CN117860760A

CN117860760A - 一种毛菊苣根中羽扇豆醇的提取方法及其应用

Info

Publication number: CN117860760A
Application number: CN202410036401.6A
Authority: CN
Inventors: 秦冬梅; 潘培妍; 陈卫军
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2024-01-09
Filing date: 2024-01-09
Publication date: 2024-04-12

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种毛菊苣根中羽扇豆醇的提取方法及其应用。本发明提供了一种毛菊苣根中羽扇豆醇的提取方法，将用95％乙醇浸泡得到的浸泡液浓缩，然后和水混合采用石油醚萃取，再将石油醚层浓缩后进行正相硅胶柱分离，配合凝胶柱洗脱、苯基柱分离，得到了高纯度的羽扇豆醇。本发明的方法流程简单高效、安全；本发明的制备方法所得化合物对FFA诱导的肝细胞脂肪变性具有良好的治疗效果，可以显著抑制FAS、IL‑6、促进FXR、ZO‑1、Occludin蛋白的表达，改变由HFD引起的小鼠血清生化指标变化，具有制备成为NAFLD治疗药物的潜力。

Description

一种毛菊苣根中羽扇豆醇的提取方法及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种毛菊苣根中羽扇豆醇的提取方法及其应用。

背景技术

肝脏(liver)为五脏之一，是脊椎动物身体内以代谢功能为主的一个重要器官，在身体里面充分扮演着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质作用，同时也制造消化系统中的胆汁。肝病则是指发生在肝脏的病变，包括乙肝、甲肝、丙肝、肝硬化、脂肪化、肝癌、酒精肝等多种肝病，是常见的危害性较大的疾病，日常生活中多以积极预防为主。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精以外的其他肝损伤因素导致的肝脏脂肪性病变，其发病率与人们的生活方式和饮食习惯息息相关。疾病的特点是脂肪(以甘油三酯的形式)在肝细胞中积聚。非酒精性脂肪性肝病分原发性和继发性两大类，除可直接导致失代偿期肝硬化、肝细胞癌和移植肝复发外，还可影响其他的慢性肝病，并参与2型糖尿病和动脉粥样硬化的发病。NAFLD已经成为我国第一大慢性肝病。

毛菊苣(Cichorium glandulosum Boiss.et Huet)为菊科菊苣属干燥地上或根，在临床上被广泛应用于治疗胃肠道和炎症性疾病。毛菊苣活性成分丰富，包括萜类、黄酮类、多糖类等成分，研究发现萜类、黄酮类成分具有抗炎、抗疟疾、抗诱变的功效。中国专利CN110585216A公开了羽扇豆醇在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用，但其针对的是急性肝损伤，研究机理大多是炎癌相关传统通路，包括NF-κB、AMPK、MAPK等。而慢性肝病非酒精性脂肪性肝病从不同代谢角度出发需要针对胆汁酸受体FXR代谢进行治疗。

目前，治疗非酒精性脂肪性肝病的药物主要以西药为主，但西药容易产生严重的毒副作用。因此，深入了解药用植物的护肝保肝作用至关重要。

但是，对植物粗提物的药理和毒理作用的研究较为困难，而单一化合物的提取方法工艺复杂，极大程度地限制了毛菊苣的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种毛菊苣根中羽扇豆醇的提取方法及其应用。本发明中羽扇豆醇对非酒精性脂肪性肝病的治疗效果好。本发明的提取方法简单，而且得到的羽扇豆醇的纯度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种羽扇豆醇在制备治疗或预防非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。

本发明还提供了一种毛菊苣根中羽扇豆醇的提取方法，包括以下步骤：

采用乙醇溶液对脱水后的毛菊苣根进行醇提，得到醇提液；

将所述醇提液第一浓缩后，将得到的稠浸膏和水混合，得到混悬液；

将所述混悬液和第一石油醚混合进行萃取，将得到的萃取液第二浓缩得到石油醚浸膏；

将所述石油醚浸膏用正相硅胶柱划段，使用第二石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱后，加热至120℃显色，取第15段组分A15过凝胶柱，使用体积比1:1的二氯甲烷-甲醇洗脱，取二氯甲烷-甲醇洗脱得到的第6段组分B6过苯基柱，使用体积浓度93％的甲醇水溶液洗脱，得到所述羽扇豆醇。

优选的，所述脱水后的毛菊苣根的含水量不超过10wt％。

优选的，所述脱水后的毛菊苣根与乙醇溶液的质量比为1:3～5。

优选的，所述乙醇溶液中乙醇的体积分数为95％。

优选的，所述醇提为浸提，所述浸提的次数为4～6次，每次浸提的时间为2h。

优选的，所述稠浸膏中固体物质的浓度为0.1～0.4g/mL。

优选的，所述稠浸膏和水的质量比为1:3～4。

优选的，所述第二石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱的体积比例依次为40:1、20:1、8:1、5:1、3:1和1:1。

优选的，所述凝胶柱为羟丙基葡聚糖凝胶柱。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种羽扇豆醇在制备治疗或预防非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。实施例从抑制脂滴生成，改善肠道菌群从而保护肝脏的角度出发，探讨了羽扇豆醇在抑制非酒精性脂肪性肝病恶化、保肝护肝、药物研究上的应用，具有十分重要的意义，为脂肪肝相关疾病治疗提供了新的方向和角度。

本发明还提供了一种毛菊苣根中羽扇豆醇的提取方法，采用乙醇溶液对脱水后的毛菊苣根进行醇提，得到醇提液；将所述醇提液浓缩后，将得到的稠浸膏和水混合，得到混悬液；将所述混悬液和石油醚混合进行萃取，将得到的萃取液浓缩得到石油醚浸膏；将所述石油醚浸膏用正相硅胶柱划段，使用石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱后，加热至120℃显色，取第15段组分A15过凝胶柱，使用体积比1:1的二氯甲烷-甲醇洗脱，取二氯甲烷-甲醇洗脱得到的第6段组分B6过苯基柱，使用体积浓度93％的甲醇水溶液洗脱，得到所述羽扇豆醇。本发明将95％乙醇醇提得到的醇提液浓缩，然后和水混合采用石油醚萃取，再将石油醚层浓缩后进行正相硅胶柱分离，配合凝胶柱洗脱、苯基柱分离得到了高纯度的羽扇豆醇，而且提取方法简单。

本发明将毛菊苣根在乙醇溶液中浸泡处理，相比于回流提取，提高了实验安全性，节约了成本，对于实验设备的要求较低，有利于扩大生产，增加产量，本发明用简单的方法得到了纯度较高的毛菊苣类化合物羽扇豆醇。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例制得的羽扇豆醇的核磁共振氢谱图；

图2为实施例制得的羽扇豆醇的核磁共振碳谱图；

图3为实施例制得的羽扇豆醇的DEPT谱图；

图4为实验例中羽扇豆醇对WRL 68细胞活性图；

图5为实验例中羽扇豆醇对HepG2细胞活性图；

图6为实验例中羽扇豆醇对HepG2细胞毒性图；

图7为实验例中不同浓度FFA(游离脂肪酸)对WRL 68细胞增殖影响结果图；

图8为实验例中不同浓度FFA(游离脂肪酸)对HepG2细胞增殖影响结果图；

图9为实验例中不同浓度羽扇豆醇处理下对HepG2细胞脂质积累的影响(40X)；

图10为实验例中不同浓度羽扇豆醇处理下对HepG2细胞TG、TC的影响；

图11为实验例中用WesternBlot法检测小鼠肝脏FAS、FXR、IL-6、IL-10、BSEP、SRBEP-1c蛋白表达的结果图；

图12为实验例中用WesternBlot法检测小鼠结肠IL-6、IL-10、β-actin、ZO-1、Occludin蛋白表达的结果图；

图13为实验例中用GPO-PAP法检测小鼠血清TG、TC、AST、ALT、HDL-c、LDL-c的结果图。

具体实施方式

本发明提供一种羽扇豆醇在制备治疗或预防非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。

在本发明中，所述羽扇豆醇(Lupeol)的结构式如式I所示：

在本发明中，所述羽扇豆醇对TG、TC指标具有显著抑制作用。

本发明使用羽扇豆醇处理游离脂肪酸诱导的WRL 68和HepG2细胞观察细胞毒活性，MTT筛选最佳造模浓度，油红O染色实验和单试剂GPO-PAP法平行验证毛菊苣类化合物对于脂质生成的抑制作用，体外对肝细胞的保护作用。结果表明，羽扇豆醇对游离脂肪酸诱导的体外非酒精性脂肪肝防治效果良好，具有较低的细胞毒性，同时能够抵抗肝细胞的脂肪变性，能够减少游离脂肪酸造成的肝细胞的脂质蓄积，能够增强肝细胞的抗损伤能力，可作为制备治疗NAFLD的药物研究。

羽扇豆醇在制备抗非酒精性脂肪肝治疗药物中的体内应用，使用羽扇豆醇对高脂饮食诱导的C57BL/66周龄小鼠进行干预，发现药物羽扇豆醇可以通过抑制FAS，激活FXR从而影响下游BSEP、SRBEP-1c蛋白的表达，通过“肠-肝轴”起到抗非酒精性脂肪肝病的效果，还可以降低HFD引起的TG、TC、AST、ALT、HDL-c、LDL-c血清水平升高。

采用乙醇溶液对脱水后的毛菊苣根进行醇提，得到醇提液；

在本发明中，若无特殊说明，使用的材料和设备均为本领域市售商品。

本发明将采用乙醇溶液对脱水后的毛菊苣根进行醇提，得到醇提液。

在本发明中，所述脱水后的毛菊苣根的脱水方法优选为自然晾干，所述脱水后的毛菊苣根的含水量优选不超过10wt％。如果含水量太高，会影响下一步的浸泡处理，影响乙醇溶液的浓度，从而影响提取率。

在本发明中，所述脱水后的毛菊苣根与乙醇溶液的质量比优选为1:3～5，更优选为1:4。

在本发明中，所述乙醇溶液中乙醇的体积分数优选为95％，本发明采用95％乙醇浸泡可以充分将毛菊苣根中的有效成分溶出。

在本发明中，所述醇提优选为浸提，所述浸提的次数优选为4～6次，更优选为5次，每次浸提的时间优选为2h；本发明反复5次浸提可以使有效成分几乎完全溶出，提高药材的利用率。

在本发明中，所述浸提的温度优选为常温，本发明在常温下进行浸提，相比于回流提取，提高了实验安全性，节约了成本，对于实验设备的要求较低，有利于扩大生产，增加产量。

在本发明中，所述醇提后优选还包括过滤，得到的滤液即为所述醇提液。

得到醇提液后，本发明将所述醇提液第一浓缩后，将得到的稠浸膏和水混合，得到混悬液。

在本发明中，所述第一浓缩的方法优选为减压蒸馏，如减压旋蒸，所述减压蒸馏的条件优选包括：压力为0～0.1MPa，温度为40～50℃；所述减压蒸馏可以保证药物分子完整性，同时达到有效去除乙醇的目的，便于后面萃取步骤的进行。

在本发明中，所述稠浸膏中固体物质的浓度优选为0.1～0.4g/mL。

在本发明中，所述稠浸膏和水的质量比优选为1:3～4，本发明使用水溶解稠浸膏，后续加入有机相进行萃取才能萃取完全，使目标化合物被充分萃取到有机相中。

得到混悬液后，本发明将所述混悬液和第一石油醚混合进行萃取，将得到的萃取液第二浓缩得到石油醚浸膏。

在本发明中，所述萃取的次数优选为3～5次，每次萃取所述混悬液和第一石油醚的体积比优选为1:1。

在本发明中，所述第二浓缩的温度优选为40℃。

得到石油醚浸膏后，本发明将所述石油醚浸膏用正相硅胶柱划段，使用第二石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱后，加热至120℃显色，取第15段组分A15过凝胶柱，使用体积比1:1的二氯甲烷-甲醇洗脱，取二氯甲烷-甲醇洗脱得到的第6段组分B6过苯基柱，使用体积浓度93％的甲醇水溶液洗脱，得到所述羽扇豆醇。

在本发明中，所述第二石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱的体积比例依次为40:1、20:1、8:1、5:1、3:1和1:1。所述石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱的体积比例与划分的17段无对应变化关系，根据颜色是否有明显变化进行划段。

在本发明中，所述正相硅胶柱的孔径优选为200～300目。

在本发明中，所述正相硅胶柱中的硅胶优选包括硅胶H、硅胶G和硅胶HF中的一种或多种。硅胶是目前应用最广泛的色谱柱填料，具有优良的机械强度和表面易改性的特点。

在本发明中，所述凝胶柱优选为羟丙基葡聚糖凝胶柱，更优选为Sephadex LH-20凝胶柱，购自安发玛西亚生物技术(上海)有限公司。所述凝胶柱在上样之前需用洗脱液进行柱平衡，无气泡后上样，上样后洗脱2～3个柱体积，填料需完全浸泡在甲醇中回收。

在本发明中，所述苯基柱优选为月旭Amy-DR，5μm硅胶表面涂覆直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，使用前用甲醇持续冲洗，冲洗20～30倍柱体积。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的毛菊苣根中羽扇豆醇的提取方法及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

步骤1:预处理，将毛菊苣根粉碎后进行脱水处理，并使毛菊苣根的含水量不超过10％，含水量为5％；

步骤2:醇冷提，使用毛菊苣根粉末质量4倍的95％乙醇对脱水后的毛菊苣根粉末(68kg)进行5次浸泡处理，每次2天，收集浸泡处理过的滤过溶液；

步骤3:浓缩，将得到的滤液旋蒸减压，在压力0.1MPa、温度40℃条件下蒸馏除去乙醇，得到0.1g/mL的稠浸膏(干重5000g)；

步骤4:萃取纯化，将1体积的稠浸膏分散到3体积的水中得到混悬液，使用1体积的石油醚对1体积的混悬液进行萃取，将所述石油醚层在温度40℃条件下浓缩，得到石油醚浸膏(干重700g)；

步骤5:过柱纯化，将步骤4中所得石油醚浸膏用300目正相硅胶依次划段，使用40:1～1:1(依次为40:1、20:1、8:1、5:1、3:1和1:1)的石油醚-乙酸乙酯依次洗脱，加热至120℃进行显色，根据结果将其划分为WR2-16-1至WR2-16-17共17段，将WR2-16-15过凝胶柱分离，使用体积比1:1的二氯甲烷-甲醇洗脱，得到WR2-18-6和WR2-18-7，将所得WR2-18-6过苯基柱分离，使用体积分数93％甲醇水溶液洗脱，得到纯化合物羽扇豆醇(干重25g)。

图1为羽扇豆醇的核磁共振氢谱图；图2为羽扇豆醇的核磁共振碳谱图；图3为羽扇豆醇的核磁共振DEPT图。对¹H核磁信号(氘代氯仿，400兆赫兹)，¹³C核磁信号(氘代氯仿，100兆赫兹)的光谱分析结果进行统一分析，结果如表1所示，羽扇豆醇的系统名为(3-beta)-Lup-20(29)-en-3-ol。

表1¹H核磁信号(氘代氯仿，400兆赫兹)，¹³C核磁信号(氘代氯仿，100兆赫兹)的光谱分析结果

实施例2羽扇豆醇抗非酒精性脂肪肝保肝活性研究

HepG2起源于人类肝癌细胞(hepatic cellular cancer,HCC)，较完整保留肝实质细胞分泌脂蛋白等主要功能，此外一种人正常肝细胞WRL 68常用于建立脂肪变性体外模型，两种细胞形成对比体系，体外研究人类脂质代谢，如何有效抑制游离脂肪酸诱发的细胞酯滴增多成为抗非酒精性脂肪肝体外研究的关键。游离脂肪酸诱导细胞不同程度表达包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)，抑制相关血清指标增长，降低其酯滴生成，是体外降低非酒精性脂肪肝病的关键。油红O属于偶氮染料，具有很强的脂溶性和脂染性，能够与细胞内游离脂肪酸诱导生成的TG结合，在光镜下呈现小酯滴状，因此使用油红O染色鉴定脂质沉积程度，寻找潜在抗非酒精性脂肪肝药物浓度尤为重要。

因此，在本实验例中，体外以游离脂肪酸(OAPA)刺激人类肝癌细胞HepG2、人正常肝细胞WRL 68建立体外NAFLD细胞模型，通过MTT法评价细胞毒活性、确定游离脂肪酸造模最佳浓度，采用单试剂GPO-PAP法检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量计算毛菊苣提取物抗非酒精性脂肪肝病的程度，油红O染色法平行验证。

本实验例中使用的毛菊苣类化合物羽扇豆醇是按照实施例1方法提取制得，将其按照实验要求浓度溶于DMSO、DMSO和无水乙醇(体积比1:1)，进行体外实验。

在实施例中使用到的主要试剂和仪器为：95％乙醇，国药集团化学试剂有限公司；蒸馏水；胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培养基、PBS溶液(pH＝7.4)及0.25％胰蛋白酶含EDTA，美国Gibco公司；MTT、油酸(OA)、棕榈酸(PA)、牛血清白蛋白(BSA)、细胞级二甲基亚砜(DMSO)，美国Sigma公司；BCA蛋白含量检测试剂盒，KeyGEN BioTECH公司；油红O染色试剂盒、甘油三酯(TG)测试盒、总胆固醇(TC)测试盒、南京建成生物公司；超纯水，实验室Mili-Q纯水机制备；其它试剂均为分析纯。ESCD AC2-4S1超净生物安全柜(美国Thermo公司)，371型二氧化碳恒温培养箱(美国Thermo公司)，MSL-3020高压灭菌器(日本SANYO公司)，XDTD-8222恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，W-01B数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)，血球计数板(上海求精生化公司)，Transferpette-S单道可调移液枪(0.1-1μL)、Transferpette-S单道可调移液枪(0.5-10μL)、Transferpette-S单道可调移液枪(10-100μL)、Transferpette-S单道可调移液枪(20-200μL)、Transferpette-S单道可调移液枪(100-1000μL)(德国Brand公司)，5100-0001型程序降温盒(美国Thermo公司)，LWD300-38LTI三目倒置相差显微镜(上海测维光电公司)，SpectraMax Plus 384全波长酶标仪(美国Molecular Devices公司)，Millex GV 0.22μm针头滤器(美国Millipore公司)，ECLIPSE80i高级研究型显微镜(日本Nikon公司)，ME235S十万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，KQ5200DV数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，25mL细胞培养瓶、96孔培养板、6孔培养板(美国Corning公司)，15mL离心管、50mL离心管、2mL冻存管(美国Corning公司)，TDL-60B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，BCD-254冰箱(德国SIEMENS公司)，ULT-2186-4-v49超低温冰箱(美国Thermo公司)。

1.体外实验：

(1)MTT法评价细胞毒活性

实验分别使用一定浓度梯度的羽扇豆醇(1‰DMSO+无水乙醇、25、50、100、200、300、400、500、600μM)处理WRL 68细胞24h，采用MTT测定羽扇豆醇对WRL 68细胞活性。图4为实验例中羽扇豆醇对WRL 68细胞活性图，与空白对照组相比，25、50、100、200、300、400、500μM羽扇豆醇对细胞活力基本无影响，细胞活力均大于90.17％，对细胞增殖的抑制率小于或等于9.83％。

实验使用羽扇豆醇(1‰DMSO+无水乙醇、50、100、200、300、400、500、600、700μM)处理HepG2细胞24h，采用MTT测定羽扇豆醇对HepG2细胞活性。图5为实验例中羽扇豆醇对HepG2细胞活性图，与空白对照组相比，50、100、200、300、400μM羽扇豆醇对细胞活力基本无影响，细胞活力均大于91.83％，对细胞增殖的抑制率小于或等于8.17％。同时，实验羽扇豆醇处理HepG2细胞24h，采用MTT测定羽扇豆醇对HepG2细胞毒性。图6为实验例中羽扇豆醇对HepG2细胞毒性图，检测出IC₅₀＝657μmol/L，整体来看，羽扇豆醇表现出较低的细胞毒性，因此后续染色、给药实验均采用300、150、75μM浓度羽扇豆醇进行，以排除细胞毒性影响。

(2)MTT法确定游离脂肪酸造模浓度

检测游离脂肪酸(FFA)对WRL 68人正常肝细胞的细胞活性，FFA比例采取2:1(油酸:棕榈酸)配制造模溶液，使用0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mmol/L的FFA处理WRL 68细胞24h，采用MTT测定OAPA对WRL 68细胞活性。图7为实验例中不同浓度FFA(游离脂肪酸)对WRL68细胞增殖影响结果图，与空白对照组相比，0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mmol/LFFA对细胞活力基本无影响，细胞活力均大于87.76％，对细胞增殖的抑制率小于或等于12.24％。使用FFA处理WRL 68细胞48h后采用MTT测定FFA对WRL 68细胞活性进行检测，与空白对照组相比，0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mmol/LFFA对细胞活力基本无影响，细胞活力均大于89.84％，对细胞增殖的抑制率小于或等于10.16％。

整体来看，FFA在一定范围内表现出较低的细胞毒性，综合考虑，后续脂肪造模实验均采用0.7mmol/L浓度FFA诱导肝细胞脂质积累24h，以保证WRL 68细胞活性以及肝细胞脂质积累的成功性。

检测FFA对HepG2细胞的细胞活性，与WRL 68造模相同，FFA比例采取2:1(油酸:棕榈酸)配制造模溶液，使用0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5、1.7mmol/L的FFA处理HepG2细胞24h，采用MTT测定FFA对HepG2细胞活性。图8为实验例中不同浓度FFA(游离脂肪酸)对HepG2细胞增殖影响结果图，与空白对照组相比，0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mmol/LFFA造模溶液对细胞活力基本无影响，细胞活力均大于84.92％，对细胞增殖的抑制率小于或等于15.08％。使用其处理HepG2细胞48h采用MTT测定FFA对HepG2细胞活性，与空白对照组相比，0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mmol/LFFA对细胞活力基本无影响，细胞活力均大于22.61％，对细胞增殖的抑制率小于或等于77.39％，且FFA0.9mmol/L浓度下的细胞活力为94.49％。整体来看，FFA在一定范围内表现出较低的细胞毒性，综合考虑，HepG2细胞后续脂肪造模实验同样采用0.7mmol/L浓度OAPA诱导肝细胞脂质积累24h，以保证HepG2细胞活性以及肝细胞脂质积累的成功性。

(3)油红O染色法鉴定脂质沉积程度

油红O染色液的配制，先进行油红O储备液的配制：100％异丙醇20mL+0.1g油红O干粉，充分溶解过滤，4℃避光保存。实验前，进行油红O工作液的配制，将储备液与蒸馏水按照3:2的比例稀释，过滤(滤纸或极性滤膜配1mL注射器)，随后进行相关实验。①将细胞接种于6孔板中培养至一定密度后加药孵育指定时间(一般为24h)预保护，随后使用OAPA造模培养(一般为24h)，随后取出六孔板置于超净台中，用移液器吸弃培养基后用1mL的PBS晃动清洗细胞；②向六孔板中每孔加入1mL4％多聚甲醛，使其没过细胞表面，放置于37℃水浴锅在静置固定细胞30min；③在固定期间，取15mL离心管，按照3:2的比例分别加入油红O染色液和去离子水，静置10min后再利用5mL注射器和0.45μm的有机微孔滤膜，过滤染液；④细胞固定完毕后，移液枪弃去多聚甲醛，每孔加入2mL已过滤的染液使其覆盖过细胞表面，六孔板置于37℃水浴锅上静置染色30min；⑤染色完毕后，弃去染液，每孔加入体积为1mL且用纯水配制而成的浓度为60％的异丙醇，迅速来回摇晃六孔板冲洗1min，洗净背景；⑥冲洗完毕后，每孔再加入1mL预先准备好的PBS溶液，随后加入提前预热并且滤净的苏木素染液，每孔1mL，复染细胞核(染色时间控制在3min)；⑦染色完毕后，弃去染液，每孔加入1mLPBS溶液进行清洗，随后吸出，舍弃，之后加入1mLPBS，置于倒置显微镜下观察拍摄。

图9为实验例中不同浓度羽扇豆醇处理下对HepG2细胞脂质积累的影响(40X)，对HepG2细胞的脂质沉积情况进行了评价，可发现空白对照组肝细胞轮廓清晰，无脂滴积累；单独用FFA(0.7mMOA+PA)造模溶液孵育24h的肝细胞其细胞质内出现大量红色脂滴，且视野内所有细胞脂滴聚集明显；采用低浓度药液孵育24h的肝细胞其细胞质内出现红色脂滴，且视野内绝大多数细胞脂滴聚集明显；采用中等浓度药液孵育24h的肝细胞其细胞膜周围出现红色脂滴，且视野内存在细胞脂滴聚集明显；采用高浓度药液孵育24h的肝细胞其细胞膜周围出现少量红色脂滴，且视野内绝大多数细胞脂滴聚集不够明显，三种不同浓度毛菊苣类化合物上述现象呈现程度有些许不同，即说明药液在既定药量对于HepG2细胞的造模脂滴积累具有剂量依赖性的影响，综合考虑下羽扇豆醇能够抵抗肝细胞的脂肪变性，能够减少游离脂肪酸造成的肝细胞的脂质蓄积，能够增强肝细胞的抗损伤能力，有制备NAFLD治疗的药物可能性。

(4)单试剂GPO-PAP法检测TC、TG含量

使用0.7mmol/L的游离脂肪酸诱导HepG2细胞建立体外NAFLD细胞模型，同时用300、150、75μM的羽扇豆醇处理HepG2细胞24h，然后裂解，进行细胞破碎，收集上清液使用试剂盒测定各细胞中TC、TG的含量。图10为实验例中不同浓度羽扇豆醇处理下对HepG2细胞TG、TC的影响，与模型对照组相比，300、150、75μM的羽扇豆醇均能降低游离脂肪酸诱发的TC、TG的水平，且具备剂量依赖性。

2.体内实验：

(1)Western Blot法检测小鼠肝脏FAS、FXR、IL-6、IL-10、BSEP、SRBEP-1c蛋白表达

图11为实验例中用WesternBlot法检测小鼠肝脏FAS、FXR、IL-6、IL-10、BSEP、SRBEP-1c蛋白表达的结果图。作为脂质生成相关蛋白，与空白对照组相比，HFD造成FAS表达增加同时抑制了FXR、BSEP的表达，羽扇豆醇补充给药组反向抑制了肥胖因子FAS的表达，升高FXR、BSEP表达，并出现药物剂量依赖性。BSEP蛋白表达的抑制，对胆盐输出泵造成破坏，不能致使胆汁酸外排，造成肝脏胆汁酸淤积。羽扇豆醇通过FXR-SREBP1-c轴及FXR-SHP轴显著改善了HFD带来的脂质代谢失调，FXR和胆盐输出泵基因水平的升高抑制了下游内质网上SREBP-1c的表达下降。结果表明羽扇豆醇对于HFD诱导的肝脏具有一定的保护作用，这可能是由于核蛋白FXR表达上调。羽扇豆醇是FXR的激动剂，一定范围内剂量越大，激活效果越好，影响上下游蛋白。

(2)Western Blot法检测小鼠结肠IL-6、IL-10、β-actin、ZO-1、Occludin蛋白表达

肠道黏膜免疫应答是肠道生态的基础，肠道黏膜免疫应答的失调也是导致肠道生态失调的罪魁祸首，肠道生态失调导致肠道屏障完整性受损，外界细菌可轻易对肠道发起攻击，造成肠道炎症加剧。肠道通过门静脉随着肠-肝轴引起对肝脏的破坏导致NAFLD。图12为实验例中用Western Blot法检测小鼠结肠IL-6、IL-10、β-actin、ZO-1、Occludin蛋白表达的结果图；与正常组相比，高脂饮食组IL-6出现显著性差异，羽扇豆醇能够药物剂量依赖性的缓解炎症反应。为了多角度观察羽扇豆醇对肠道屏障完整性的影响，系统研究了上皮紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin)的蛋白质表达水平，与正常组相比，HFD喂养的C57小鼠都具有显著低的上皮紧密连接蛋白表达，但是羽扇豆醇的补充显著的逆转了这一现象，其中，以Occludin闭合蛋白的表达水平为最佳。羽扇豆醇可以在蛋白质水平上改善肠道内炎症的增加风险，保证了肠道屏障的完整性，有利于经肠-肝轴对NAFLD起到良好治疗效果。ZO-1和Occludin在造模后出现表达下降证明肠道屏障受损，给药后药物剂量依赖的升高其表达，证明修复肠道屏障，保证其相关肠道功能发挥作用。

(3)GPO-PAP法检测小鼠血清TG、TC、AST、ALT、HDL-c、LDL-c含量

图13为实验例中用GPO-PAP法检测小鼠血清TG、TC、AST、ALT、HDL-c、LDL-c的结果图；HFD诱导导致ALT、AST、TG、TC、HDL-c、LDL-c血清生化指标增加，而羽扇豆醇的补充改变了这一现象，除LDL-c外剂量依赖的有效控制了HFD诱导的生化水平的增加，且与高脂饮食组出现显著性差异。LDL-c又被称为“坏的胆固醇”，与动脉粥样硬化息息相关，经羽扇豆醇处理，LDL-c降低但无剂量依赖现象。总而言之，补充羽扇豆醇能够保护小鼠在一定程度上免受HFD诱导带来的肝脏脂质蓄积及减轻肝损伤。羽扇豆醇降低的相关指标，逆转程度越大证明对于肝脏的保护作用越强，可以减轻肝脏脂质蓄积。

以上研究结果表明，羽扇豆醇对体外游离脂肪酸诱导的非酒精性脂肪肝病具有防治效果，能够抵抗肝细胞的脂肪变性，能够减少游离脂肪酸造成的肝细胞的脂质蓄积，能够增强肝细胞的抗损伤能力，对于体内高脂饮食诱导的NAFLD，能够通过FXR激发“肠-肝轴”，控制下游相关蛋白的表达，影响脂质代谢，改变血清等生化指标，因此可用于制备治疗NAFLD的药物。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本发明实施例在不经创造性劳动前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种羽扇豆醇在制备治疗或预防非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。

2.一种毛菊苣根中羽扇豆醇的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用乙醇溶液对脱水后的毛菊苣根进行醇提，得到醇提液；

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述脱水后的毛菊苣根的含水量不超过10wt％。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述脱水后的毛菊苣根与乙醇溶液的质量比为1:3～5。

5.根据权利要求2或4所述的提取方法，其特征在于，所述乙醇溶液中乙醇的体积分数为95％。

6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述醇提为浸提，所述浸提的次数为4～6次，每次浸提的时间为2h。

7.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述稠浸膏中固体物质的浓度为0.1～0.4g/mL。

8.根据权利要求2或6所述的提取方法，其特征在于，所述稠浸膏和水的质量比为1:3～4。

9.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述第二石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱的体积比例依次为40:1、20:1、8:1、5:1、3:1和1:1。

10.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述凝胶柱为羟丙基葡聚糖凝胶柱。