CN1925852A

CN1925852A - 用作免疫调节药和抗癌药的雷公藤内酯醇内酯环衍生物

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Publication number: CN1925852A
Application number: CNA2005800068751A
Authority: CN
Inventors: H·袁; J·H·马瑟; D·戴
Original assignee: Pharmagenesis Inc
Current assignee: Pharmagenesis Inc
Priority date: 2004-03-02
Filing date: 2005-03-02
Publication date: 2007-03-07
Anticipated expiration: 2025-03-02
Also published as: EP1732536A2; CA2557260C; DK1732536T3; WO2005084365A3; JP2007526331A; ES2385716T3; AU2005218610B2; CN100558354C; ATE554758T1; JP5057966B2; US7863464B2; US20080287530A1; CA2557260A1; EP1732536A4; AU2005218610A1; EP1732536B1; US20100331554A1; WO2005084365A2; US8426616B2

Abstract

本发明公开了基于雷公藤内酯醇和羟基化雷公藤内酯醇的内酯环改造的化合物，用于治疗用途，如抗增生、抗癌和免疫抑制治疗。

Description

用作免疫调节药和抗癌药的雷公藤内酯醇内酯环衍生物

技术领域

本发明涉及用作免疫抑制药，抗炎药和抗癌药的化合物。

参考文献

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背景技术

免疫抑制药广泛用于治疗自体免疫疾病，和治疗或预防移植排斥，包括治疗移植物对抗宿主疾病(GVHD)。常见的免疫抑制药包括硫唑嘌呤、皮质类固醇、环磷酰胺、氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、长春新碱和环孢霉素A。总的来说，这些药物中没有一种是完全有效的，且大多数受到严重毒性的限制。例如，环孢霉素A，是一种广泛使用的药物，对肾脏有明显的毒性。此外，有效治疗需要的剂量会提高患者对各种机会性侵入病菌感染的敏感性。

已经鉴定出从中药植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)(TW)获得的化合物雷公藤内酯醇及其特定的衍生物和前体药物具有免疫抑制活性，例如，治疗自体免疫疾病和治疗或预防移植排斥，包括治疗移植物对抗宿主疾病(GVHD)。参见，例如，共有的U.S.专利No.5,962,516(免疫抑制化合物和方法)、5,843,452(免疫治疗组合物和方法)、5,759,550(抑制异种移植排斥的方法)、5,663,335(免疫抑制化合物和方法)、5,648,376(免疫抑制二萜化合物)和6,150,539(具有高度水溶性的雷公藤内酯醇前体药物)，将这些专利引入作为参考。还已经报道了雷公藤内酯醇及其特定的衍生物和前体药物具有抗癌活性；参见，例如，Kupchan等，1972，1977，以及共有的U.S.专利No.6,620,843(2003年9月)，在此将其引入作为参考。

尽管雷公藤内酯醇的衍生物和前体药物已经在如药物动力学或生物分布方面具有了相对于天然雷公藤内酯醇的优点，但是，由于例如脂质或水溶解度的差异，或由于作为前体药物的活性，雷公藤内酯醇衍生物本身的生物活性通常明显低于天然雷公藤内酯醇。

发明内容

一方面，本发明提供了用于免疫抑制、抗炎和抗癌治疗的化合物。化合物是由通式I表示的雷公藤内酯醇的衍生物：

其中

R¹是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、芳基、芳基酰基或C(OH)R⁴R⁵，

其中R⁴和R⁵独立地是氢、烷基、环烷基、烯基和环烯基，其中任何一个，除了氢以外，都可以由烷氧基、羟基、酰氧基或芳基取代；

CR²R³是CHOH或C＝O，和

基团X中的至多一个是羟基，且剩余的基团X是氢。

在结构I的优选实施方案中，CR²R³是CHOH，优选具有β-羟基构象。在进一步的实施方案中，每个基团X是氢。

优选地，结构I化合物中存在的每个所述的烷基、烯基、炔基、烷氧基和酰氧基部分包括至多四个碳原子，每个所述的环烷基和环烯基部分包括至多六个碳原子，且每个所述的芳基部分是单环和非杂环的(即，由氢和碳原子组成)。

在结构I选定的实施方案中，R¹是烷基、烯基或C(OH)R⁴R⁵，其中优选地，每个R⁴和R⁵独立地是氢、烷基或烯基。在进一步的实施方案中，R¹是烷基，优选C₁-C₃烷基，或羟基烷基。在一个实施方案中，R¹是甲基。另一个实施方案中，R¹是芳基酰基，优选苯甲酰基(C(O)C₆H₅)。

在相关方面，本发明提供了结构II的化合物：

其中

每个R⁶独立地选自烷基、烯基、炔基或芳基；

CR²R³是CHOH或C＝O；

基团X中的至多一个是羟基，且剩余的基团X是氢。

在结构II的优选实施方案中，CR²R³是CHOH，优选具有β-羟基构象。在进一步的实施方案中，每个基团X是氢。

优选地，结构II化合物中存在的每个所述的烷基、烯基和炔基部分都包括至多四个碳原子，且每个所述的芳基部分是单环和非杂环的；例如，取代或未取代的苯基。

在结构II选定的实施方案中，每个R⁶是芳基；优选地，每个R⁶是未取代的苯基。

在另一方面，本发明提供了影响患者免疫抑制的方法，通过将有效量的具有如上所述的结构I或II的化合物给药到需要治疗的患者。进一步的方面中，本发明提供了在细胞中诱导凋亡的方法，其可用于抗增生性治疗，尤其是用于抗癌治疗。根据该方法，将细胞与有效量的具有如上所述的结构I和II的化合物接触。或者，本发明包括结构I或II的化合物用于影响免疫抑制或用于在细胞内诱导凋亡的用途，或用于制备影响免疫抑制或诱导细胞凋亡的药物的用途。通常在药物学上可接受的载体中来提供所述化合物。方法和用途的特定实施方案可以使用如上所述的通式I和II的任一特定实施方案。

当结合附图阅读以下的发明详述时，本发明的上述和其他目的和特征将变得更全面清楚。

附图说明

图1显示了本发明的化合物19-甲基雷公藤内酯醇(命名为PG795)，与雷公藤内酯醇相比较(命名为PG490)，在Jurkat细胞中的细胞毒性效应(实施例3)。

图2显示了本发明的化合物18-脱氧-19-脱氢-18-苯甲酰氧-19-苯甲酰雷公藤内酯醇(命名为PG796)，与雷公藤内酯醇14-琥珀酸酯(命名为PG490-88)相比较，在Jurkat细胞中的细胞毒性效应，有和没有在小鼠或人血清中预孵育(实施例3)。

图3显示了本发明的化合物19-甲基雷公藤内酯醇(命名为PG795)，与雷公藤内酯醇相比较，对Jurkat细胞中对IL-2产生的抑制(实施例4)；和

图4显示了PG796，与雷公藤内酯醇14-琥珀酸酯相比较，对Jurkat细胞中对IL-2产生的抑制，有和没有在小鼠或人血清中预孵育(实施例4)。

发明详述

I.定义

“烷基”指的是含有碳和氢的饱和非环单价基团，其可以是直链或支链的。烷基的实例是甲基、乙基、正丁基、叔丁基、正庚基和异丙基。“环烷基”指的是含有碳和氢的完全饱和的环状单价基团，其可以进一步由烷基取代。环烷基的实例是环丙基、甲基环丙基、环丁基、环戊基、乙基环戊基和环己基。“低级烷基”指的是具有1个至6个碳原子的基团，优选具有1至4个碳原子。

“烯基”指的是含有碳和氢的非环单价基团，其可以是直链或支链的，且其含有至少一个碳-碳双键(C＝C)。“炔基”指的是含有碳和氢的非环单价基团，其可以是直链或支链的，且其含有至少一个碳-碳三键(C≡C)。“低级烯基”或“低级炔基”这样的基团具有二至六个碳原子，优选具有二至四个碳原子。

“酰基”指的是具有-(C＝O)R形式的基团，其中R是烷基(烷基酰基)或芳基(芳基酰基)。“酰氧基”指的是具有-O(C＝O)R形式的基团。

“芳基”指的是具有单环(例如，苯)或两个稠合环(例如，萘基)的单价芳香族基团。如在此所用的，芳基优选是单环和碳环的(非杂环)，例如，苯(苯基)环或取代的苯环。“取代的”意思是一个或多个氢由基团如卤素(例如，氟、氯或溴)、低级烷基、硝基、氨基、低级烷基氨基、羟基、低级烷氧基或卤代(低级烷基)所取代。

“芳基烷基”指的是烷基，优选低级(C₁-C₄，更优选C₁-C₂)烷基，进一步由芳基取代的取代基；实例是苄基和苯乙基。

“杂环”指的是非芳香族环，优选5-至7-元环，其环原子选自碳、氮、氧或硫。优选地，环原子包括3至6个碳原子。这样的杂环包括，例如，吡啶、哌啶、哌嗪和吗啉。

为了本发明公开的目的，将以下编号的略图用于雷公藤内酯醇和雷公藤内酯醇衍生物。

II.雷公藤内酯醇衍生物

本发明的化合物是雷公藤内酯醇或羟基化雷公藤内酯醇的衍生物，源自呋喃(内酯)环的烷基化或酰基化，如下所述。

更具体地，本发明提供了由结构I表示的化合物：

其中

其中R⁴和R⁵独立地是氢、烷基、环烷基、烯基和环烯基，其中任何一个，除了氢以外，可以由烷氧基、羟基、酰氧基或芳基取代；

CR²R³是CHOH或C＝O，和

基团X中的至多一个是羟基，且剩余的基团X是氢。

结构I的优选实施方案中，CR²R³是CHOH，优选具有β-羟基构象。

优选地，每个X是氢；然而，在选定的实施方案中，实际上所示基团X之一是羟基。羟基取代的优选位置包括碳2和16，如以上编号略图中所示的。

优选地，结构I化合物中存在的每个所述的烷基、烯基、炔基、烷氧基和酰氧基部分包括至多四个碳原子，每个所述的环烷基和环烯基部分包括至多六个碳原子，且每个所述的芳基部分是单环和非杂环的。

在结构I的选定实施方案中，R¹是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、芳基或C(OH)R⁴R⁵，优选为烷基、烯基或C(OH)R⁴R⁵，其中优选地，每个R⁴和R⁵独立地是氢、烷基或烯基。在进一步的实施方案中，R¹是烷基，优选C₁-C₃烷基，或羟基烷基。在一个实施方案中，其包括在此命名为PG795的化合物，R¹是甲基。在另一实施方案中，其包括化合物19-苯甲酰雷公藤内酯醇，R¹是芳基酰基，优选为苯甲酰基。

在相关方面中，本发明提供了结构II的化合物：

其中

每个R⁶独立地选自烷基、烯基、炔基或芳基；

CR²R³是CHOH或C＝O；

基团X中的至多一个是羟基，且剩余的基团X是氢。

在结构II的优选实施方案中，CR²R³是CHOH，优选具有β-羟基构象。优选地，每个X是氢；然而，在选定的实施方案中，实际上所示的基团X之一是羟基。羟基取代的优选位置包括碳2和16，如以上编号略图中所示的。

优选地，结构II化合物中存在的每个所述的烷基、烯基、炔基部分包括至多四个碳原子，且每个所述的芳基部分是单环和非杂环的；例如，取代的或非取代的苯基。

在结构II的选定实施方案中，每个R⁶是芳基；优选地，每个R⁶是苯基。这包括在此命名为PG796的化合物，其中每个R⁶是未取代的苯基。

A.制备

本发明的化合物可以从雷公藤内酯醇或其羟基化衍生物制得。后者包括雷公藤羟基内酯醇(2-羟基雷公藤内酯醇)和16-羟基雷公藤内酯醇，其和雷公藤内酯醇一起，可以从中药植物雷公藤(Tripterygiumwilfordii)(TW)的根木质部或从其他已知来源获得。所述TW植物发现于中国的福建省和其他南部省份；TW植物原料通常在中国可以获得，或在美国通过商业来源获得。制备雷公藤内酯醇、雷公藤羟基内酯醇和16-羟基雷公藤内酯醇的方法是本领域已知的并描述于，例如，Kupchan等(1972，1977)；Lipsky等(1994)；Pu等(1990)；和Ma等(1992)。

可以通过二氧化硒氧化雷公藤内酯醇来制得雷公藤内酯醇的5-羟基衍生物，如共有的美国临时申请系列号no.60/532,702中所述的那样。简而言之，在通常的制备中，将雷公藤内酯醇溶液和约2.2当量在二噁烷中的二氧化硒在约90℃在N₂下搅拌72小时。

用短刺小克银汉霉菌(Cunninghamella blakesleana)孵育雷公藤内酯醇，如L.Ning等(Tetrahdron 59(23)：4209-4213，2003)所述的那样，会产生上述羟基化衍生物以及1β-羟基雷公藤内酯醇、15-羟基雷公藤内酯醇(triptolidenol)、19α-羟基雷公藤内酯醇和19β-羟基雷公藤内酯醇。

可以通过将羟基保护的雷公藤内酯醇和强碱如LDA反应来制备通式I的化合物，接着将中间产物烯醇化物的烷基化。如以下的方案1中所示的，其中碘甲烷用于烷基化，还可以形成异构的呋喃醇盐。如实施例1中所述的，将这些化合物分离并通过与氯化汞反应来分别去保护。

以下的方案说明了使用溴化烯丙基作为烷化剂，来获得通式I的化合物，其中R¹＝烯丙基(-CH₂CH＝CH₂)。相似地，使用溴化苄基来获得通式I的化合物，其中R¹＝苄基(-CH₂C₆H₅)。

如下所示，中间产物烯醇化物与酮的反应，可以用于产生醇取代物；即，其中R¹是C(OH)R⁴R⁵的通式I的化合物。

可以通过使中间产物烯醇化物与过量的酰化试剂如酰基卤化合物反应来制备通式II化合物，如以下的方案中所示。在这种情况中，双取代的化合物可以用酸水溶液水解来产生单衍生的共轭的烯酮。

B.生物活性

如实施例3中所述的，使用标准的MTT测试来评价通式I化合物：19-甲基雷公藤内酯醇(命名为PG795)和通式II化合物：18-脱氧-19-脱氢-18-苯甲酰氧-19-苯甲酰雷公藤内酯醇(命名为PG796)的细胞毒性活性。如实施例4中所述的，用标准的IL-2抑制试验来评价这些化合物的免疫抑制活性。这些试验的结果显示于附图1-4中。

PG795在两个试验中都显示出明显的活性，如附图1和3所示，尽管活性低于雷公藤内酯醇(附图中命名为PG490)。

PG796在两个试验中显示出高于已知前体药物雷公藤内酯醇14-琥珀酸酯(命名为PG490-88)的活性水平，如附图2和4所示。特别地，在这些试验中，在人血清孵育的雷公藤内酯醇14-琥珀酸酯的活性比在小鼠血清中孵育的雷公藤内酯醇14-琥珀酸酯的活性低得多，而在两种情况中PG796显示出高的、且基本上相等的活性。(孵育是期望能使雷公藤内酯醇14-琥珀酸酯转化成雷公藤内酯醇，并将PG796转化成单衍生的化合物，19-苯甲酰雷公藤内酯醇，如以上的合成方案中所示)。

III.治疗组合物

含有本发明的雷公藤内酯醇衍生物的制剂可以采用固体、半固体、冻干粉或液体剂型的形式，如片剂、胶囊、粉末、持续释放的制剂、溶液、悬浮液、乳浊液、膏剂、洗液或气溶胶，优选为适于精确剂量简单给药的单位剂型形式。组合物通常包括常规的药物学载体或赋性剂，并可以另外包括其他药剂、载体或佐剂。

优选地，组合物包括约0.5重量％至75重量％的一种或多种本发明的化合物，剩余的由合适的药物学赋性剂构成。对于口服给药，这样的赋形剂包括药物级的麦芽糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。如果需要，所述组合物还可以含有少量的无毒辅助物质如润湿剂、乳化剂或缓冲剂。

可以将所述组合物口服、经皮或非肠道给药至患者，例如，通过静脉内、皮下、腹膜内或肌内注射。对于采用口服液体制剂形式的使用，可以将所述组合物制成溶液、悬浮液、乳浊液或糖浆，以液体形式或适于在水或生理盐水中水合的干燥形式来提供。对于非肠道给药，用于非肠道给药的注射组合物通常在合适的静脉内溶液如无菌生理盐溶液中含有雷公藤内酯醇衍生物。

通过将雷公藤内酯醇衍生物(约0.5％至约20％)和任选的药物学佐剂溶解或分散于药物学上可接受的载体中，如例如，盐水、葡萄糖水溶液、甘油或乙醇中，形成溶液或悬浮液来制备液体组合物。

所述化合物还可以通过吸入给药，以气溶胶颗粒的形式，固体或液体，优选可吸入的尺寸。这样的颗粒足够小使得在吸入时通过口腔和喉并进入支气管和肺泡。通常，大小为约1至10微米，且优选小于约5微米的颗粒是可吸入的。用于吸入的液体组合物包括分散于含水载体如无菌的无热原盐水或无菌的无热原水中的活性剂。如果需要，可以将组合物与推进剂混和以促进组合物的喷雾并形成气溶胶。

制备这样剂型的方法是已知的或对本领域技术人员而言是显而易见的，例如，参见 Remingtn’s Pharmaceutical Sciences(第20版，LippincottWilliams & Wilkins，2000)。待被给药的组合物将含有有效量的选定化合物以能在患者体内产生免疫抑制或在靶细胞内导致凋亡。

例如，如Phnchagnula等(2000)所述的，药剂的分配系数或logP可以影响其用于各种给药途径的适用性，包括口服生物利用率。在此所述的化合物(通过使一个或多个羟基经氟取代)，被期望具有高于母体化合物雷公藤内酯醇的logP值，使得它们对于口服利用率来说是更好的候选物。

IV.免疫调节和抗炎治疗

因此，本发明包括本发明的化合物作为免疫抑制药的用途，例如，作为移植方法的辅助或在自体免疫疾病治疗中用途。本发明的化合物能有效抑制细胞或生物体中的免疫应答，如细胞因子的产生。如附图3-4中所示的，通式I化合物19-甲基雷公藤内酯醇(命名为PG795)，和通式II化合物18-脱氧-19-脱氢-18-苯甲酰氧-19-苯甲酰雷公藤内酯醇(命名为PG796)，以剂量依赖性的方式抑制Jurkat细胞中的IL-2产生(参见实施例4)。

已经证明免疫调节异常存在于多种自体免疫和慢性炎症疾病中，包括全身性红斑狼疮、慢性类风湿性关节炎、I型和II型糖尿病防护炎症性肠病、胆汁性肝硬化、葡萄膜炎、多发性硬化和其他疾病如节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、类天疱疮、类肉状瘤病、牛皮癣、鱼鳞病、格雷夫斯眼病和哮喘。尽管这些病症中每一种的基础发病机理差别很大，但它们具有相同的各种自体抗体和自我反应淋巴细胞的表象。这样的自我反应性可能部分是因为失去了自我平衡控制，正常免疫系统在该平衡控制下运行。

相似地，从含有成熟淋巴细胞的供体组织源移植骨髓或移植其他造血干细胞后，经转移的淋巴细胞将宿主组织抗原识别为外源的。这些细胞变成激活的并发起对宿主(移植对宿主应答)致命的攻击。此外，器官移植后，宿主淋巴细胞识别器官移植的外源组织抗原并引起细胞和抗体介导的免疫应答(宿主对移植应答)，导致移植破坏和排斥。

自体免疫或排斥反应的一个结果是由炎症细胞及其释放的介质引起的组织损伤。抗炎药物如NSAID主要通过阻断这些介质的效果或分泌来起作用，但没有改变疾病的免疫基础。另一方面，细胞毒素药，如环磷酰胺，以这样的非特异性方式起作用，切断了正常的和自体免疫应答。实际上，用这样的非特异性免疫抑制药治疗的患者很可能和死于自体免疫疾病一样死于感染。

本发明的组合物可用于该应用中，因为已经证明雷公藤内酯醇及其前体药物和其他衍生物是有效的，例如，用在免疫抑制治疗中，如治疗自身免疫疾病，预防移植排斥，或治疗或预防移植对宿主疾病(GVHD)。参见，例如，共有的美国专利No.6,150,539，在此将其引入作为参考。雷公藤内酯醇和本发明的衍生物也可用于治疗其他炎症疾病，如外伤炎症，和降低男性生育力。

组合物可用于抑制来自不相容人供体的实体器官移植、组织移植和细胞移植的排斥，因此延长移植物的存活和功能，并使接受者存活。这种用途包括，但不限于，实体器官移植(如心脏，肾脏和肝脏)、组织移植(如皮肤、小肠、胰腺、生殖腺、骨和软骨)和细胞移植(如来自胰腺、脑和神经组织、肌肉、皮肤、骨、软骨和肝脏的细胞)。

组合物还可用于抑制异种移植(种间)排斥；即，预防来自非人动物的实体器官移植、组织移植和细胞移植的排斥，不管是来自天然构成或经生物工程化(遗传操纵)来表达人基因的、RNA、蛋白质、肽或其他非天然的异种基因分子，或经生物工程化使动物的天然基因、RNA、蛋白质、肽或其他正常表达分子缺乏表达。本发明还包括用如上所述的组合物来延长这样的来自非人动物的实体器官移植物、组织移植物或细胞移植物存活的用途。

本发明还包括了治疗自体免疫疾病或具有自体免疫表征的疾病的方法，如艾迪生氏病、自体免疫溶血性贫血、自体免疫甲状腺炎、节段性回肠炎、糖尿病(I型)、格雷夫斯氏病、吉巴综合征、全身性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、多发性硬化、重症肌无力、牛皮癣、夏科氏肝硬变、类风湿性关节炎和葡萄膜炎、哮喘、动脉硬化症、Hashimoto’s甲状腺炎、过敏性脑脊髓炎、血管球性肾炎和各种过敏症。

本发明更多的用途包括治疗和预防炎症和超增生皮肤疾病和免疫介导的皮肤表征疾病，如牛皮癣、特应性皮炎、天疱疮、荨麻疹、皮肤嗜曙红细胞增多、痤疮和脱发；各种眼病如结膜炎、葡萄膜炎、角膜炎和结节病；粘膜和血管的炎症如胃溃疡，由缺血性病症和血栓形成引起的脉管损伤、缺血性肠病、炎症肠病和引起坏死的小肠结肠炎；肠炎症/过敏症如腹腔病和溃疡性结肠炎；肾病如间质性肾炎、古德帕斯丘综合征、溶血-尿毒症综合征和糖尿病性肾病；造血疾病，如先天性血小板减少症紫癜和自体免疫溶血性贫血；皮肤疾病如皮肌炎和皮肤T细胞淋巴瘤；循环系统疾病如动脉硬化和动脉粥样硬化；肾病如缺血性急性肾机能不全和慢性肾机能不全；和贝赫切特病。

本发明的组合物和方法还可用于治疗炎症疾病如哮喘，内源性和外因性的表征，例如，支气管哮喘、过敏性哮喘、内源性哮喘、外因性气喘和粉尘哮喘，尤其是慢性或长期形成的哮喘(例如，哮喘晚期和气道超响应性)。所述组合物和方法还可以用于治疗其他炎症疾病，包括外伤炎症、拉姆病中的炎症、慢性支气管炎(慢性感染性肺病)、慢性窦炎与急性呼吸道窘迫综合征相关的脓毒病和肺结节病。对于呼吸道病症如哮喘的治疗，优选通过吸入给药组合物，但也可以使用任何常规的给药途径。

治疗自体免疫病症中，以定期方式，例如每周1-2次，并以足以减轻症状和提高患者舒适度的剂量水平将组合物给药到患者。对于治疗类风湿性关节炎，尤其是，可以通过静脉内注射或通过直接注射至受到影响的关节中来给药所述组合物。在患者疾病症状发作后的几周时间内，以至少24小时的重复间隔来治疗患者。给药的剂量优选为1-25mg/kg患者体重每天，对于非肠道给药优选用较低剂量，对于口服给药，优选用较高剂量。根据本领域已知的方法通过常规实验来测定最佳剂量。

对于移植物排斥的治疗，该方法特别用于治疗心脏、肾脏、肝脏、细胞和骨髓移植的排斥，还可以用于治疗GVHD。治疗通常开始于围手术期(perioperatively)，在外科移植手术前不久或手术后不久，并以每日的剂量给药方案继续治疗，持续至少几周的时间，用于治疗急性移植排斥。在治疗阶段的过程中，对患者定期测试免疫抑制水平，例如，通过涉及异源淋巴细胞的混合淋巴细胞反应，或通过移植组织的活体切片检查。

此外，可以长期给药所述组合物来预防移植排斥，或治疗晚期移植物排斥的急性发作。如上，给药的剂量优选为1-25mg/kg患者体重每天，对于非肠道给药优选较低剂量，对于口服给药优选较高剂量。剂量可以适当提高或降低，取决于患者的应答，和在治疗阶段内，患者抵抗排斥的能力。

治疗或预防移植对宿主疾病中(该疾病是由将配对或错配的骨髓、脾细胞、胚胎组织、脐血或调动的或其他收集的干细胞移植至接受者体内而引起的)，剂量优选为0.25-2mg/kg体重/天，优选为0.5-1mg/kg/天，通过口服或非肠道来给药。

本发明范围内还包括含有通式I的化合物和一种或多种常规免疫抑制药的联合治疗。本发明范围内的这些免疫抑制药包括，但不限于，Imurek(硫唑嘌呤钠)、白瑞夸尔钠，Spanidin^TW(gusperimus三盐酸化物，也称为脱氧精液蛋白)、咪唑立宾(也称为布雷青霉素)，Cellcept(霉酚酸莫啡酯)、Neoral(环孢霉素A；还以商标Sandimmune以不同的制剂形式销售)，Prograft^TM(血流谱，也称为FK-506)，Rapimmune(sirolimus，也称为雷帕霉素)，来氟米特(也称为HWA-486)，Zenapax，糖皮质激素，如氢化泼尼松及其衍生物，抗体如正交克隆(OKT3)，和antithymyocyte球蛋白如胸腺球蛋白。当同时与另一种免疫抑制药物用于如上所述的免疫抑制治疗时，所述化合物用作增效剂。因此，常规免疫抑制药物，如上所述那些可以以远远低于单独给药的量来给药化合物(例如，标准剂量的20％至50％)。或者，本发明化合物和免疫抑制药物的给药量是使得所得到的免疫抑制效果高于以相同剂量单独使用该药物和本发明化合物所得到的免疫抑制效果。通常，在至少2周的时间段内以规则的间隔给药免疫抑制药物和增效剂。

本发明的组合物也可以与常规的一种或多种抗炎药一起给药，其中，该药物或药物的给药量本身对于诱导适当的抑制或抑制炎症是无效的。

通过使用本领域已知的已建立的动物模型来评价化合物的体内免疫抑制活性。这样的测试可用于评价免疫抑制化合物的相对功效，及估计免疫抑制治疗的适当剂量。这些测试包括例如由Ono和Lindsey(1969)所述的充分表征的同种异体移植的大鼠模型系统，其中将移植的心脏与同种接受动物的腹部大血脉相连，通过心脏在受体动物中搏动的能力来测定移植心脏的生存能力。Wang(1991)和Murase(1993)描述了异种移植模型，其中受体动物为不同的种系。评价对抗GVHD功效的模型包括给正常F1小鼠注射亲本脾细胞；小鼠产生GVHD综合征，其特征为脾肿大和免疫抑制(Komgold，1978；Gleichmann，1984)。从单个的脾制备单细胞悬浮液，并在伴刀豆球蛋白A存在和不存在下建立微孔培养物来评价致有丝分裂响应的程度。

V.抗癌治疗

如附图1-2所示，通式I化合物19-甲基雷公藤内酯醇(命名为PG795)，和通式II化合物18-脱氧-19-脱氢-18-苯甲酰氧-19-苯甲酰雷公藤内酯醇(命名为PG796)，每一个以剂量依赖性的方式对Jurkat细胞是细胞毒性的(参见实施例2)。因此本发明包括本发明的化合物作为细胞毒素剂的用途，尤其是用于治疗癌症。如在此所用的，“癌症”指的是在哺乳动物尤其是人类中发现的所有类型的癌症或肿瘤或恶性肿瘤，包括白血病、肉瘤、癌和黑素瘤。

术语“白血病”泛指血液形成器官的累积性恶性疾病，通常其特征为血液和骨髓中的白细胞及其前体的不正常增生和发育。术语“肉瘤”通常指由物质如连接组织的胚胎形成的瘤，且通常由包埋于纤维或均质体中的紧密填充细胞构成。术语“黑素瘤”指由皮肤和其他器官的黑素细胞系统引起的瘤。术语“癌”指上皮细胞构成的恶性新生长，趋于渗透周围组织并引起转移。

例如，所包括的癌症涉及源于再生组织的细胞(如足细胞，生殖细胞，发育中的或更成熟的精原细胞，精细胞或精母细胞和滋养细胞，卵巢的生殖细胞和其他细胞)、淋巴或免疫系统(如霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤)、造血系统和上皮细胞(如皮肤，包括恶性黑素瘤和胃肠道)、实体器官、神经系统，例如神经胶质瘤(参见Y.X.Zhou等，2002)和肌骨骼组织。所述化合物可用于治疗各种癌细胞类型，包含但不限于，脑，包括成神经管细胞瘤、头和颈、乳房、结肠、小细胞肺、大细胞肺、甲状腺、睾丸、膀胱、前列腺、肝脏、肾脏、胰腺、食道、胃、卵巢、子宫颈或淋巴肿瘤。尤其希望能治疗乳房、结肠、肺和前列腺肿瘤。

可以通过如上述的常规给药途径将组合物给药至遭受癌症和/或白血病折磨的患者。该方法可用于减缓肿瘤生长、预防肿瘤生长、诱导肿瘤局部消退和诱导肿瘤完全消退直至完全消失。该方法还可用于预防源自实体肿瘤的转移瘤生长。

本发明的组合物可作为单独治疗来给药，或与对患者无抗癌效果的其他支持性或治疗性处理结合来给药。该方法还包括以在患者中具有预期抗癌效果的有效量将本发明组合物结合常规抗癌药物或生物蛋白剂一起给药，其中，该药物或药剂量本身不能有效诱导适当的癌症生长抑制。这些抗癌药物包括放线菌素D、喜树碱、卡铂、顺铂、环磷酰胺、阿拉伯糖胞苷、道诺霉素、阿霉素、鬼臼乙叉苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、羟基尿素、吉西他滨、伊立替康、氨甲蝶呤、丝裂霉素C、米拖蒽醌、帕尼特西、泰索帝、替尼泊苷、托泊替康、长春碱、长春新碱端基去乙酰长春酰胺和长春瑞宾。抗癌生物蛋白剂包含肿瘤坏死因子(TNF)、TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)、其他TNF相关或TRAIL相关的配体和因子、干扰素、白细胞间介素-2、其他白细胞间介素、其他细胞因子、趋化因子和因子、肿瘤相关分子或受体的抗体(如抗-BER2抗体)以及与这些试剂反应或结合的试剂(如受体的TNF超家族成员，其他受体，受体拮抗剂和这些试剂特异性的抗体)。

通过使用公认的动物模型如Fidler等，来评价特定组合物的体内抗肿瘤活性，如在美国专利6,620,843中所述的那样。按照临床医生已知的方法，基于如疾病的严重程度和患者的所有症状因素来确定临床剂量和给药方案。

VI.其他说明

本发明的化合物也可以用于治疗某些特定的CNS疾病。谷氨酸盐可实现许多生理学功能，包括在各种神经和精神病的病理生理学中的重要作用。谷氨酸盐的兴奋毒性和神经毒性涉及组织缺氧、局部缺血和损伤，以及慢性神经变性或神经代谢疾病、阿尔茨海默症、亨延顿疾病和帕金森疾病。考虑到已报道的雷公藤内酯醇神经保护作用，特别是可保护由谷氨酸盐诱导的细胞死亡(Q.He等，2003；X.Wang等，2003)，因此本发明的化合物有望可拮抗谷氨酸盐的神经毒作用并因此可能是这种疾病的新治疗手段。

来自复发MS病人的最新证据表明脑中谷氨酸盐的动态平衡发生了改变。在MS病人中出现的神经中毒发作可能是造成少突细胞和神经元细胞死亡的原因。在MS病人中，通过用本发明的化合物治疗拮抗谷氨酸盐受体介导的兴奋毒性具有治疗学意义。其他CNS疾病如吉-巴综合征，梅尼埃病，多神经炎，多发性神经炎，单神经炎和神经根病也可以用本发明的化合物来治疗。

本发明的化合物也可以用于治疗特定的肺病。自发肺纤维化(PF)为病原未知的渐进性间质肺病。PF的特征在于细胞内基质和胶原质在肺间质组织中的过度沉积，且作为炎症和纤维化的结果逐渐由疤痕组织取代气泡。随着疾病的发展，疤痕组织的增加干扰了氧从肺转移至血流的能力。已经报道了雷公藤内酯醇的14-琥珀酸酰亚胺酯可阻断博来霉素诱导的PF(G.Krishna等，2001)。因此，本发明的化合物可用于治疗PF。还认为本发明的化合物可治疗其他呼吸道疾病，如肉状瘤病，纤维化肺以及自发性间质性肺炎。

其他涉及肺并预期通过本发明的化合物可治疗的疾病包括严重急性呼吸道综合征(SARS)和急性呼吸道窘迫征(ARDS)。特别地，关于SARS，如下所示，在疾病发展到高峰前减少病毒含量(SARS-CoV)以及采用皮质类固醇治疗的有效性表明SARS最严重的致命影响的发展可能源于身体对感染的过度应答(免疫响应过度)，而不是病毒本身的影响。(还可以参见共同未决的和共有的美国临时申请S.N.60/483,335，该申请在此将其引入作为参考)。皮质类固醇治疗已经用于SARS患者中来抑制表征免疫活动过度阶段的细胞因子的大量释放，希望在下一阶段中停止肺病的进展。皮质类固醇治疗已经产生了良好的临床结果，减少了一些SARS的主要症状。然而，存在几种与治疗相关的副作用，且非常需要更有选择性的免疫抑制剂和/或抗炎剂。

实施例

以下实施例用来说明本发明，而不是以任何途径来限制本发明。

实施例1.19-甲基雷公藤内酯醇(PG795)的制备

A.14-羟基的保护

向DMSO(8.5mL，0.12mol)雷公藤内酯醇(命名为PG490)(0.56g，1.6mmol)溶液中加入醋酸(28mL，.49mol)和醋酸酐(5.6mL，59mol)。将透明无色的溶液在室温下搅拌五天。将反应混合物倒入200mL的水中并用固体碳酸氢钠中和，分几个部分加入。用乙酸乙酯(3×150mL)来提取混合物，并将提取物通过无水硫酸钠来干燥。减压浓缩获得油状粗产物。硅层析纯化(3∶2己烷/乙酸乙酯)获得作为白色泡沫的14-(甲基硫代)甲氧基衍生物(命名为PG691)(0.45g，69％)。¹H NMR(CDCl₃)δ0.83(d，J＝6.8Hz，3H)，1.01(d，J＝6.8Hz，3H)，1.10(s，3H)，1.20(m，1H)，1.61(m，1H)，1.92(dd，J＝14.7，13.4Hz，1H)，2.19(s，3H)，2.10-2.42(m，4H)，2.70(m，1H)，3.24(d，J＝5.5Hz，1H)，3.51(d，J＝3.1Hz，1H)，3.68(s，1H)，3.79(d，J＝3.1Hz，1H)，4.68(m，2H)，4.95(d，J＝11.8Hz，1H)，5.09(d，J＝11.8Hz，1H)

B.甲基化

向无水THF(10mL)PG691(0.22g，0.52mmol)的溶液中，在-78℃逐滴加入庚烷/THF/乙苯LDA溶液(0.30mL的2.0M溶液，0.60mmol)。将所得到的溶液在该温度搅拌15分钟，接着逐滴加入碘甲烷(50μL，0.80mmol)。将反应混合物在-78℃搅拌2h，然后使其变成室温过夜。

用1N HCl来中和反应混合物，并用EtOAc(10mL×3)来提取两相溶液。用5％硫代硫酸钠溶液洗涤EtOAc溶液(10mL×2)并通过无水硫酸钠来干燥。减压浓缩获得了油状物。柱层析纯化(硅胶，3∶2己烷/乙酸乙酯)获得了两种产物，甲基硫代甲基保护的19-甲基雷公藤内酯醇(45.9mg，20％)，¹H NMR(CDCl₃)δ0.84(d，J＝6.9Hz，3H)，1.03(d，J＝6.9Hz，3H)，1.10(s，3H)，1.16(m，1H)，1.44(d，J＝6.6Hz，3H)，1.59(m，1H)，1.92(t，J＝14.0Hz，1H)，2.19(s，3H)，2.10-2.42(m，4H)，2.62(m，1H)，3.25(d，J＝5.5Hz，1H)，3.31(d，J＝3.1Hz，1H)，3.69(s，1H)，3.79(d，J＝3.2Hz，1H)，4.89(m，1H)，4.95(d，J＝11.8Hz，1H)，5.09(d，J＝11.8Hz，1H)，和甲基硫代甲基保护的18-甲氧基呋喃雷公藤内酯醇(33.1mg，15％)，¹H NMR(CDCl₃)δ0.84(d，J＝6.9Hz，3H)，1.01(s，3H)，1.02(d，J＝6.9Hz，3H)，1.30(s，3H)，1.37(m，2H)，1.69(m，2H)，1.95(dd，J＝15.0，12.6Hz，1H)，2.10(m，1H)，2.19(s，3H)，2.27-2.47(m，2H)，3.19(d，J＝5.3Hz，1H)，3.54(d，J＝3.3Hz，1H)，3.67(s，1H)，3.93(d，J＝3.3Hz，1H)，4.94(d，J＝11.9Hz，1H)，5.08(d，J＝11.9Hz，1H)，6.44(d，J＝2.0Hz，1H)。

C.去保护

向1.5mL乙腈/水(4∶1)中的如上制备的甲基硫代甲基保护的19-甲基雷公藤内酯醇(45.9mg，0.106mmol)溶液中一次性加入氯化汞(0.285g，1.05mmol)。将所得到的溶液在室温搅拌过夜。通过Celite过滤从溶液中移出沉淀出的白色固体，并用乙酸乙酯来冲洗。用5％NH₄OAc溶液将EtOAc溶液洗涤两次。将有机相干燥(Na₂SO₄)，并减压浓缩来获得粗产物。柱层析纯化(硅胶，1∶1己烷/乙酸乙酯)获得纯产物(39.5mg，99％)。¹H NMR(CDCl₃)δ0.88(d，J＝6.8Hz，3H)，1.01(d，J＝6.8Hz，3H)，1.11(s，3H)，1.16(dt，J＝11.5，2.0Hz，1H)，1.43(d，J＝6.6Hz，3H)，1.54(ddd，J＝12.4，6.4，1.3Hz，1H)，1.92(dd，J＝ 14.9，13.4Hz，1H)，2.10-2.36(m，4H)，2.62(m，1H)，2.74(d，J＝10.8Hz，1H)，3.38(d，J＝5.5Hz，1H)，3.42(d，J＝10.8Hz，1H)，3.53(dd，J＝3.1，0.9Hz，1H)，3.90(d，J＝3.1Hz，1H)，4.88(m，1H)；IR(CH₂CI₂)1754，1047cm^-1。

实施例2.18-脱氧-19-脱氢-18-苯甲酰氧-19-苯甲酰雷公藤内酯醇(PG796)的制备

A.酰基化

向无水THF(5mL)如上制备的PG691(73.1mg，0.174mmol)的溶液中，在-78℃逐滴加入庚烷/THF/乙苯中的LDA溶液(0.17mL的2.0M溶液，0.34mmol)。将所得到的溶液在该温度搅拌15分钟，接着逐滴加入纯的苯甲酰氯(100μL，0.86mmol)。将反应物在-78℃搅拌2h。用水来停止反应，并用乙酸乙酯(25mL×3)来提取混合物。将合并的有机溶液通过无水硫酸钠来干燥。减压浓缩获得油。柱层析纯化(硅胶，3∶2己烷/乙酸乙酯)获得14-保护的产物(51.2mg，47％)。¹HNMR(CDCl₃)δ0.78(d，J＝6.8Hz，3H)，0.91(d，J＝6.8Hz，3H)，1.13(s，3H)，1.17(m，1H)，1.58(m，1H)，1.86(m，1H)，2.13(s，3H)，2.17-2.39(m，3H)，2.45(d，J＝6.0Hz，1H)，2.58-2.76(m，2H)，3.21(s，1H)，3.39(d，J＝3.1Hz，1H)，3.70(d，J＝3.1Hz，1H)，4.85(d，J＝11.87Hz，1H)，4.95(d，J＝11.8Hz，1H)，7.34-7.48(m，3H)，7.56-7.65(m，2H)，7.65-7.71(m，1H)，7.71-7.78(m，2H)，8.21-8.29(m，2H)。

B.去保护

向1.5mL乙腈/水(4∶1)中的如上制备的14-甲基硫代甲基保护的产物(51.2mg，0.0814mmol)的溶液中一次性加入氯化汞(0.22g，0.81mmol)。将所得到的溶液在室温搅拌过夜。通过Celite过滤从溶液移出沉淀出的白色固体，并用乙酸乙酯冲洗。用5％的NH₄OAc溶液将EtOAc溶液洗涤两次。将有机相干燥(Na₂SO₄)，并减压浓缩获得粗产物。柱层析纯化得到纯的产物(32.8mg，71％)。¹HNMR(CDCl₃)δ0.82(d，J＝6.9Hz，3H)，0.92(d，J＝6.9Hz，3H)，1.15(s，3H)，1.17(m，1H)，1.54(m，1H)，1.88(m，1H)，2.18(七重峰，J＝6.9Hz)，2.30-2.40(m，2H)，2.53(d，J＝10.4Hz，1H)，2.56(d，J＝7.1Hz，1H)，2.61(m，1H)，2.72(ddd，J＝15.0，6.4，4.2Hz，2H)，2.98(d，J＝10.2Hz，1H)，3.40(d，J＝3.0Hz，1H)，3.81(d，J＝3.0Hz，1H)，7.35-7.47(m，3H)，7.54-7.63(m，2H)，7.63-7.71(m，1H)，7.71-7.78(m，2H)，8.21-8.28(m，2H)；IR(CH₂Cl₂)1768，1751，1236，1123cm^-1。

实施例3.细胞毒性(MTT)测试

将测试化合物以20mM的浓度溶解于DMSO中。在补充10％胎牛血清(HyClone Laboratories，Logan，UT)的RPMI1640培养基中(GIBCO，Rockville，MD)中进一步进行稀释。

在标准的MTT测试中，使用细胞扩增试剂盒I(#1465007，RocheDianostics，Mannheim，Germany)来测定化合物的细胞毒性。简而言之，在连续3倍稀释的测试化合物存在下或在与含有作为每个稀释点的测试样品的相同浓度DMSO培养基的存在下，将人T细胞淋巴瘤(Jurkat)细胞(4×10⁵/孔)在96孔的组织培养板中培养24小时。然后将培养物补充10μl/孔的MTT试剂4小时，随后用0.1ml/孔的增溶剂补充另外的16小时。在ThermoScan微量平板读数仪(MolecularDevices，Menlo Park，CA)上测量570nm处的光密度(OD₅₇₀)。

以OD₅₇₀值对化合物浓度来表示数据。附图1中给出了19-甲基雷公藤内酯醇(PG795)与雷公藤内酯醇(PG490)和培养基对照相比较的结果。附图2中给出了PG796与雷公藤内酯醇14-琥珀酸酯(PG490-88)和培养基对照相比较的结果。这种情况下，提供了人血清和小鼠血清中孵育的两种化合物的数据，且对于PG796没有孵育。

实施例4：IL-2产生的分析

将测试样品在完全组织培养基中稀释至1mM。将等份试样置于已经涂覆抗CD3抗体(用于刺激通过Jurkat细胞产生的IL-2)的微量培养平板上并制备连续稀释度使得终浓度包括以对数增加的0.001-10,000nM的范围。收集Jurkat人T细胞系指数增加培养物的细胞(#TIB-152，购自美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)，通过离心洗涤一次，重悬浮于完全组织培养基中并稀释至2×10⁶细胞/ml的浓度。将50μl体积的Jurkat细胞(1×10⁵细胞)加入含有100μl稀释化合物的孔中，向每个孔中加入50μl PMA(10ng/ml)，并将平板在5％CO₂的恒温箱中37℃培养。24小时后，将平板离心来沉淀细胞，从每个孔中取出150μl上清液并将样品存储于-20℃。使用Luminex 100(Luminex Corporation，Austin，TX)来分析所存储上清液的人IL-2浓度，Luminex微球体结合抗-IL-2捕获抗体，且荧光染料结合抗-IL-2检测抗体。数据以pg/ml的IL-2来表示。

以化合物浓度对IL-2浓度将数据作曲线。附图3中给出了19-甲基雷公藤内酯醇(PG795)与雷公藤内酯醇(PG490)和培养基对照相比较的结果。附图4中给出了PG796与雷公藤内酯醇14-琥珀酸酯(PG490-88)和培养基对照相比较的结果。这种情况下，提供了人血清和小鼠血清中孵育的两种化合物的数据，及没有孵育的PG796的数据。

Claims

1.具有结构I的化合物：

其中

其中R⁴和R⁵独立地是氢、烷基、环烷基、烯基或环烯基，其中的任何一个，除了氢以外，可以由烷氧基、羟基、酰氧基或芳基取代；

CR²R³是CHOH或C＝O；和

基团X中的至多一个是羟基，且剩余的基团X是氢。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中CR²R³是CHOH。

3.根据权利要求2所述的化合物，其中CR²R³是CHOH(β-羟基)。

4.根据权利要求1所述的化合物，其中每个X是氢。

5.根据权利要求1所述的化合物，其中每个所述的烷基、烯基、炔基、烷氧基和酰氧基包括至多四个碳原子，每个所述的环烷基和环烯基包括至多六个碳原子，且每个所述的芳基是单环和非杂环的。

6.根据权利要求5所述的化合物，其中R¹是烷基、烯基或C(OH)R⁴R⁵。

7.根据权利要求6所述的化合物，其中R⁴和R⁵独立地是氢、烷基或烯基。

8.根据权利要求1所述的化合物，其中R¹是烷基或羟基烷基。

9.根据权利要求9所述的化合物，其中R¹是C₁-C₃烷基或羟基烷基。

10.根据权利要求10所述的化合物，其中R¹是甲基。

11.根据权利要求1所述的化合物，其中R¹是芳基酰基。

12.根据权利要求11所述的化合物，其中R¹是苯甲酰基(C(O)C₆H₅)。

13.根据权利要求4所述的化合物，其中R¹是苯甲酰基。

14.具有结构II的化合物：

其中

每个R⁶独立地选自烷基、烯基、炔基或芳基；

CR²R³是CHOH或C＝O；

基团X中的至多一个是羟基，且剩余的基团X是氢。

15.根据权利要求14所述的化合物，其中CR²R³是CHOH。

16.根据权利要求15所述的化合物，其中CR²R³是CHOH(β-羟基)。

17.根据权利要求14所述的化合物，其中每个X是氢。

18.根据权利要求14所述的化合物，其中每个所述的烷基、烯基和炔基包括至多四个碳原子，且每个所述的芳基是单环和非杂环的。

19.根据权利要求14所述的化合物，其中每个R⁶是芳基。

20.根据权利要求19所述的化合物，其中每个R⁶是苯基。

21.一种影响免疫抑制的方法，包括将在药物学上可接受载体中的有效量的权利要求1或权利要求14所述的化合物给药于需要这样治疗的患者。

22.一种诱导细胞凋亡的方法，包括将所述的细胞与有效量的权利要求1或权利要求14所述的化合物接触。

23.根据权利要求1或权利要求14所述的化合物的用途，在药物学上可接受的载体中，用于在患者体内影响免疫抑制，通过将有效量的所述化合物给药到所述患者。

24.根据权利要求1或权利要求14所述的化合物用于在细胞内诱导凋亡的用途，通过将所述细胞与有效量的所述化合物接触。