CN111909119A - 雷公藤来源化合物及其应用和制备方法、药物组合物、杀虫剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种倍半萜类新化合物，其结构以下述式(I)表示，本发明还涉及该化合物的制备方法。该新化合物有着非常明确的抗肿瘤活性以及杀虫活性。

Description

雷公藤来源化合物及其应用和制备方法、药物组合物、杀虫剂

技术领域

本发明涉及一种化合物及其医药用途、杀虫用途，还涉及包含该化合物在药物组合物、杀虫剂。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的三大疾病之一，具有较高的发病率和死亡率。现代西医治疗主要以化疗为主，毒副作用较大，患者生存期质量明显下降。中医药在抗癌防癌、减少不良反应等方面发挥了独特优势，是研发新型抗肿瘤药物的宝库。目前来源于中草药的抗癌制剂，占总抗癌药30％以上，如紫杉类、喜树碱、长春新碱等已经作为对抗抗肿瘤的首选药。

雷公藤(Tripterygium wilfordii)是卫矛科雷公藤属植物，又名黄腾根、菜虫药等，广泛分布于我国长江流域以南。雷公藤具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛的作用，可用于治疗风湿关节炎、皮肤发痒及杀虫。虽然雷公藤中药的传统功用是杀虫类用途，但是化学家也曾经发现雷公藤中的一些化合物具备抗癌活性，这些化合物包括雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤红素等化学结构骨架类型。然而为了寻找更理想的抗癌化合物，人们并未停止寻找植物来源的具有抗癌活性的化合物的步伐。

发明内容

为了进一步寻找更多的植物来源的具有抗癌活性的化合物，本发明的发明人对中药雷公藤的化学成分进行了深入的研究，结果从中分离出了一种倍半萜类新化合物，其结构式如式(I)所示：

根据化合物的骨架分类，此化合物应该属于苦皮藤素类(二氢-β- 沉香呋喃型倍半萜类)化合物。迄今为止，已知天然产物中分离、提纯、鉴定出500多种二氢-β-沉香呋喃型倍半萜类化合物，并且报道的所有化合物的C-4位置(以上化学式中已经标注编号C-4的位置)的游离羟基均未被酯化。其原因尚不清楚，可能是与此类化合物的生物合成途径有关，也可能是空间结构中此化合物的该位置存在某种阻挡效应。然而，本发明的化合物为第一个在C-4位置上带有酯基的二氢-β-沉香呋喃型倍半萜类化合物，这使得该化合物在新颖性方面有着明显的特征。据发明人考证，至今为止，除了尚无从天然产物界获得该化合物的报道，也并无人合成该化合物，确定该化合物是首次发现的化合物。

本发明的化合物在天然药材中含量比较低，按照发明人的推算，在干药材中其含量大概是2.6ppm这样的数量级，天然药材的相关活性不可能与该化合物的活性相关。另外，苦皮藤素类其他化合物曾经报道过杀虫活性，并用于农药组合物的制备，例如中国专利CN110250184A、 CN105594693A。本发明的发明人也对上述新化合物的杀虫活性进行了测试，证明其也存在很好的杀虫活性(参见具体实施方式)。

然而，更为令人意外的发现是，上述式(I)所述的化合物在抗癌活性测试中显示了明显的抗癌活性。迄今为止尚没有任何文献报道苦皮藤素类化合物(二氢-β-沉香呋喃型倍半萜类骨架)有抗癌活性，由于这类化合物与雷公藤中已知的抗癌化合物结构差别非常大，因此，该活性效果是令人意想不到的新发现，为新型抗癌药物的研发和制备提供了新的选择。

具体而言本发明提供了以下的技术方案。

本发明提供一种化合物，其结构如式(I)所示：

本发明中，若无特别说明，化学元素通常包含化学性质相同的同位素的概念，例如“氢”的表述，也包括化学性质相同的“氘”、“氚”的概念，碳(C)则包括¹²C、¹³C等，不再赘述。即，本发明的化合物包括其中元素被同位素替换的情况。

本发明的化合物或其生理上可以接受的盐由于展示了抗癌的活性 (参见具体实施方式)，因此能够在在制备治疗癌症药物中应用，这里的所述治疗癌症药物优选的是治疗肝癌、前列腺癌、肺癌的药物，但是并不限于这些抗癌药物。

另外，本发明还提供一种医药组合物，其包含上述式(I)所述化合物和药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体，是指本发明的化合物制成制剂时，可以配合药学上可以接受的辅料一起使用，这些辅料可例举包括药学领域常规的溶剂(如水、乙醇、丙二醇、注射用油等)、稀释剂(如淀粉、糖粉、糊精、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸氢钙、药用碳酸钙等)、甘露醇等、植物油、聚乙二醇等)、粘合剂(如水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素、羟丙甲纤维素等)、崩解剂(如干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠等)、润滑剂(如硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类、月桂醇硫酸镁等)、吸收促进剂(如表面活性剂、Azone(月桂氮卓酮)、EDTA、水杨酸、氨基酸乙胺衍生物、乙酰醋酸酯类、β-二羧酸酯、芳香族酸性化合物、脂肪族酸等)、防腐剂(如苯甲酸、羟丙丁酯、羟丙甲酯、苯酚、间甲酚等)、矫味剂(如蔗糖、甜菊素等)等。但并不限于这些。

本发明的医药组合物可以是各种剂型使用，即可以通过常规的制剂方法给药，例如制成选自片剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、粉剂、口腔膜剂和口服液，或者制成注射剂、膏剂、霜剂、栓剂等，但并不限于这些。从治疗目的和简便程度看，优选将本发明的化合物制成口服制剂。

本发明的式(I)所示的化合物的活性测试中，还提示了其防治害虫的活性(参见具体实施方式)。此处的所述害虫，典型的为草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)。但是并不限于这一种害虫，与其类似的害虫，例如对甜菜夜蛾、斜纹夜蛾特效，对稻纵卷叶螟、大螟、二化螟、三化螟也具有防止作用。

本发明还提供一种杀虫剂组合物，其包含式(I)所示的化合物。本发明的杀虫组合是指包含式(I)所示的化合物制剂和由其制备的作为农药的施用形式，例如浇灌、滴注和喷洒液体。任选地，施用形式包含其他农药和/或改善作用的助剂，作为佐剂，例如有渗透剂，例如植物油(如油菜籽油、向日葵油)、矿物油(如石蜡油)、植物脂肪酸的烷基酯(如油菜籽油甲酯或大豆油甲酯)，或烷醇烷氧基化物；和/或展开剂，例如烷基硅氧烷和/或盐(如有机或无机铵盐或鏻盐，例如硫酸铵或磷酸氢二铵)；和/或保留促进剂，例如磺基琥珀酸二辛酯或羟丙基瓜尔胶聚合物；和/或湿润剂，例如甘油；和/或肥料，例如含铵、含钾或含磷的肥料。常规的本发明的杀虫剂组合物的制剂为例如水溶性液体剂(SL)、乳液浓缩剂(EC)、水包乳剂(EW)、悬浮浓缩剂(SC、SE、FS、OD)、水分散性颗粒剂(WG)、颗粒剂(GR)和胶囊浓缩剂(CS)；这些制剂和其他可能的制剂类型例如被国际作物生命组织(Crop LifeInternational)记载并在以下文献中记载：《农药标准》、《联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织 (WHO)农药标准制订和使用手册》、《联合国粮农组织(FAO)植物生产与保护文件-173》(由联合国粮农组织(FAO)/世界卫生组织(WHO)农药标准联席会议编写，2004，ISBN:9251048576)。除了一种或多种式(I)的化合物外，所述制剂还任选地包含其他农用化学活性化合物。本发明的杀虫剂可以包含如增量剂、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防冻剂、杀生物剂(biocide)、增稠剂和/或其他助剂。

本发明的杀虫剂原则上，可使用所有合适的载体。更具体而言，有用的载体包括以下物质：例如铵盐；和精细研磨的天然岩石，如高岭土、氧化铝、滑石、白垩、石英、绿坡缕石、蒙脱石或硅藻土；和精细研磨的合成岩石，如高度分散的二氧化硅、氧化铝和天然或合成的硅酸盐；树脂；蜡；和/或固体肥料。同样可使用这些载体的混合物。用于颗粒剂的有用载体包括：例如，压碎并分级的天然岩石，如方解石、大理石、浮石、海泡石、白云石；以及无机粉末和有机粉末的合成颗粒；以及有机材料的颗粒，如锯屑、纸、椰壳、玉米穗轴和烟草茎。

本发明的化合物可以从雷公藤中药材的根皮中提取。本发明还提供其提取制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将雷公藤根皮用80％乙醇提取，用乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯部位馏分的富集步骤，

将上述步骤得到的乙酸乙酯部位馏分经过正相硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯溶剂体系进行梯度洗脱，获得相应的组分的粗分离步骤，

将上述粗分离步骤分离得到的组分采用石油醚及丙酮进行正相硅胶柱层析，获得相应的组分的精分离步骤，以及

将上述精分离步骤分离得到的组分在反相硅胶柱色谱上层析，获得目标化合物的步骤。

本发明当然也可以根据全合成或者半合成的方式获得，这些可以根据在本领域中公知的有机合成方法获得。

附图说明

图1为本发明化合物的¹H NMR谱图。

图2为本发明化合物的¹³C NMR谱图。

图3为本发明化合物的HRESIMS谱图。

图4为本发明化合物的¹H-¹H COSY谱图。

图5为本发明化合物的HSQC谱图。

图6为本发明化合物的HMBC谱图。

图7为本发明化合物的NOESY谱图。

图8为本发明化合物的HPLC谱图。

图9为本发明化合物的二维结构图。

具体实施方式

以下记载本发明式(I)所示化合物(也简称“本发明化合物”)如何获得的方法。还具体披露了式(I)所示化合物抗癌活性的具体实验方法、杀虫活性的具体实验方法。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

式(I)所示化合物的获得

本发明化合物的提取分离流程具体如下：

①本发明所用的雷公藤根皮采自湖北省咸宁县，经西北农林科技大学张华教授鉴定。样本凭证(编号18063)存放在西北农林科技大学农药科学研究所。

将雷公藤根皮10kg粉碎后，用10倍体积的80％乙醇提取三次，每次4小时。将三次提取液合并并过滤，除去药渣或其他杂物，滤液真空浓缩至棕色流浸膏3升。将流浸膏混悬于3升蒸馏水中，用6升乙酸乙酯进行萃取3次，回收溶剂，得到乙酸乙酯部位约为280g。

②将步骤①得到的280g乙酸乙酯部位经过硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯溶剂体系，按照9:1～0:10(V/V)的梯度进行洗脱，获得10个组分(A1～A10)。

③将步骤②硅胶柱分离得到的A5(25g)组分进行二次硅胶柱层析，溶剂体系为石油醚：丙酮＝3:1(V/V)，再次获得16个组分(B1～B16)。在60％乙腈为洗脱液的制备型高效液相色谱仪上获得目标产物倍半萜类新化合物(26mg，纯度为97.2％)。

式(I)所示化合物的结构鉴定

对实施例得到的两种倍半萜类新化合物进行产品分析；

本发明化合物的¹H NMR谱图见图1，本发明化合物的¹³C NMR谱图见图2，本发明化合物的HRESIMS谱图见图3，本发明化合物的¹H-¹HCOSY 谱图见图4，本发明化合物的HSQC谱图见图5，本发明化合物的HMBC谱图见图6，本发明化合物的NOESY谱图见图7，本发明化合物的HPLC谱图见图8，本发明化合物的二维结构图见图9。另外，本发明的HPLC检测条件如下：

色谱柱：Eclipse plus C18(4.6×250mm,5μm)

洗脱剂：乙腈(A):水(B)

梯度条件：0→10→25→30→35min；10％→50％→50％→90％→90％(A)

检测器：230nm紫外检测器

柱温：25℃

流速：1ml/min

本发明化合物为白色无定型粉末，常见理化数据如下：

UV(MeOH)λmax(logε)249(3.62)nm。

通过对其HRESIMS(m/s 766.29222[M+NH₄]⁺，理论值为766.2922)的分析，确定该化合物的分子式为C₃₆H₄₄O₁₇。

依据波谱学数据对本发明的化合物的各元素归属可以参考以下分析。

在¹H-NMR谱中显示结构中有7个乙酰甲基的质子信号[δ1.41、2.04、 2.08、2.10、2.11、2.13、2.28(3H，s)]，1组苯甲酰基质子信号[δ7.82 (2H，m)、7.39(2H，t，J＝7.80)、7.52(1H，m)]，3个叔甲基[δ1.54、 1.57、1.80(3H，s)]，和7个次甲基质子信号[δ5.46(1H，m)、5.46(1H， m)、5.71(1H，d，J＝2.43)、6.89(1H，s)、2.31(1H，m)、5.46(1H， m)、5.99(1H，d，J＝4.06)]。根据¹³C NMR谱可以推测结构中存在8个羰基碳，3个甲基碳，1个与氧官能团相连的亚甲基，1个次甲基，6个与氧官能团相连的次甲基，1个季碳及3个与氧官能团相连的季碳将该化合物的核磁数据与文献进行比较，得出该化合物是被7个乙酰基和1个苯甲酰基取代的二氢呋喃倍半萜类化合物。¹H-¹H COSY和HMBC谱数据显示δ5.46、5.46 和5.71分别为H-1、H-2和H-3的质子信号，δ6.89、2.31、5.46和5.99分别为H-6、H-7、H-8和H-9的质子信号。基于HMBC图谱分析，7个乙酰基的取代分别在C-1、C-2、C-3、C-4、C-6、C-8和C-13的位置，苯甲酰基与化合物的C-9位相连接。

先前研究表明，这类天然产物中的H-1，H-2和H-6分别具有直立键构型，平伏键构型和直立键构型，4位的羟基具有平伏键构型。在NOESY谱中显示，δ5.71(H-3)质子信号与δ5.46(H-2)和δ1.80(H-12)相关，同时δ6.89(H-6)质子信号与δ2.31(H-7)、δ1.80(H-12)和δ5.25 (H-13)相关。反之，δ5.46(H-8)的质子信号与δ5.99(H-9)相关。因此，该研究所得化合物结构为1α,2α,3β,4β,6β,8α,13- hepacetoxy-9α-benzoyloxy-β-dihydroagarofuran，HPLC结果显示该化合物的纯度为97.2％。具体数据见表1，该倍半萜类新化合物的二维结构图见图9。图9为二维结构图：A图为HMBC(H→C)(粗线)及1H,1H-COSY数据；B图为NOESY(H→H)数据；C图为该化合物的结构示意图。

具体数据见表1：

表1化合物的¹H NMR和¹³C NMR数据

实施例1：本发明化合物对癌细胞的增殖抑制作用

试验方法：肿瘤的产生是丧失细胞功能调控的结果，生长信号异常和细胞周期调控异常会导致细胞增殖的异常，最终产生恶性克隆。所以癌细胞的特征之一就是异常增殖。抑制癌细胞的增殖是治疗癌症的重要途径之一，也是抗肿瘤药物的基本要求。将新化合物分别作用于人肝癌细胞Huh7、人结肠癌细胞KSW480、人前列腺癌细胞DU145、人非小细胞肺癌A549以及人乳腺癌细胞MCF-7上24小时后，通过CCK-8法在450nm 波长处测定吸光度值来检测癌细胞增殖抑制作用。

将Huh7、SW480、DU145、A549以及MCF-7细胞以1×10⁵个/mL的浓度接种至96孔板中，在5％二氧化碳培养箱中培育至对数生长期，设置空白组、对照组及给药组(空白组仅含有培养基不含细胞，每组8个平行孔)，给药组分别加入10μmol/L的化合物溶液，继续培养24小时。24小时后向各孔中分别加入10uL CCK-8溶液后继续培养4小时，在450nm处检测吸光度值OD450nm，利用以下公式计算化合物对各肿瘤细胞的增殖抑制作用：

抑制率(％)＝[(对照组OD450nm-给药组OD450nm)/((对照组 OD450nm-空白组OD450nm)]×100

具体实验结果，见表2：

表2：化合物对各肿瘤细胞的增殖抑制作用

本次实验对倍半萜类新化合物对肿瘤细胞增殖抑制活性进行评价，结果显示在10μmol/L浓度下，化合物对人肝癌细胞Huh7、前列腺癌细胞DU145及非小细胞肺癌细胞A549均有较好的增殖抑制作用，抑制率均在50％以上。说明该化合物对于以上所述三种癌细胞具有选择性增殖抑制作用。

实施例2：本发明化合物的杀虫作用

试验方法：于野外收集草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，并在28±1℃(光照12小时)的光照培养箱中在室内培养，然后用人工饲料饲养2代。通过喂食含有倍半萜类新化合物树叶的方式检测其胃部毒性的杀虫作用。

用蒸馏水将倍半萜类新化合物稀释至1000mg/L。用毛细管滴管将药物定量滴在准备好的小圆形叶片的中心，溶剂挥发后，制备成含毒叶片。将含毒叶片放置在培养皿中，收集三只行动活跃的幼虫放置在培养皿中，让幼虫自发进食，每次捕捉三只幼虫进行处理，共平行处理20次。同时实验也设置同等数量的对照组幼虫作为空白对照组(食用新鲜植物叶子)。幼虫自由进食2小时后，将食用过含毒叶片的幼虫转移到装有新鲜植物叶子的培养皿中，在25℃恒温下保持120小时，并在120小时内检查测试昆虫的死亡和存活。具体实验结果，见表3：

表3：化合物对草地贪夜蛾120小时内的杀虫作用

本次实验对倍半萜类新化合物杀虫活性进行了评价，结果显示在 1000mg/L浓度下，化合物具有较高的杀虫活性。从72h即可达到37.78％的昆虫死亡率，到120小时后对昆虫的致死率达到81.11％。说明该化合物具有很强的杀虫活性有望开发成为新型的杀虫剂。

Claims (9)

1.一种化合物，其结构如式(I)所示：

2.权利要求1所述的化合物及其生理上可以接受的盐在制备治疗癌症药物中的应用。

3.根据权利要求2的应用，所述治疗癌症药物是治疗肝癌、前列腺癌、肺癌的药物。

4.一种医药组合物或保健食品，其包含权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，其是选自片剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、粉剂、口腔膜剂和口服液中的口服制剂；或者为选自注射剂、膏剂、霜剂和栓剂中的非口服制剂。

6.权利要求1所述的化合物的防治害虫的用途。

7.根据权利要求6所述的应用，所述害虫为草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda。

8.一种杀虫剂组合物，其包含权利要求1所述的化合物。

9.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

富集步骤，将雷公藤根皮用80％乙醇提取，用乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯部位馏分，

粗分离步骤，将上述步骤得到的乙酸乙酯部位馏分经过正相硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯溶剂体系进行梯度洗脱，获得相应的组分，

精分离步骤，将上述粗分离步骤分离得到的组分采用石油醚及丙酮进行正相硅胶柱层析，获得相应的组分，以及

纯化步骤，将上述精分离步骤分离得到的组分在反相硅胶柱色谱上层析，获得目标化合物。

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