CN106860500A - 低毒雷公藤新多苷、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低毒的雷公藤新多苷，由雷公藤多苷经过化学炮制、并添加雷公藤内酯三醇后得到。本发明还公开了该低毒的雷公藤新多苷在医药中的应用。本发明的雷公藤新多苷能有效缓解肾病综合征的肾脏病理损伤及蛋白尿的产生，改善机体炎症水平，对肾病综合征具有明显的治疗效果，毒性低且持效。

Description

低毒雷公藤新多苷、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体来说，是涉及一种低毒的雷公藤新多苷，还涉及该雷公藤新多苷的制备方法，以及其医药用途。

背景技术

雷公藤多苷(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是从卫矛科植物雷公藤的根、皮、叶中提取的一组混合苷，其主要化学成分包括二萜内酯、生物碱、三萜等。药理研究证明，雷公藤具有抗炎、免疫抑制或免疫调节、抗肿瘤等作用，是目前国内外热点研究的免疫调节药，可用于治疗类风湿性关节炎、原发性肾小球肾病、肾病综合征、紫瘢性及狼疮性肾炎、红斑狼疮、亚急性及慢性重症肝炎、慢性活动性肝炎；亦可用于过敏性皮肤脉管炎、皮炎和湿疹，以及银屑病性关节炎、麻风反应、白噻氏病、复发性口疮、强直性脊柱炎等。

雷公藤多苷投入临床使用以来，相关的不良反应还是时有发生，累及系统涉及血液系统、生殖系统、泌尿系统和消化系统等。究其原因，一方面是雷公藤多苷中的主要有效成分如雷公藤甲素、雷公藤内酯酮等二萜类成分，雷公藤红素、雷公藤内酯醇等三萜类成分，雷公藤晋碱、雷公藤次碱等生物碱类成分，均具有较大的毒性；另一方面，市场上雷公藤多苷标准提取物或比例提取物往往仅以雷公藤甲素为单一评价指标，导致各种雷公藤多苷提取物鱼目混杂。

早在1991年马鹏程等人首次分离和鉴定了雷公藤内酯三醇结构，但是，雷公藤内酯三醇在雷公藤属植物中的含量极低，20kg雷公藤仅可以获得720mg雷公藤内酯三醇。同年，郑家润等人同时研究了雷公藤内酯三醇对小鼠耳肿胀实验模型的缓解实验和血清血容素测定实验，其结果表明，雷公藤内酯三醇仅具浅表的抗炎活性，而并无免疫抑制活性。因此，雷公藤内酯三醇一直未能在医药领域得到推广应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种全新的、低毒雷公藤多苷。

本发明的另外一个目的是提供上述雷公藤新多苷的制备方法。

本发明的另外一个目的是提供上述雷公藤新多苷在制药上的应用。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种低毒雷公藤新多苷，由下述方法制备得到：

(1)在pH3.0～5.0的由磷酸二氢钠与磷酸配置的缓冲溶液中，将雷公藤多苷(留样，用于检测雷公藤甲素的含量)置于90～120℃油浴中加热回流进行水解反应18～96h(优选30h)。

反应完成后，减压移除溶剂(也可以通过萃取的方式移除溶剂)，加无水乙醇复溶，离心，去掉不溶物，溶液再加无水乙醇定容，取样检测雷公藤甲素的量，并得出雷公藤甲素的减少量。

(2)往步骤(1)的反应产物中添加雷公藤内酯三醇-无水乙醇溶液，混合后挥干溶剂，得到低毒雷公藤新多苷；雷公藤内酯三醇的添加量为雷公藤甲素减少量摩尔(mol)数的0～20倍。

步骤(1)和(2)中的无水乙醇，也可以选用其他无毒的有机溶剂来代替，如：异丙醇。

上述的雷公藤多苷通过下述方法制备得到：

以雷公藤的干燥根茎为原料，以质量分数为95％的乙醇(乙醇与雷公藤干燥根茎的体积质量比为4～16：1)回流提取3～12h，提取液减压浓缩得粗浸膏，粗浸膏用中性氧化铝吸附，挥干乙醇，再用三氯甲烷提取，减压浓缩得到雷公藤多苷。

据本发明的另一个方面，本发明提供了上述低毒雷公藤新多苷的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)以雷公藤的干燥根茎为原料，以质量分数为95％的乙醇(乙醇与雷公藤干燥根茎的体积质量比4～16倍)回流提取3～12h，提取液减压浓缩得粗浸膏，粗浸膏用中性氧化铝吸附，挥干乙醇，再用三氯甲烷提取，减压浓缩得到雷公藤多苷；

b)在pH3.0～5.0的由磷酸二氢钠与磷酸配置的缓冲溶液中，将雷公藤多苷(留样，用于检测雷公藤甲素的含量)置于90～120℃油浴中加热回流进行水解反应18～96h(优选30h)。

反应完成后，减压移除溶剂(也可以通过萃取的方式移除溶剂)，加无水乙醇复溶，离心，去掉不溶物，溶液再加无水乙醇定容，取样计算雷公藤甲素的量，并得出雷公藤甲素的减少量。

c)往步骤b)的反应产物中添加雷公藤内酯三醇-无水乙醇溶液，混合后挥干溶剂，得到低毒雷公藤新多苷；雷公藤内酯三醇的添加量为雷公藤甲素减少量摩尔(mol)数的0～20倍。

步骤(1)和(2)中的无水乙醇，也可以选用其他无毒的有机溶剂来代替，如：异丙醇。

据本发明的另一个方面，本发明提供了上述低毒雷公藤新多苷在制备治疗肾病综合征、原发性肾小球肾病、紫瘢性及狼疮性肾炎、类风湿性关节炎、红斑狼疮、亚急性及慢性重症肝炎、慢性活动性肝炎；过敏性皮肤脉管炎、皮炎、湿疹、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎药物中的应用。

雷公藤甲素与内酯三醇都是雷公藤的二萜类成分，二者化学结构相似，在一定条件可相互转化。本发明中，通过在pH3.0～5.0由磷酸二氢钠与磷酸配置的缓冲溶液中回流反应，将雷公藤甲素转化为雷公藤内酯三醇的基础上，将雷公藤多苷整体进行同上条件的化学炮制，使多苷中的雷公藤甲素含量降低，从而降低制剂的毒性。但在降低毒性的同时，制剂的药效也相应减弱。为此，本发明补加一定量低毒有效(治疗窗大)的雷公藤内酯三醇，以增加制剂的药效。本发明首次通过减少雷公藤甲素含量，并相应增加雷公藤内酯三醇含量保证了相当的抗炎活性，同时减少了因免疫抑制带来的毒性，为其在其它药物制剂中的应用及在临床疾病的治疗中提供物质基础。

本发明的低毒雷公藤新多苷，具有如下优点：

1、雷公藤新多苷相比市售雷公藤制剂来说毒性大大降低(p<0.05)；

2、雷公藤新多苷能有效缓解肾病综合征的肾脏病理损伤及蛋白尿的产生，改善机体炎症水平，对肾病综合征具有明显的治疗效果，具有持续的疗效。

3、由于免疫相关疾病具有机理的类似性，本发明提供的雷公藤新多苷也可以对其它免疫相关疾病尤其是炎症介导型的免疫相关疾病起到治疗作用，并有减毒效果。

附图说明

图1为雷公藤多苷及雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的色谱图。

图2为图1增加对照品后的色谱图。

图3为雷公藤新多苷在各细胞系中的毒性结果图。

图4为雷公藤内酯三醇单体抑制正常T/B淋巴细胞增值结果图。

图5为雷公藤内酯三醇单体抑制诱导的T/B淋巴细胞增值结果图。

图6为雷公藤内酯三醇单体抑制Raw264.7细胞炎症因子产生结果图。

图7为雷公藤内酯三醇单体抑制Raw264.7细胞炎症基因产生结果图。

图8为雷公藤内酯三醇单体抑制Raw264.7细胞NF-κB蛋白表达结果图。

图9为雷公藤内酯三醇单体抑制足细胞凋亡结果图。

图10为足细胞标志蛋白podocin及凋亡蛋白Bax蛋白表达结果图。

图11为足细胞标志蛋白表达激光共聚焦结果图。

图12为各实验组对NS大鼠尿蛋白的影响趋势图。

图13为各实验组对NS大鼠白蛋白的影响示意图。

图14为各实验组对NS大鼠总胆固醇、甘油三酯的影响示意图。

图15为病理学光镜检查结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细的说明。

下述制备例中所用常用试剂，均为市售试剂，所使用的仪器为：

超高效液相色谱仪(Waters Acquity，美国Waters公司)，万分之一天平(AL104-IC，瑞士METTLER TOLEDO公司)，十万分之一天平(AB135-S，瑞士METTLER TOLEDO公司)，酸度计(PHS-3C，上海精科仪器有限公司)，磁力搅拌器(HS7，德国IKA公司)，旋转薄膜蒸发仪(RV 10basic V，德国IKA公司)，台式微量离心机(Microfuge16，美国BACKMAN公司)，全波长酶标仪(1510，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，Thermo Scientific移液枪，1-10μL、10-100μL、100-1000μL(Thermo Fisher Scientfic.inc)，蛋白垂直电泳转膜系统(Bio-Rad)，全自动免疫分析仪(Abbott)，莱卡切片机(Leica)。

1、雷公藤新多苷的制备

以雷公藤的干燥根茎1500g为原料，以12L质量分数为95％的乙醇回流提取10h，提取液减压浓缩得粗浸膏，粗浸膏用中性氧化铝吸附，挥干乙醇，再用三氯甲烷5L提取，减压浓缩得到雷公藤多苷。

制得的雷公藤多苷，取样检测雷公藤甲素的含量，并同通过其指纹图谱和特征性成分与市售的雷公藤多苷进行比较。经比较，所得的雷公藤多苷和市场上的主流产品上海复旦复华药业有限公司、湖南千金协力药业有限公司、华润三九药业有限公司的雷公藤制剂、湖南协力药业有限公司生产的雷公藤多苷片指纹图谱相当。

取磷酸二氢钠，加水溶解，在室温下，加体积分数为1％的磷酸溶液调pH为4.0，即为pH4.0的磷酸二氢钠/磷酸缓冲溶液。

在pH4.0的磷酸二氢钠/磷酸缓冲溶液中，取部分制得的雷公藤多苷置于90～120℃油浴中加热回流进行水解反应30h，减压移除溶剂后，加无水乙醇复溶，离心，去掉不溶物，加无水乙醇定容至1L。取样10mL，计算雷公藤甲素的减少量。再取300mL直接挥干溶剂得到雷公藤新多苷Ⅰ；另取300mL，添加10倍(mol倍数)雷公藤甲素减少量的雷公藤内酯三醇-乙醇溶液，挥干溶剂后得到雷公藤新多苷Ⅱ；另取300mL，添加20倍(mol倍数)雷公藤甲素减少量的雷公藤内酯三醇-乙醇溶液，挥干溶剂后得到雷公藤新多苷Ⅲ，于-20℃冰箱保存。通过以上方式获得了雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。具体操作流程如下：

2、雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中雷公藤甲素与内酯三醇的含量测定

HPLC检测条件：色谱柱：BEH Shield RP18(2.1×100mm，1.7μm)；流动相：乙腈-水体系；梯度洗脱，洗脱程序见表1；流速：0.3mL/min；检测波长：220nm；柱温：35℃；进样体积：3μL；结果见图1、图2。

表1

图2中，对照品为雷公藤甲素和雷公藤内酯三醇的混合品。由图1和图2可见，雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中的雷公藤甲素都比雷公藤多苷中的要少；雷公藤新多苷Ⅰ、雷公藤多苷中的雷公藤内酯三醇，含量极其微小，而雷公藤新多苷Ⅱ、Ⅲ中的雷公藤内酯三醇含量较多。

以雷公藤甲素和雷公藤内酯三醇单体为标准品，用HPLC定量分析可得雷公藤多苷与雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中雷公藤甲素和雷公藤内酯三醇的含量，具体如表2

表2雷公藤多苷与雷公藤新多苷中标志性成分的含量(n＝3)

3、细胞实验

3.1HK-2、HL-7702、GC1、GC2、TM4细胞培养及毒性检测

HK-2、HL-7702、GC1、GC2、TM4均购自ATCC；HK-2：37℃高糖DMEM+10％FBS+1％双抗；HL-7702、GC1、GC2、TM4均为37℃DMEM+10％FBS+1％双抗；最终均置于含5％CO₂的温箱中培养，培养细胞至贴壁生长80％，取处于对数生长期的细胞，0.25％胰蛋白酶消化后，调整合适的细胞密度至96孔板中，待细胞单层贴壁后，换为同步化培养基培养，同步化12h。细胞进入静止期后加药处理，分别为:雷公藤多苷(LGT 0、1、5、10、20、30、50、100μg/mL)、雷公藤新多苷Ⅱ(LGT-2，0、1、5、10、20、30、50、100μg/mL)、雷公藤新多苷Ⅲ(LGT-4，0、5、10、20、30、50、75、100μg/mL)、LGT-5(0、0.1、2.5、5、10、15、25、50μg/mL)、雷公藤甲素(0、1、5、15、25、40、80、150ng/mL)、雷公藤内酯三醇(0、50、100、200、250、300、400、500μg/mL)，mix(甲素：三醇＝1：10，0、22、88、110、330、660、990、2200ng/mL)，每次给药200μL，给药后继续培养24h，进行MTT检测细胞活性并计算给药24h后的IC₅₀值，其结果见图3。

图3中，左边为IC₅₀值在0-200段的放大图，右边为IC₅₀值在0-1段的放大图(由于活性差别大，纵轴采用两种放大倍数截断)。由图3可知，雷公藤新多苷组在各个细胞系毒性显著降低，各配比平均低于甲素毒性的近1000倍左右。其中雷公藤内酯三醇：雷公藤甲素为10：1(接近雷公藤新多苷Ⅱ的比例)时，混合单体毒性降低近100倍左右，毒性显著降低。

3.2免疫抑制活性检测：

断颈处死小鼠，浸泡于75％的乙醇中，在超净台中取出小鼠脾脏，将脾脏在DPBS中洗3遍，充分湿润，将200目得纱布至于35mm的皿上，10mL注射器的活塞按一个方向均匀研磨研磨，边研磨边用DPBS湿润，将收集到的淋巴细胞悬液1500rpm离心3min，每个脾脏加入7mL红细胞裂解液，室温作用30min，1500rpm离心3min弃去上清，再用DPBS洗涤3遍，除去多余血清，取4mL的70％Percoll加在15mL离心管的底层，4mL 40％Percoll加在15mL离心管的上层，在水平离心机上800g室温离心20min，吸取40％percoll和70％percoll之间的细胞，用4mL DPBS洗涤3遍；接种至96孔培养板中，加药处理，分别为：空白对照组(只加培养基)、不同浓度的雷公藤内酯三醇(50、100、150、200ug/mL)、T淋巴细胞特异性增值诱导剂Con A(10ug/mL，对应正常抑制组)和B淋巴细胞特异性增值诱导剂LPS(10ug/mL，对应正常抑制组)，各加入200μL；于37℃、5％CO₂培养箱培养，24h后MTT方法检测细胞活性和抑制率，结果如图4所示。

特异性抑制实验淋巴细胞前处理操作同上，在淋巴细胞接种至96孔培养板后，进行加药处理，其中空白对照组(只加培养基)、T淋巴细胞特异性增值诱导剂Con A模型组(5ug/mL，对应模型组)和B淋巴细胞特异性增值诱导剂LPS模型组(5ug/mL，对应模型组)各加入200μL；Con A给药组先分别加入T淋巴细胞特异性增值诱导剂Con A(10ug/mL，对应模型组)100μL多份，再分别加入不同浓度的雷公藤内酯三醇(100、200、300、400ug/mL)100μL；LPS给药组先分别加入B淋巴细胞特异性增值诱导剂LPS(10ug/mL，对应模型组)100μL多份，再分别加入不同浓度的雷公藤内酯三醇(100、200、300、400ug/mL)100μL；各组于37℃、5％CO₂培养箱培养，24h后MTT方法检测细胞活性和抑制率，结果如图4和图5所示。

由图4可知：雷公藤内酯三醇具有抑制体外正常T、B淋巴细胞增值的作用，并且其抑制作用呈剂量依赖性，各给药组细胞活性显著低于对照组和模型组p<0.05；50ug/mL雷公藤内酯三醇与200ug/mL雷公藤内酯三醇对细胞活性抑制程度具有显著差异p<0.05。

由图5可知：在分别加入T细胞特异性诱导剂ConA和B细胞特异性诱导剂Lps之后，再用不同浓度雷公藤内酯三醇进行处理，所得结果如图5所示，给药组细胞活性均高于空白对照组，但均低于模型组，由此可知雷公藤内酯三醇确实存在较低的免疫抑制作用，其中对T淋巴细胞的抑制作用显著高于对B细胞的抑制作用p<0.05。对单独的细胞抑制并未呈现剂量依赖性。

3.3抗炎活性检测结果

Raw264.7 37℃、5％CO₂RPMI-1640+10％FBS+1％双抗。最终置于培养箱中培养。培养细胞至贴壁生长至80％，取处于对数生长期的细胞，0.25％胰蛋白酶消化后，调整合适的细胞密度至6孔板中。待细胞单层贴壁后，换为同步化培养基培养，同步化12h。细胞进入静止期后,除空白对照组外，其它各组以LPS(1ug/mL)1mL为造模剂，诱导细胞炎症模型，同时加药处理：模型组加1mL培养基、给药组(雷公藤内酯三醇50、100、150、200μg/mL剂量组)分别加入1mL相应浓度药液，而空白对照组直接加2mL培养基；分别用Western blot、qPCR、ELISA等方法检测不同处理组的炎症相关蛋白、基因、细胞因子的表达水平、NF-κB转录相关因子的表达及IL-6、IL-10、TNF-α等炎症细胞因子的表达。

如图6所示，体内外研究表明，TNF-ɑ主要是由发炎肾小球上的系膜细胞、上皮细胞，或者单核巨噬细胞分泌，不仅刺激系膜细胞分裂增殖，同时可刺激系膜细胞分泌多种炎性细胞因子，加重系膜细胞的增殖，细胞因子TNF-ɑ具有重要致炎作用。本课题研究结果可知：雷公藤内酯三醇具有改善由LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症损伤模型中细胞因子的分泌。

如图7、8所示，NF-κB P65通过调控TNF-ɑ、IL-6、IL-10等炎症细胞因子基因的表达，进而影响机体的炎症反应，调控T、B细胞的增殖、生长和分化，在体液和细胞免疫中发挥重要的作用。从图中可知：雷公藤内酯三醇可有效降低炎症因子TNF-ɑ和IL-10的作用。在高浓度时可升高抑炎因子IL-10的表达。这提示：药物可有效降低炎性因子的转录，并有一定的免疫调节活性。

4雷公藤内酯三醇保护足细胞凋亡实验

小鼠永生性足细胞系MPC5由广东省中医院肾病科馈赠。MCP5处理方式如下：分别用Western blot、IFC、qPCR、ELISA等方法检测不同处理组的炎症相关蛋白、基因、细胞因子的表达水平。其为温度敏感性细胞，在33℃RPMI-1640+10％FBS+1％双抗+10U/mLγ-IFN条件下增值，37℃RPMI-1640+10％FBS+1％双抗培养基分化10-14天备用。MCP5处理方式如下：除空白对照组外，其它各组以ADM(0.8μg/mL)1mL为造模剂，诱导细胞凋亡模型，同时加药处理：模型组加1mL培养基、给药组(雷公藤内酯三醇50、100、150、200μg/mL剂量组)分别加入1mL相应浓度药液，而空白对照组直接加2mL培养基；分别用Western blot、IFC、qPCR、ELISA等方法检测不同处理组炎症相关蛋白、基因、细胞因子的表达水平。足细胞裂孔膜蛋白Podocin和凋亡相关基因Bax的表达，利用标记了FITC的AnnexinⅤ和Propidium iodide(PI)对细胞进行双染并进行流式细胞仪检测，以此将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来，结果见图9、图10、图11。

如图9-11所示，足细胞受到损伤后，发生凋亡、自噬、坏死，导致其数目减少，最终产生蛋白尿，影响肾功能。由结果可知全分化的足细胞利用0.8μg/mL的ADM造成凋亡细胞模型，再给予雷公藤内酯三醇处理后，细胞的凋亡情况有所改善，这提示，雷公藤内酯三醇具有保护足细胞损伤的作用，可用于临床足细胞病的治疗。由实验结果可知：雷公藤内酯三醇具有保护足细胞凋亡的作用，但在高浓度时有上升趋势。

5动物实验

5.1采用阿霉素(ADR)诱导大鼠肾病综合症疾病动物模型的构建

雄性健康的SD大鼠100只，饲养7天后，随机抽取8只作为空白对照组，余下大鼠在非麻醉条件下一次性尾静脉按5.0mg/kg大鼠注射阿霉素诱导阿霉素肾病综合征动物模型。

分组：在注射阿霉素3周后，对100只大鼠进行24小时尿蛋白排泄量的测定。通过与空白组(注射等量生理盐水)比较，确定建模成功的大鼠。选择24小时尿蛋白排泄量在70-180mg之间的大鼠按尿蛋白排泄量随机平均分成模型组、雷公藤多苷组、雷公藤新多苷Ⅰ组、雷公藤新多苷Ⅱ组及雷公藤新多苷Ⅲ组。含量配比结果同表2

表2雷公藤多苷与雷公藤新多苷中二者的含量(n＝3)

5.2给药剂量的选取

药物的制备:取雷公藤多苷0.4g，先加5mL无水乙醇溶解药物，再将无水乙醇溶液缓慢滴加到羧甲基纤维素钠溶液中并定容至423mL，边加边按顺时针方向摇匀，再超声混匀。雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的药物配制方法同雷公藤多苷,浓度均为0.95g/L。

各组于造模成功次日起，每日灌胃，空白组与模型组给予生理盐水；雷公藤多苷组给予雷公藤多苷(0.95g/L)；雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(0.95g/L)组分别给予雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，连续给药8周。每只大鼠的灌胃剂量均为1mL/(100g大鼠)

5.3观察指标的检测

动物情况：各组大鼠每周称重2次，并观察大鼠的精神状态、体毛、浮肿、活动情况等。

尿蛋白含量的测定：各组大鼠于造模前，造模第3周及给药后第2、4、6、8周单独置于代谢笼中，收集24小时尿液，记录尿量，并采用考马斯亮蓝法测定尿蛋白浓度，计算24小时尿蛋白排泄量，结果见表3、表4、图12。

表3给药前各组大鼠24小时尿蛋白的排泄量(mg，n＝8，)

与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01

表4给药后各组大鼠24小时尿蛋白的排泄量(mg，n＝8，)

与空白组比较，＊P<0.05，＊＊P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

由实验结果(表3、表4、图12)可知：在整个试验过程中，空白组大鼠精神状态良好，体毛有光泽，活动、饮食正常，尿量正常。大鼠造模2周后，造模大鼠均出现饮水减少，尿量减少，部分大鼠还有烂尾现象。给药后，模型组大鼠始终躁动不安，体毛凌乱，尿量减少，消瘦。与模型组相比，给药各组上述表现有所改善。

由实验结果可知：经SPSS 20.0统计软件分析，各时间点的数据都符合正态分布。造模前，各组大鼠尿蛋白排泄量无明显差别。造模第3周，各造模组大鼠尿蛋白排泄量与空白组相比，都具有显著性的差异(P<0.01)，提示造模成功。在治疗过程中，各治疗组大鼠尿蛋白排泄量均有不同程度的减少。给药结束后，与模型组相比，雷公藤多苷组与新多苷Ⅱ组尿蛋白排泄量有显著性减少(P<0.05)。而雷公藤多苷组与新多苷Ⅱ组之间尿蛋白排泄量无显著性差别。

血液生化指标的检测：在实验第8周结束时，采用腹主动脉取血的方式取大鼠血清，用全自动生化分析仪测定血清中总蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐、总胆固醇、甘油三酯等血液生化指标，结果见表5、图13、图14。

表5各组大鼠血液生化指标的测定结果(n＝8，)

与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

由实验结果可知：经SPSS 20.0统计软件分析，各组数据均符合正态分布。实验结果显示：1)各组大鼠总蛋白水平无显著性差异。模型组大鼠白蛋白水平显著降低，与空白组相比，具有显著性差异(P<0.01)；与模型组相比，新多苷Ⅱ组白蛋白含量显著提高，具有显著性差异(P<0.01)。2)各组大鼠血清尿素氮、肌酐水平均无显著性差异。3)总胆固醇水平：模型组大鼠总胆固醇水平显著升高，与空白组相比，具有显著性差异(P<0.01)；与模型组相比，新多苷Ⅱ组总胆固醇水平显著降低，具有显著性差异(P<0.05)。4)甘油三酯水平：与空白组相比，模型组大鼠甘油三酯水平有显著性的升高(P<0.01)；与模型组相比，多苷组、新多苷Ⅱ、Ⅲ组总胆固醇水平均有显著性降低(P<0.05或P<0.01)。

组织病理学检查：腹主动脉取血后，摘取大鼠的肾脏，用10％的福尔马林溶液固定，石蜡包埋并切片，HE染色，进行病理学检查。结果见图15。由结果可知：光镜下显示：空白组肾小球、肾小管及肾间质未见明显异常。模型组可见系膜细胞和基质增生，肾间质纤维化，部分肾小管上皮细胞可见颗粒变性，有的肾小球出现萎缩。各治疗组的肾脏病理情况较模型组有所改善。

综上所述：NS大鼠由于肾小球的屏障功能受损，致使大量白蛋白渗漏到尿液中，形成大量蛋白尿。因此，对于NS疾病的治疗，一个重要的指标就是降低NS大鼠的尿蛋白排泄量。而当肾小球损伤严重出现肾小球硬化的时候，尿蛋白的排泄量也可能显著降低，从而出现假阳性的结果。因此，判断药物对NS疾病的疗效，除了观察尿蛋白的排泄量之外，还应结合血肌酐、尿素氮的水平以及肾脏的病理学检查结果进行综合评价。本实验结果表明：雷公藤新多苷Ⅱ能显著降低NS大鼠24h尿蛋白的排泄量，且肌酐、尿素氮水平并无异常，新多苷Ⅱ组大鼠肾脏病理切片中也未见明显的肾小球硬化等病理变化。由此可知，雷公藤新多苷Ⅱ对NS大鼠具有显著地治疗作用。药效学结果表明：给大鼠一次性尾静脉注射5mg/kg的阿霉素可成功的建立NS动物模型。从药物的干预情况可以看出，雷公藤多苷与雷公藤新多苷Ⅱ对NS大鼠具有显著地治疗作用，二者药效相似，但雷公藤新多苷Ⅱ起效更快。本实验中获得的雷公藤新多苷Ⅱ达到了减毒持效新工艺研究中持效的目的。由此，为本发明的雷公藤的新多苷在制备治疗肾病综合征、原发性肾小球肾病、紫瘢性及狼疮性肾炎、类风湿性关节炎、红斑狼疮、亚急性及慢性重症肝炎、慢性活动性肝炎；过敏性皮肤脉管炎、皮炎、湿疹、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎药物中的应用提供了基础，并证实了其可行性。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.低毒雷公藤新多苷，其特征在于，由下述方法制备得到：

(1)在pH3.0～5.0的由磷酸二氢钠与磷酸配置的缓冲溶液中，将雷公藤多苷置于90～120℃油浴中加热回流进行水解反应18～96h；

反应前后，均取样检测雷公藤甲素的量，并得出雷公藤甲素的减少量；

(2)往步骤(1)的反应产物中添加雷公藤内酯三醇-无水乙醇溶液，混合后挥干溶剂，得到低毒雷公藤新多苷；雷公藤内酯三醇的添加量为雷公藤甲素减少量摩尔数的0～20倍；

上述的雷公藤多苷通过下述方法制备得到：

以雷公藤的干燥根茎为原料，以质量分数为95％的乙醇回流提取3～12h，提取液减压浓缩得粗浸膏，粗浸膏用中性氧化铝吸附，挥干乙醇，再用三氯甲烷提取，减压浓缩得到雷公藤多苷；乙醇与雷公藤干燥根茎的体积质量比为4～16：1。

2.根据权利要求1所述的低毒雷公藤新多苷的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)以雷公藤的干燥根茎为原料，以质量分数为95％的乙醇回流提取3～12h，提取液减压浓缩得粗浸膏，粗浸膏用中性氧化铝吸附，挥干乙醇，再用三氯甲烷提取，减压浓缩得到雷公藤多苷；乙醇与雷公藤干燥根茎的体积质量比为4～16：1；

b)在pH3.0～5.0的由磷酸二氢钠与磷酸配置的缓冲溶液中，将雷公藤多苷置于90～120℃油浴中加热回流进行水解反应18～96h；

反应前后，均取样检测雷公藤甲素的量，并得出雷公藤甲素的减少量；

c)往步骤b)的反应产物中添加雷公藤内酯三醇-无水乙醇溶液，混合后挥干溶剂，得到低毒雷公藤新多苷；雷公藤内酯三醇的添加量为雷公藤甲素减少量摩尔数的0～20倍。

3.低毒雷公藤新多苷在制备治疗肾病综合征、原发性肾小球肾病、紫瘢性及狼疮性肾炎、类风湿性关节炎、红斑狼疮、亚急性及慢性重症肝炎、慢性活动性肝炎；过敏性皮肤脉管炎、皮炎、湿疹、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎药物中的应用。