浓度或种类的药物，菌液及虫液，混合均匀，总体积为100μL。

(3)放置在16℃恒温培养箱中培养36h后，转温至23℃培养24h，接下来每隔1h观察虫子瘫痪情况，作好记录。

实验结果：tatarinan S、T延缓Aβ转基因线虫瘫痪作用见图3和4。以PT₅₀表述的延缓瘫痪时间柱状图如图5所示，从其PT₅₀(PT₅₀指半数线虫瘫痪时的时间)可以看出tatarinan S、T具有明显的延缓CL4176线虫瘫痪时间。

由实验结果可以看出，tatarinan S和T具有显著的延长CL4176线虫瘫痪时间，可用于在防治老年痴呆疾病中的应用。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一类石菖蒲中分离的木脂素类化合物tatarinan S-T，其特征在于，其化学结构如下：

2.一种药物组合物，其特征在于，含有有效剂量的至少一种权利要求1所述的tatarinan S-T化合物以及药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物可以是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂或微粒给药系统。

4.如权利要求1所述的石菖蒲中分离的木脂素类化合物tatarinan S-T在制备预防和/或治疗老年痴呆的药物中的应用。

5.如权利要求1所述的石菖蒲中分离的木脂素类化合物tatarinan S-T的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将粉碎后的石菖蒲药材，用95％乙醇加热回流提取2次，合并提取液，浓缩后得到浸膏；将该浸膏中加入适量温水，依次用石油醚、氯仿、正丁醇萃取3次，合并萃取液得到石油醚、氯仿、正丁醇萃取部位；

2)将步骤1)中的氯仿萃取部位用100-200目硅胶层析，以石油醚-丙酮作为流动相进行梯度洗脱，获得6个流分Fr.1-Fr.6；其中流分Fr.2分别用硅胶柱、反相柱、凝胶柱进行分离纯化后，获得化合物tatarinan S-T。

6.根据权利要求5所述的一种石菖蒲中分离的木脂素类化合物tatarinan S-T的制备方法，其特征在于，作为流动相的石油醚-丙酮中，石油醚与丙酮的体积比为10:1～1:1。

7.根据权利要求5所述的一种石菖蒲中分离的木脂素类化合物tatarinan S-T的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，

用硅胶柱使用硅胶H，流动相使用体积比为5:1的石油醚-丙酮溶液；

反相柱使用色谱柱RP C-18，流动相使用体积比为3:1的甲醇-水溶液；

凝胶柱使用Sephadex LH-20，流动相使用甲醇。