CN111902149A - 透明质酸合成促进剂、促进透明质酸合成的方法和细胞评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供利用透明质酸产生细胞促进透明质酸合成的技术、评价透明质酸产生细胞对化合物的响应性的方法、或评价说明书的式1所示的多糖衍生物或其盐对透明质酸产生细胞的响应性的方法。通过使说明书中的式1所示的多糖衍生物或其盐与透明质酸产生细胞接触,从而可实现促进该透明质酸产生细胞中透明质酸的合成。另外,通过对透明质酸产生细胞使用前述多糖衍生物或其盐,从而以透明质酸产生作为指标,能够评价透明质酸产生细胞的响应性。另外,通过使用透明质酸产生细胞,从而以透明质酸产生作为指标,能够评价前述多糖衍生物或其盐的响应性。
Description
技术领域
本发明涉及利用透明质酸产生细胞促进透明质酸合成的技术。
背景技术
透明质酸是以N-乙酰基-D-葡糖胺与D-葡萄糖醛酸通过β1,3键合而成的结构作为二糖单元(构成二糖单元),由该构成二糖单元重复且通过β1,4键合而成的基本骨架所构成的糖胺聚糖的一种。透明质酸广泛地分布于生物体内软骨、关节腔的滑液(关节液)、脐带、血清、尿液、眼球的玻璃体等全身组织中,尤其富集地存在于关节液中。以细胞水平来看,几乎所有生物体内的细胞均具有合成透明质酸的功能,透明质酸被认为对生物而言是重要的物质。在关节中,无论是动态或静态的情况下,其均发挥维持关节液的润滑特性的作用。透明质酸还发挥通过在关节中降低促炎性细胞因子产生而缓解软骨变性、或通过抑制COX-2的产生而减轻疼痛等各种生理作用。
非专利文献1中报道了如下内容:与健康的人的关节液中的透明质酸相比,骨关节炎患者(以下,本说明书中也称为“OA”。)、类风湿性关节炎患者(以下,本说明书中也称为“RA”。)的关节液中,有透明质酸含量少的情况、有透明质酸分子量降低的情况。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2005/066214号
非专利文献
非专利文献1:Dahl LB,Dahl IM,Engstrom-Laurent A,and GranathK.Concentration and molecular weight of sodium hyaluronate in synovial fluidfrom patients with rheumatoid arthritis and other arthropathies.Ann.Rheum.Dis.1985;44(12):817-22.
发明内容
本发明的目的在于,提供利用透明质酸产生细胞促进透明质酸合成的技术。
本发明的其它目的在于,提供评价透明质酸产生细胞对化合物的响应性的方法。
本发明的其它目的在于,提供评价后述的式1所示的多糖衍生物或其盐对透明质酸产生细胞的响应性的方法。
本发明人等发现:通过使后述的式1所示的多糖衍生物或其盐与透明质酸产生细胞接触,从而能够促进该透明质酸产生细胞中透明质酸的合成,以至完成了本发明。
本发明的一个方面涉及用于促进透明质酸合成的、规定结构的多糖衍生物或其盐的应用。
本发明的另一方面涉及使用后述的式1所示的多糖衍生物或其盐来评价透明质酸产生细胞的响应性的方法。
附图说明
图1A是评价式1的多糖衍生物(0.1%化合物1)对由滑膜细胞产生的透明质酸的分子量的影响的结果。
图1B是评价式1的多糖衍生物(0.01%化合物1)对由滑膜细胞产生的透明质酸的分子量的影响的结果。
图2是示出:在包含式1的多糖衍生物的培养基中培养滑膜细胞的过程中,在细胞内促进产生的高分子量物质为透明质酸的结果。图中,图示板A和B分别表示无透明质酸酶处理(●)和有透明质酸酶处理(○)时的结果。
图3是示出:包含式1的多糖衍生物的培养基中的滑膜细胞的培养时间与在细胞产生的透明质酸分子量的关系的结果。图中,图示板A~C依次表示无处理、透明质酸(HA)处理和化合物1处理时的结果。
图4A是评价各种化合物对由滑膜细胞产生的透明质酸的分子量的影响的结果。
图4B是评价培养基中的双氯芬酸钠(DF-Na)浓度对由滑膜细胞产生的透明质酸的分子量的影响的结果。
图5A是评价式1的多糖衍生物对源自关节炎患者的由滑膜细胞产生的透明质酸的分子量的影响的结果。
图5B是评价式1的多糖衍生物对源自骨关节炎患者的由滑膜细胞产生的透明质酸的分子量的影响的结果。
图5C是评价式1的多糖衍生物对源自骨关节炎患者的由滑膜细胞产生的透明质酸的分子量的影响的结果。
图5D是评价式1的多糖衍生物对源自骨关节炎患者的滑膜细胞的细胞培养后的细胞数的影响的结果。
图6示出评价式1的多糖衍生物对与透明质酸合成或透明质酸分解相关的基因表达量的影响的结果。分别地,图示板A表示与透明质酸合成相关的基因HAS1~HAS3的表达水平,图示板B表示与透明质酸分解相关的基因HYAL1~HYAL3的表达水平。
图7表示评价式1的多糖衍生物对兔子关节内的透明质酸合成的影响的结果。
具体实施方式
根据本发明,可提供利用透明质酸产生细胞促进透明质酸合成的技术。
根据本发明,还可提供评价透明质酸产生细胞对化合物的响应性的方法。
以下,对本发明的实施方式进行说明,但本发明不仅限于以下的实施方式。
本说明书中,也将“透明质酸或其盐”简称为“HA”。
本说明书中“有效量”和“作为有效成分”是指:符合合理的风险/效益比且不会引起过度的不良事件的情况下充分地得到期望的响应所需的成分的量。只要作为本领域技术人员,则无需对就各要素的组合中的每一个进行独立的试验,基于一个或多个具体的试验例的结果和技术常识,也能够确定其它情况下的有效量。
本发明的一个方面涉及透明质酸合成促进剂,其含有有效量的下述式1所示的多糖衍生物或其盐;
式1中,X为源自具有羧基和羟基中的至少一者的多糖的残基;A为取代基;n为取代基A的导入率,其为1摩尔%以上且80摩尔%以下;X-A之间为前述羧基或羟基与前述取代基A的键,该键选自由酯、硫酯和酰胺组成的组;前述取代基A由下述式2表示:
*-Y-Z
式2
式2中,Y为间隔基残基或酯键;Z为双氯芬酸残基;Y为间隔基残基时,Y-Z之间的键选自由酯、硫酯和酰胺组成的组;*是与X的结合位点。
作为本发明的式1的多糖衍生物中的多糖残基所来源的多糖,可使用具有羧基和羟基中的至少一者的多糖。本发明的多糖衍生物中,多糖的羧基和/或羟基的至少一部分与取代基A形成共价键。
本说明书中的多糖衍生物可以是盐的形态。作为盐,可列举出:钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、钡盐之类的金属盐;铵盐;甲胺盐、二乙胺盐、亚乙基二胺盐、环己胺盐、乙醇胺盐之类的胺盐;盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐之类的无机酸盐;乙酸盐、苯二甲酸盐、富马酸盐、马来酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、甲烷磺酸盐、对甲苯磺酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、苹果酸盐之类的有机酸盐等,没有特别限定。多糖衍生物的盐优选碱金属盐(例如,钠盐、钾盐),更优选钠盐。
作为多糖,例如可以示例出透明质酸、软骨素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素和羧基C1~4烷基葡聚糖(例如,羧基甲基葡聚糖)等,但不限定于这些。上述多糖优选为透明质酸。
多糖可以使用动物来源或微生物来源的纯化物、化学合成等的合成物等利用任意的方法得到的多糖。
多糖衍生物及其多糖残基所来源的多糖的平均分子量没有特别限定,可示例出10000以上且5000000以下,优选为500000以上且3000000以下,更优选为600000以上且3000000以下,进一步优选为600000以上且1200000以下。需要说明的是,本说明书中,多糖衍生物、及其多糖残基所来源的多糖的“平均分子量”是指利用特性粘度法测得的重均分子量。
式1中,n为取代基A的导入率、即取代基A的数量相对于构成糖单元的数量的比率,为1摩尔%以上且80摩尔%以下。取代基A的导入率优选为5摩尔%以上且50摩尔%以下,更优选为10摩尔%以上且30摩尔%以下,进一步优选为15摩尔%以上且30摩尔%以下。
此处,本说明书中的“导入率”是利用下述计算式1算出的值,例如可以通过测定吸光度而求出。导入率是将利用咔唑吸光度法算出的单位糖单元的摩尔数、及由使用双氯芬酸特有的吸收度预先作成的校正曲线算出的取代基A的双氯芬酸的摩尔数代入下述计算式1中而得到的。导入率可以在向多糖中导入取代基A的导入反应工序中通过改变缩合剂、缩合辅助剂、间隔基分子的反应当量、取代基A的反应当量等来进行调整。需要说明的是,计算式1中的“构成糖单元”对于例如将透明质酸之类的二糖单元作为构成糖单元的多糖而言是指该构成二糖单元。
计算式1:
式1中,X-A之间是多糖的羧基和羟基中的至少一者与前述取代基A的键,选自由该酯、硫酯和酰胺组成的组。X-A之间的键优选为酯或酰胺。更优选:X-A之间不包含间隔基残基,X与Z直接键合时,X-A之间的键为酯。X-A之间通过间隔基残基而连接时,更优选多糖的羧基与间隔基残基通过酰胺键而连接。
式2中,Y为间隔基残基或酯键、Z是双氯芬酸残基。优选的一个实施方式中,多糖衍生物具有多糖的羧基的一部分与双氯芬酸残基Z通过间隔基残基连接而成的结构。
Y为酯键(X与Z的直接键合)时,X与Z是多糖的羟基与Z所具有的羧基通过酯键而连接的。
Y为间隔基残基时,Y-Z之间的键选自由酯、硫酯和酰胺组成的组中。Y为间隔基残基时,Y-Z之间的键优选为酯。
优选的一个实施方式中,X-A之间是多糖的羧基与取代基A的酰胺键;Y为间隔基残基;Y-Z之间的键为酯。
作为间隔基残基,没有特别限定,可以示例出选自由C1~6亚烷基、氨基酸残基和多肽链组成的组中的二价的连接基团。作为C1~6亚烷基,更具体而言例如可以示例出亚甲基、亚乙基、三亚甲基、异亚丙基等。作为氨基酸残基,更具体而言例如可以示例出甘氨酸残基、β-丙氨酸残基、γ-氨基丁酸残基等。多肽链例如可以是氨基酸残基数2~12的多肽链。上述间隔基残基中,优选使用C1~6亚烷基,更优选使用亚乙基、三亚甲基、异亚丙基。
对于作为间隔基残基利用的化合物(间隔基化合物),根据多糖与双氯芬酸的结合方式适宜选择与多糖的羧基和/或羟基结合的第一官能团、及与双氯芬酸结合的第二官能团中分别具有至少1个的化合物即可。
例如,与多糖的羧基之间形成酰胺键而导入间隔基残基的情况,可以选择具有氨基的间隔基化合物。与多糖的羧基之间形成酯键而导入间隔基残基的情况,可以选择具有羟基的间隔基化合物。与多糖的羧基之间形成硫酯键而导入间隔基残基的情况,可以选择具有巯基的间隔基化合物。与多糖的羟基之间形成酯键而导入间隔基残基的情况,可以选择具有羧基的间隔基化合物。作为间隔基化合物,从导入多糖中的容易性和生物体内的稳定性的观点出发,多糖残基与间隔基残基的结合方式优选为酰胺键。
另外,例如与双氯芬酸的羧基之间形成酯键而导入间隔基残基的情况,可以选择具有羟基的间隔基化合物。与双氯芬酸的羧基之间形成酰胺键而导入间隔基残基的情况,可以选择具有氨基的间隔基化合物。与双氯芬酸的羧基之间形成硫酯键而导入间隔基残基的情况,可以选择具有巯基的间隔基化合物。从通过生物降解来释放双氯芬酸的观点出发,间隔基残基与双氯芬酸残基的结合方式优选为酯键。
如上所述,间隔基化合物可以根据与多糖、双氯芬酸的结合方式来进行适宜选择,例如可列举出:C1~6二氨基烷烃、碳数1~6的氨基烷基醇、氨基酸、和多肽等。作为氨基酸,可以是天然、非天然的氨基酸,没有特别限定,例如可列举出:甘氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸。
多糖衍生物的合成中使用的双氯芬酸可以示例出游离的双氯芬酸、以及双氯芬酸钠和双氯芬酸钾等盐。
将间隔基残基和双氯芬酸残基导入多糖中的方法没有特别限定。即,可以在已导入间隔基残基的多糖中导入双氯芬酸残基,还可以使预先导入了间隔基残基的双氯芬酸与多糖反应。
使多糖、双氯芬酸和间隔基化合物各自键合的方法没有特别限定。例如只要是能够形成酯、硫酯和酰胺等的方法,作为进行该键合反应的手段就可以利用通常使用的常规方法,本领域技术人员可以进行适宜判断并选择反应条件。
作为实现间隔基化合物或间隔基键合的双氯芬酸、与多糖的羧基或羟基的键合的方法,例如可列举出:使用水溶性碳二亚胺等(例如,1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDCI·HCl)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺甲碘化物等)的水溶性的缩合剂的方法;使用N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、N-羟基苯并三唑(HOBt)等缩合辅助剂和上述的缩合剂的方法;活性酯法;酸酐法等。
制剂的特征在于用于促进对象中的透明质酸合成。本说明书中的“促进透明质酸合成”可以包括:对象中所合成的透明质酸分子量的增加和/或透明质酸生产速度的改善。透明质酸分子量的增加可以是分子量为2000000以上的透明质酸的产量的增加。
一个实施方式中,制剂含有0.01重量%以上且80重量%以下的多糖衍生物或其盐。其它实施方式中,制剂含有0.1重量%以上且10重量%以下的多糖衍生物或其盐。
制剂除了多糖衍生物或其盐之外可以包含载体。作为该载体,可优选示例出灭菌纯化水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、生理盐水等水性溶剂。一个实施方式中,制剂可通过将该载体与多糖衍生物混合而制备。根据需要,还可以在制剂中添加缓冲剂等之类的添加物。另外,对于制剂,在混合各成分后,例如还可以通过过滤器过滤等来进行除尘、除菌、灭菌等处理。一个实施方式中,制剂为粉末的形态。其它实施方式中,制剂为溶液或凝胶的形态。
优选的一个实施方式中,针对产生具有2000000以下的分子量峰的透明质酸的对象,可使用制剂。需要说明的是,该“分子量峰”是如下峰:使用高效液相色谱(HPLC)通过下述方法将试样中的透明质酸分离,使用级分收集器每0.5分钟回收级分时由级分编号1~17中向上凸起的峰:
(分子量峰测定方法)
流动相:5mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)、0.82%(w/v)NaCl:乙腈=2:1(v:v)的溶液
流速:0.5mL/分钟
柱:OH pak SB-807HQ柱,Shodex(注册商标)、柱温:35℃
注入量:10μL。
上述的试样例如可以是培养滑膜细胞的培养基或关节液等。
本发明的一个方面涉及一种试剂盒,其至少包含下述(A)和(B):
(A)上述式1所示的多糖衍生物或其盐;
(B)显示旨在用于促进透明质酸合成的使用说明书或标签。
一个实施方式中,试剂盒中包含的式1的多糖衍生物或其盐填充于小瓶、试剂瓶等容器中。一些实施方式中,填充于容器内的制剂可以以灭菌状态来提供。
上述(B)可以是示出旨在上述式1所示的多糖衍生物或其盐促进透明质酸合成的使用说明书或标签。
本发明的一个方面涉及促进透明质酸合成的方法,其包括使有效量的式1所示的多糖衍生物或其盐与透明质酸产生细胞接触的操作。使多糖衍生物或其盐与透明质酸产生细胞接触的方法没有特别限定。一个实施方式中,通过在包含式1所示的多糖衍生物或其盐的培养基中培养透明质酸产生细胞而可进行上述接触。
本说明书中的“透明质酸产生细胞”只要是产生透明质酸的动物细胞就没有特别限制,例如可以示例出滑膜细胞、软骨细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、平滑肌细胞、口腔粘膜细胞、血管内皮细胞和乳腺上皮细胞等。其中,可优选使用滑膜细胞。
本发明的一个方面涉及式1所示的多糖衍生物或其盐的、作为促进透明质酸合成的方法的用途。
本发明的一个方面涉及评价透明质酸产生细胞对式1所示的多糖衍生物或其盐的响应性的方法,其包括:(1)在包含式1的多糖衍生物或其盐的培养基中培养前述透明质酸产生细胞;及(2)测定前述培养基中的透明质酸的分子量和/或含量。培养基中的透明质酸的分子量和/或含量的测定例如可以利用实施例中记载的方法进行,或者还可以使用市售的透明质酸定量试剂盒、测定试剂等进行。
上述的评价透明质酸产生细胞的响应性的方法中,作为工序(3)还可以包括如下操作:将工序(2)中测得的透明质酸的分子量和/或含量的增加作为指标,确认前述透明质酸产生细胞对式1的多糖衍生物或其盐的响应性的存在。一个实施方式中,透明质酸的分子量和/或含量的增加可以是:在不包含式1的多糖衍生物或其盐的培养基中培养前述透明质酸产生细胞,相对于该培养后的培养基中的透明质酸的分子量和/或含量的增加。其它实施方式中,透明质酸的分子量和/或含量的增加可以是相对于工序(1)中的培养前的培养基中的透明质酸的分子量和/或含量的增加。
本发明的一个方面涉及评价式1所示的多糖衍生物或其盐对透明质酸产生细胞的响应性的方法,其包括如下操作:(1)在包含式1的多糖衍生物或其盐的培养基中培养前述透明质酸产生细胞;及(2)测定前述培养基中的透明质酸的分子量和/或含量。评价式1所示的多糖衍生物或其盐的响应性的方法中,作为工序(3)还可以包括如下操作:将工序(2)中测得的透明质酸的分子量和/或含量的增加作为指标,确认透明质酸衍生物或其盐对前述透明质酸产生细胞的响应性的存在。
本发明的一个方面涉及透明质酸的生产方法,其包括如下操作:(1’)在包含式1所示的多糖衍生物或其盐的培养基中培养透明质酸产生细胞;及(2’)从前述培养基中回收透明质酸。通过在包含式1所示的多糖衍生物或其盐的培养基中培养透明质酸产生细胞,从而能够得到分子量大的HA、或使HA产量增加。
从培养基中回收透明质酸时,作为本领域技术人员,可以利用盐析、硫酸铵分级、离心分离、透析、超滤法、吸附色谱、离子交换色谱、疏水性色谱、反相色谱、凝胶浸透色谱、亲和色谱、电泳法等它们的组合等现有公知的方法来进行。还可以根据需要利用现有公知的手段将所回收的透明质酸干燥。
本发明的一个方面涉及式1所示的多糖衍生物或其盐在制造透明质酸合成促进剂中的应用。式1所示的多糖衍生物或其盐可以用作透明质酸合成促进剂。透明质酸合成促进剂即只要是具有促进透明质酸合成的作用的物质即可。因此,还可以将式1所示的多糖衍生物或其盐用于制造用于促进透明质酸合成的制剂。
<实施方式>
以下示例出本发明的优选的实施方式。
[1]一种制剂,其特征在于,含有多糖衍生物或其盐,
前述多糖衍生物由下述式1表示,
且用于促进透明质酸合成,
式1中,X为源自具有羧基和羟基中的至少一者的多糖的残基;A为取代基;n为取代基A的导入率,其为1摩尔%以上且80摩尔%以下;X-A之间为前述羧基或羟基与前述取代基A的键,该键选自由酯、硫酯和酰胺组成的组;前述取代基A由下述式2表示:
*-Y-Z
式2
式2中,Y为间隔基残基或酯键;Z为双氯芬酸残基;Y为间隔基残基时,Y-Z之间的键选自由酯、硫酯和酰胺组成的组;*是与X的结合位点。
[2]根据[1]所述的制剂,其中,前述多糖选自由透明质酸、软骨素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素和羧基C1~4烷基葡聚糖组成的组。
[3]根据[1]或[2]所述的制剂,其中,前述间隔基残基选自由C1~6亚烷基、氨基酸残基和多肽链组成的组。
[4]根据[1]~[3]中任一项所述的制剂,其中,前述促进透明质酸合成是使用该制剂的对象中合成的透明质酸分子量的增加。
[5]根据[1]~[4]中任一项所述的制剂,其中,前述多糖的平均分子量为10000以上且5000000以下。
[6]一种试剂盒,其至少包含下述(A)和(B):
(A)上述式1所示的多糖衍生物或其盐;
(B)显示旨在用于促进透明质酸合成的使用说明书或标签。
[7]一种促进透明质酸合成的方法,其包括如下工序:使上述式1所示的多糖衍生物或其盐与透明质酸产生细胞接触。
[8]根据[7]所述的促进透明质酸合成的方法,其中,前述多糖选自由透明质酸、软骨素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素和羧基C1~4烷基葡聚糖组成的组。
[9]根据[7]或[8]所述的促进透明质酸合成的方法,其中,式1中的间隔基残基选自由C1~6亚烷基、氨基酸残基和多肽链组成的组。
[10]根据[7]~[9]中任一项所述的促进透明质酸合成的方法,其中,前述促进透明质酸合成是在前述透明质酸产生细胞中所合成的透明质酸分子量的增加。
[11]根据[7]~[10]中任一项所述的促进透明质酸合成的方法,其中,前述多糖的平均分子量为10000以上且5000000以下。
[12]根据[7]~[11]中任一项所述的促进透明质酸合成的方法,其中,前述透明质酸产生细胞选自由滑膜细胞、软骨细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、平滑肌细胞、口腔粘膜细胞、血管内皮细胞和乳腺上皮细胞组成的组。
[13]一种评价透明质酸产生细胞对上述式1所示的多糖衍生物或其盐的响应性的方法,其包括如下工序:
(1)在包含前述多糖衍生物或其盐的培养基中,培养前述透明质酸产生细胞的工序;及
(2)测定前述培养基中的透明质酸的分子量和/或含量的工序。
[14]根据[13]所述的方法,其还包括如下工序:(3)将前述透明质酸的分子量和/或含量的增加作为指标,确认前述透明质酸产生细胞对前述多糖衍生物或其盐的响应性的存在。
[15]一种透明质酸的生产方法,其包括如下工序:
(1’)在包含上述式1所示的多糖衍生物或其盐的培养基中培养透明质酸产生细胞的工序;及
(2’)从前述培养基中回收透明质酸的工序。
[16]一种试剂盒,其至少包含下述(A)和(B):
(A)上述式1所示的多糖衍生物或其盐;
(B)显示旨在上述式1所示的多糖衍生物或其盐促进透明质酸合成的使用说明书或标签。
[17]一种评价上述式1所示的多糖衍生物或其盐对透明质酸产生细胞的响应性的方法,其包括如下工序:
(1)在包含前述多糖衍生物或其盐的培养基中,培养前述透明质酸产生细胞的工序;及
(2)测定前述培养基中的透明质酸的分子量和/或含量的工序。
[18]根据[17]所述的方法,其还包括如下工序:(3)将前述透明质酸的分子量和/或含量的增加作为指标,确认前述多糖衍生物或其盐对前述透明质酸产生细胞的响应性的存在。
[19]上述式1所示的多糖衍生物或其盐的、作为促进透明质酸合成的方法的应用。
[20]根据[19]所述的应用,其中,前述促进透明质酸合成的方法包括如下工序:使式1所示的多糖衍生物或其盐与透明质酸产生细胞接触的工序。
[21]上述式1所示的多糖衍生物或其盐的、作为透明质酸产生细胞的响应评价方法中的透明质酸合成促进剂的应用。
[22]根据[21]所述的应用,其中,前述透明质酸产生细胞的响应评价方法包括下述工序:
(1)在包含前述多糖衍生物或其盐的培养基中,培养前述透明质酸产生细胞的工序;及
(2)测定前述培养基中的透明质酸的分子量和/或含量的工序。
[23]根据[22]所述的应用,其中,前述透明质酸产生细胞的响应评价方法还包括如下工序:(3)将前述透明质酸的分子量和/或含量的增加作为指标,确认前述透明质酸产生细胞对前述多糖衍生物或其盐的响应性的存在。
[24]透明质酸产生细胞的、作为上述式1所示的多糖衍生物或其盐的响应性评价方法中的透明质酸合成促进剂的应用。
[25]根据[24]所述的应用,其中,上述式1所示的多糖衍生物或其盐的响应性评价包括下述工序:
(1)在包含前述多糖衍生物或其盐的培养基中,培养前述透明质酸产生细胞的工序;及
(2)测定前述培养基中的透明质酸的分子量和/或含量的工序。
[26]根据[25]所述的应用,其中,上述式1所示的多糖衍生物或其盐的响应性评价还包括如下工序:(3)将前述透明质酸的分子量和/或含量的增加作为指标,确认前述多糖衍生物或其盐对前述透明质酸产生细胞的响应性的存在。
实施例
以下,使用实施例对本发明的优选的实施方式进行详细地说明,但本发明的保护范围不受下述的实施例的限制。另外,只要没有特别声明,则操作和物性等的测定在室温(20℃以上且25℃以下)/相对湿度40%RH以上且50%RH以下的条件下进行测定。
<实施例1>
在滑膜细胞培养系统中验证了利用式1所示的化合物促进透明质酸的合成作用。
(合成例)
利用以下的方法合成了氨基乙醇-双氯芬酸导入透明质酸钠(化合物1)。
将2-溴乙胺氢溴酸盐2.155g(10.5mmol)溶解于二氯甲烷20mL中,在冰冷下加入三乙胺1.463mL(10.5mmol),进而加入二碳酸二叔丁酯(Boc2O)2.299g(10.5mmol)的二氯甲烷溶液5mL进行搅拌。在室温下搅拌90分钟后,加入乙酸乙酯,依次用5重量%柠檬酸水溶液、水、饱和盐水进行分液清洗。用硫酸钠脱水后,减压蒸馏去除溶剂而得到Boc-氨基乙基溴化物。
将上述中得到的Boc-氨基乙基溴化物2.287g(10.2mmol)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液5mL冰冷,加入双氯芬酸钠(和光纯药工业株式会社)3.255g(10.2mmol)的DMF溶液6mL,在室温下搅拌一晚。在60℃下搅拌11小时,在室温下搅拌一晚。加入乙酸乙酯,依次用5重量%碳酸氢钠水溶液、水、饱和盐水进行分液清洗。用硫酸钠脱水后,减压蒸馏去除乙酸乙酯。用硅胶柱色谱(甲苯:乙酸乙酯=20:1(v/v)、0.5体积%三乙胺)将残渣纯化,得到Boc-氨基乙醇-双氯芬酸。
将上述中得到的Boc-氨基乙醇-双氯芬酸2.108g(4.80mmol)溶解于二氯甲烷5mL中,在冰冷下加入4M盐酸/乙酸乙酯20mL并搅拌2.5小时。加入二乙醚、己烷使其沉淀,将沉淀减压干燥。由此,得到氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐。结构通过1H-NMR进行鉴定:
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)=3.18(2H,t,NH2CH2CH2O-),3.94(2H,s,Ph-CH2-CO),4.37(2H,t,NH2CH2CH2O-),6.47-7.31(8H,m,芳香H,NH)。
将透明质酸(重均分子量:80万)500mg(1.25mmol/二糖单元)溶解于水56.3mL/二氧杂环己烷56.3mL中后,依次加入羟基琥珀酸酰亚胺(1mmol)/水0.5mL、水溶性碳二亚胺盐酸盐(WSCI·HCl)(0.5mmol)/水0.5mL、上述中得到的氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐(0.5mmol)/(水:二氧杂环己烷=1:1(v/v)、5mL),搅拌一昼夜。在反应液中加入5重量%碳酸氢钠水溶液7.5mL,搅拌约4小时。在反应液中加入50%(v/v)乙酸水溶液215μL进行中和后,加入氯化钠2.5g进行搅拌。加入乙醇400ml使其沉淀,将沉淀物用85%(v/v)乙醇水溶液清洗2次、用乙醇清洗2次、用二乙醚清洗2次,在室温下进行一晚减压干燥,得到氨基乙醇-双氯芬酸导入透明质酸钠(化合物1)。通过分光光度计测得的双氯芬酸的导入率为18摩尔%。
(试验物质)
将化合物1或透明质酸钠(HA)(ARTZ Dispo(注册商标)(生化学工业株式会社制))混合于包含磷酸缓冲液(GIBCO)和α-MEM(GIBCO)的浓缩培养基的溶液中。进而,以最终浓度成为10%(v/v)胎牛血清(以下,FBS(MP Biomedicals))、10ng/mL重组人IL-1β/IL-1F2(以下,IL-1β(R&D Systems))、1%(w/v)青霉素/链霉素(GIBCO)和370kBq/mL[3H]葡糖胺(Perkin Elmer)的方式将各试剂添加/混合于前述的溶液中。由此,作为试验物质,得到以下的5种溶液。
(1)对照溶液(不包含化合物1或HA)
(2)0.1%(w/v%)化合物1溶液
(3)0.1%(w/v%)透明质酸钠(HA)溶液
(4)0.01%(w/v%)化合物1溶液
(5)0.01%(w/v%)透明质酸钠(HA)溶液。
(试验方法)
(1)细胞培养、试验物质添加和培养上清液回收
在175cm2烧瓶中将人类风湿病患者来源滑膜细胞(HFLS-RA、CELL APPLICATIONS,INC.)传代培养而使其增殖。细胞培养使用Basal培养基(包含10%(v/v)生长添加剂、1%(w/v)青霉素/链霉素)(Cell Applications,Inc.制)。然后,以成为3.0×105细胞/2mL/孔的方式将细胞接种于6孔板中,培养约24小时直至达到汇合。细胞的培养使用α-MEM培养基(包含10%(v/v)FBS、1%(w/v)青霉素/链霉素)。去除培养上清液后,向细胞中添加试验物质2mL,进而培养48小时。在CO2孵化器(5%(v/v)CO2)内以37℃进行培养。培养结束后回收培养上清液,直至测定之前冷冻保存在超低温冷冻仪中。
(2)培养上清液的分级和辐射能测定
葡糖胺为透明质酸的构成单糖,因此在添加试验物质后在细胞内新合成的透明质酸中摄入[3H]葡糖胺。因此,使用HPLC根据分子量来分离回收的培养上清液中的透明质酸,使用级分收集器以每0.5分钟回收了级分。在回收的各级分中添加闪烁液0.5mL并进行混合。然后,使用闪烁计数器测定各级分的辐射能(dpm、每分钟衰变数),评价了辐射能([3H]葡糖胺向新产生的透明质酸中的摄入量)。HPLC条件如下所述:
流动相:5mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)、0.82%(w/v)NaCl:乙腈=2:1(v:v)的溶液
流速:0.5mL/分钟
柱:OH pak SB-805HQ柱(Shodex(注册商标))、柱温:35℃
注入量:10μL
闪烁计数器条件
3H、dpm、3分钟
闪烁液:Ultima-FloTMM流动液闪分析仪用混合物。
用HPLC将透明质酸标准溶液分离,测定波长210nm处的UV吸收。计算出回收各分子量的透明质酸标准溶液的峰顶的级分No.。作为透明质酸标准溶液,使用Select-HATM500k(平均分子量528000)、Select-HATM1000k(平均分子量1076000)、Select-HATM2500k(平均分子量2420000)。
(结果)
将结果示于图1A和图1B。
图1A
1)对照组(n=2)
2)0.1%(w/v%)透明质酸钠(HA)组(n=1)
3)0.1%(w/v%)化合物1组(n=1)。
图1B
1)对照组(n=1)
2)0.01%(w/v%)透明质酸钠(HA)组(n=1)
3)0.01%(w/v%)化合物1组(n=1)。
图1A和图1B中,通过平均值(各组例数=1~2)示出了结果。
图1A和图1B中示出:对照组中产生了以500000附近作为峰的透明质酸。另外,还示出:HA组中产生以500000~2400000附近作为峰的透明质酸,化合物1组中浓度依赖性地产生超过HA组中产生的透明质酸的高分子量的透明质酸。化合物1组中所产生的透明质酸在任意浓度下与HA组的透明质酸相比,均为高分子量。
根据以上结果,明确了:化合物1对于人类风湿病患者来源滑膜细胞具有促进高分子量透明质酸的合成的作用。该作用优于透明质酸钠,即使在0.01%(w/v)的浓度下也得到确认。
<实施例2>
通过确认有无利用透明质酸降解酶(透明质酸酶)的分解,验证了通过化合物1的作用使合成受到促进的物质为透明质酸。
(试验物质)
与实施例1的方法同样地,作为试验物质,准备了以下2种溶液。
(1)0.01%(w/v%)透明质酸钠(HA)溶液
(2)0.01%(w/v%)化合物1溶液。
(试验方法)
(1)细胞培养、试验物质添加和培养上清液回收
与实施例1的方法同样地实施。
(2)透明质酸酶处理
在添加0.01%HA溶液后将回收的培养上清液(90μL)和10μL的100TRU/mL透明质酸酶(或注射用水)混合,在37℃下使其反应一晚而进行透明质酸酶处理。在添加0.01%化合物1溶液后将回收的培养上清液(90μL)和30μL的100TRU/mL透明质酸酶(或注射用水)混合,在60℃下反应3小时而进行透明质酸酶处理。透明质酸酶(放线菌来源)从生化学BioBusiness公司购入。
(3)培养上清液的分级和辐射能测定
与实施例1的方法同样地实施。
(结果)
将结果示于图2。
图2A(各n=1)
1)0.01%HA(透明质酸酶(-))组
2)0.01%HA(透明质酸酶(+))组。
图2B(各n=1)
1)0.01%化合物1(透明质酸酶(-))组
2)0.01%化合物1(透明质酸酶(+))组。
确认了0.01%HA(透明质酸酶(-))组和0.01%化合物1(透明质酸酶(-))组均产生高分子量的辐射性物质。与0.01%HA(透明质酸酶(-))组的辐射性物质相比,0.01%化合物1(透明质酸酶(-))组的辐射性物质的分子量大。
另一方面,确认了:0.01%HA(透明质酸酶(+))组和0.01%化合物1(透明质酸酶(+))组中,这些高分子量辐射性物质的峰均消失。
根据以上结果,确认了:通过添加HA或化合物1而增加了分子量的物质为透明质酸。
<实施例3>
验证了通过化合物1促进透明质酸合成的作用的经时变化。
(试验物质)
与实施例1的方法同样地,作为试验物质,准备了以下3种溶液。
(1)对照溶液
(2)0.1%(w/v%)化合物1溶液
(3)0.1%(w/v%)透明质酸钠(HA)溶液。
(试验方法)
与实施例1的方法同样地实施。需要说明的是,在细胞中添加试验物质后的各时间点(8、24、36、48、72小时)回收了培养上清液。
(结果)
将结果示于图3。
图3A对照(8、24、36、48、72小时)组(各n=1)
图3B 0.1%HA(8、24、36、48、72小时)组(各n=1)
图3C 0.1%化合物1(8、24、36、48、72小时)组(各n=1)。
确认了:对照组、HA组和化合物1组中均产生透明质酸,透明质酸含量经时地增大。对照组中产生了以500000附近作为峰的透明质酸。HA组中产生了以1000000附近作为峰的透明质酸。与HA组相比,化合物1组中产生了高分子量的透明质酸。
根据以上结果,化合物1和透明质酸钠均诱导了高分子量透明质酸的产生,使培养基中高分子量透明质酸经时地增加。另外,化合物1组的透明质酸的分子量比HA组的分子量大。关于分子量,在任意的组中均未观察到经时的峰变动。化合物1在测定期间内始终具有内源性的高分子量透明质酸产生作用。
<实施例4>
对于通过化合物1促进透明质酸合成的作用,对作为化合物1的构成成分的透明质酸钠和双氯芬酸钠(DF-Na)进行了比较。
(试验物质)
与实施例1的方法同样地准备了对照溶液、0.01%(w/v%)化合物1溶液、和0.01%(w/v%)透明质酸钠(HA)溶液。DF-Na(0.014μg/mL、0.14μg/mL、1.4μg/mL和14μg/mL)溶液通过在对照溶液中溶解DF-Na而制备。另外,在0.01%(w/v%)透明质酸钠(HA)溶液中溶解DF-Na(1.4μg/mL)而得到HA+DF-Na混合液。
(1)对照溶液
(2)0.01%(w/v%)化合物1溶液
(3)0.01%(w/v%)透明质酸钠(HA)溶液
(4)DF-Na(0.014、0.14、1.4和14μg/mL)溶液
(5)0.01%(w/v%)透明质酸钠(HA)+DF-Na(1.4μg/mL)混合液。
(试验方法)
与实施例1的方法同样地实施。
(结果)
将结果示于图4A和图4B。
图4A(各n=2)
1)对照组
2)0.01%化合物1组
3)0.01%HA组
4)DF-Na(1.4μg/mL)组
5)0.01%HA+DF-Na(1.4μg/mL)组。
图4B
1)对照组(n=1)
2)DF-Na(0.014、0.14、1.4和14μg/mL)组(各n=1)。
需要说明的是,DF-Na(14μg/mL)的浓度相当于0.01%化合物1中包含的DF-Na浓度。
确认了:对照组中产生以500000附近作为峰的透明质酸,HA组中产生以1000000附近作为峰的透明质酸(图4A)。化合物1组中高分子量透明质酸的产生比HA组更显著。
HA+DF-Na混合液组中,与HA组同样地确认产生了以1000000附近作为峰的透明质酸(图4A)。
确认了:DF-Na组中,与对照组同样地产生了以500000附近作为峰的透明质酸(图4A)。
DF-Na组和HA+DF-Na混合液组中,未观察到化合物1组中观察到的高分子量透明质酸产生作用(图4A)。另外,DF-Na在0.014~14μg/mL的任意浓度中均未观察到透明质酸的合成促进作用(图4B)。
根据以上结果,在给予透明质酸钠、DF-Na、或HA+DF-Na混合液时未能观察到通过给予化合物1而观察到的高分子量透明质酸产生作用。即,在化合物1的构成成分的单纯的混合情况下未能观察到通过化合物1的内源性透明质酸的分子量增加作用,因此明确了是式1所示的多糖衍生物特有的作用。
<实施例5>
使用人滑膜细胞验证了通过化合物1促进透明质酸合成的作用。此时,通过使用源自多个人的滑膜细胞,研究了患者差异所产生的影响。
(试验物质)
与实施例1的方法同样地,作为试验物质,准备了以下5种溶液。
(1)对照溶液
(2)0.01%(w/v%)化合物1溶液
(3)0.01%(w/v%)透明质酸钠(HA)溶液
(4)0.1%(w/v%)化合物1溶液
(5)0.1%(w/v%)透明质酸钠(HA)溶液。
(试验方法)
(1)细胞培养、试验物质添加和培养上清液回收
与实施例1的方法同样地实施。需要说明的是,使用3位人骨关节炎患者来源滑膜细胞(HFLS-OA、CELL APPLICATIONS,INC.)和3位人类风湿病患者来源滑膜细胞(HFLS-RA、CELL APPLICATIONS,INC.)。分别对源自3位的各疾病患者的细胞(3批)进行评价,例数为3。
(2)培养上清液的分级和辐射能测定
与实施例1的方法同样地实施。需要说明的是,使用与HPLC柱(OH pak SB-805HQ柱,Shodex(注册商标))相比高分子量侧的分离能力更优异的柱(OH pak SB-807HQ柱,Shodex(注册商标))。
(3)细胞数计测
回收培养上清液后,从各孔中剥离了粘附的细胞。然后,使用台盼蓝溶液和血细胞计数板计测了细胞数。
(结果)
将结果示于图5A~图5D。
图5A(各n=3、源自3位关节炎患者的滑膜细胞)
1)对照组
2)0.01%HA组
3)0.01%化合物1组。
图5B(各n=3、源自3位骨关节炎患者的滑膜细胞)
1)对照组
2)0.01%HA组
3)0.01%化合物1组。
图5C(各n=3、源自3位骨关节炎患者的滑膜细胞)
1)对照组
2)0.1%HA组
3)0.1%化合物1组。
图5D(各n=3、源自3位骨关节炎患者的滑膜细胞)
1)对照组
2)0.1%HA组
3)0.1%化合物1组。
图5A~图5D的各图中,通过平均值±标准误差(各n=3)示出了结果。图5A(关节炎患者来源滑膜细胞)和图5B(骨关节炎患者来源滑膜细胞)中,0.01%化合物1组中,确认产生了以2400000附近作为峰的高分子量的透明质酸,0.01%HA组中,确认产生了以1000000附近作为峰的透明质酸。图5C(骨关节炎患者来源滑膜细胞)中,0.1%化合物1组中确认产生了超过2400000的高分子量透明质酸。通过使用高分子量侧的分离能力更优异的柱,进一步明确了通过给予化合物1而产生的高分子量透明质酸的分子量。另外,明确了依赖于化合物1的浓度地产生了更高分子量的透明质酸。图5D(骨关节炎患者来源滑膜细胞)中,各组的细胞数未观察到显著性差异(参数Tukey多重比较检验为p>0.05),通过添加0.1%化合物1和0.1%HA,细胞数未出现显著的增减。
如上所述,通过给予化合物1带来的高分子量透明质酸产生作用在源自关节炎患者和骨关节炎患者中任意者的滑膜细胞中也得到确认。明确了通过化合物1的透明质酸分子量的增加在试样之间的差异小。另外,化合物1与透明质酸钠相比具有诱导更高分子量的透明质酸产生的作用。另外,明确了:通过化合物1的高分子量透明质酸产生作用是使细胞中所合成的透明质酸高分子量化,而并非通过细胞数的增加所致。
<实施例6>
验证了通过化合物1的促进透明质酸合成作用的作用机理。
(试验物质)
将化合物1或透明质酸钠(HA)(ARTZ Dispo(注册商标)(生化学工业株式会社制))混合于包含磷酸缓冲液和α-MEM的浓缩培养基的溶液中。进而,以最终浓度成为10%(v/v)胎牛血清(以下,FBS)、10ng/mL重组人IL-1β/IL-1F2(以下,IL-1β)和1%(w/v)青霉素/链霉素的方式将各试剂添加/混合于前述的溶液中。由此,作为试验物质,准备了以下3种溶液。
(1)对照溶液
(2)0.1%(w/v%)化合物1溶液
(3)0.1%(w/v%)透明质酸钠(HA)溶液。
(试验方法)
(1)细胞培养、试验物质添加
在175cm2烧瓶中将人骨关节炎患者来源滑膜细胞(HFLS-OA、CELL APPLICATIONS,INC.)传代培养并使其增殖。细胞培养使用Basal培养基(包含10%(v/v)Growthsupplement、1%(w/v)青霉素/链霉素)(Cell Applications,Inc.制)。然后,以成为3.0×105细胞/2mL/孔的方式将细胞接种于6孔板中,培养约24小时直至汇合。细胞的培养使用α-MEM培养基(包含10%(v/v)FBS、1%(w/v)青霉素/链霉素)。去除培养上清液后,在孔中添加试验物质2mL,进而培养48小时。在CO2孵化器(5%(v/v)CO2)内以37℃进行培养。
(2)培养细胞中的RNA提取和cDNA试样制备
培养结束后,使用RNeasy(注册商标)Plus Mini kit(QIAGEN),从每个孔的细胞中提取了RNA。使用超微量分光光度计测定RNA浓度后,将试样冷冻保存在超低温冷冻仪中。使用提取的RNA,使用Super Script(注册商标)III First-Strand Synthesis System(Invitrogen),制备了cDNA试样。
(3)相对mRNA量的计算(实时PCR)
使用Premix ExTaq(Perfect Real Time)(Takara Bio Inc.)对cDNA试样进行实时PCR,测定靶基因(HAS1、HAS2、HAS3、HYAL1、HYAL2和HYAL3)和GAPDH的Ct值,利用ΔΔCt法计算出相对mRNA量。
probe&primer使用Taqman(注册商标)Gene Expression Assay(AppliedBiosystems)。HAS1(ID:Hs00987418_m1)、HAS2(ID:Hs00193435_m1)、HAS3(ID:Hs00193436_m1)、HYAL1(ID:Hs00201046_m1)、HYAL2(ID:Hs01117343_g1)、HYAL3(ID:Hs00185910_m1)、GAPDH(ID:Hs03929097_g1)。
(结果)
将结果示于图6(各组n=3、源自3位骨关节炎患者的滑膜细胞)。
图6A HAS1、HAS2和HAS3的相对mRNA量
1)对照组
2)0.1%HA组
3)0.1%化合物1组。
图6B HYAL1、HYAL2和HYAL3的相对mRNA量
1)对照组
2)0.1%HA组
3)0.1%化合物1组。
图6中,通过平均值±标准误差(各组例数=3)示出了结果。*和**表示各自Dunnett检验中p<0.05、p<0.01(与对照相比)。
确认了:化合物1显著抑制HYAL2 mRNA表达,显著促进HAS2 mRNA表达。另一方面,未观察到透明质酸钠对HYAL1、HYAL2、HYAL3和HAS1、HAS2、HAS3的mRNA表达的影响。
如上所述,化合物1促进与高分子量透明质酸产生相关的HAS2的mRNA表达。根据该结果,通过化合物1的促进透明质酸合成的作用机理,HAS2mRNA的表达促进所涉及的可能性高。另外,由于化合物1抑制了高分子量透明质酸分解所涉及的HYAL2的mRNA表达,因此启示出高分子量透明质酸分解的抑制也可能与该作用机理相关。
<实施例7>
验证了抗原诱导关节炎模型兔子中的、通过化合物1的促进透明质酸合成的作用。
(试验物质)
以5:1:4(v:v:v)的比例混合1%(w/v)化合物1溶液(磷酸缓冲液)、10%(w/v)卵白蛋白溶液(磷酸缓冲液)和[3H]葡糖胺(磷酸缓冲液、37MBq/mL)的各溶液,得到0.5%(w/v%)化合物1溶液。对照溶液的制备中使用磷酸缓冲液来代替上述的化合物1溶液。透明质酸钠(HA)溶液的制备中使用ARTZ Dispo(注册商标)(生化学工业株式会社制)来代替上述的化合物1溶液。另外,以3:2(v:v)的比例混合磷酸缓冲液和[3H]葡糖胺(磷酸缓冲液、37MBq/mL)的各溶液,得到不含卵白蛋白(关节炎诱发物质)的正常溶液。作为试验物质,使用以下溶液。
(1)对照溶液
(2)0.5%(w/v%)透明质酸钠(HA)溶液
(3)0.5%(w/v%)化合物1溶液
(4)正常溶液。
(试验方法)
(1)致敏、关节炎诱发、试验物质给予和关节液回收
用生理盐水液(株式会社大塚制药工厂)将卵白蛋白(SIGMA)溶解/制备成1%(w/v),制作了弗氏完全佐剂(CAPPEL)和1:1(v:v)的油包水型乳液。将乳液向全身麻醉下(咪达唑仑、赛拉嗪和布托啡分别为0.67mg/kg、5.3mg/kg和0.67mg/kg、i.v.)的日本白色种兔(雄性、16周龄、Oriental Yeast Co.,Ltd.)的背部皮内数十个位置给予共计1mL并使其致敏。在致敏后第12天同样地给予乳液,进行追加致敏。从第2次致敏起至即将进行约2~3个月后的试验物质给予(关节炎诱发)之前,用1mL生理盐水液将全身麻醉下的兔子后肢膝关节腔内清洗3次,回收了关节液。然后,以0.5mL/关节的用量将试验物质(含有关节炎诱发物质)给予兔子后肢膝关节腔内。正常组给予正常溶液(无关节炎诱发物质),未诱发关节炎。在给予后48小时,用1mL生理盐水液将全身麻醉下的兔子后肢膝关节腔内清洗3次,回收了关节液。将回收的关节液离心分离,将上清液回收/冷冻保存。
(2)链霉蛋白酶处理
将回收的关节液在100℃下加热10分钟。然后,将30μL的200μg/mL链霉蛋白酶(Merck株式会社)和270μL的关节液混合,在37℃下进行一晚酶解,由此进行链霉蛋白酶处理。将链霉蛋白酶处理后的关节液在100℃下加热10分钟后,将离心分离的上清液回收/冷冻保存。
(3)上清液的分级和辐射能测定
葡糖胺为透明质酸的构成单糖,因此在给予试验物质后在生物体内新合成的透明质酸摄入[3H]葡糖胺。因此,使用HPLC根据分子量将回收的上清液中的透明质酸分离,使用级分收集器每0.5分钟回收了级分。在回收的各级分中添加闪烁液0.5mL并混合。然后,使用闪烁计数器测定各级分的辐射能(dpm、每分钟衰变数),评价了辐射能([3H]葡糖胺向新合成的透明质酸中的摄入量)。HPLC条件如下所述:
流动相:5mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)、0.82%(w/v)NaCl:乙腈=2:1(v:v)的溶液
流速:0.5mL/分钟
柱:OH pak SB-807HQ柱(Shodex(注册商标))、柱温:35℃
注入量:100μL
闪烁计数器条件
3H、dpm、3分钟
闪烁液:Ultima-FloTMM流动液闪分析仪用混合物。
用HPLC将透明质酸标准溶液分离,测定波长210nm处的UV吸收。计算出回收各分子量的透明质酸标准溶液的峰顶的级分No.。作为标准透明质酸试样,使用链球菌透明质酸聚合物(Streptococcal Hyaluronic Acid Polymer)(平均分子量804000、Iduron Ltd)和Select-HATM2500k(平均分子量2384000)。另外,从正常兔子膝关节中回收的关节液也同样地计算出级分No.。
(结果)
将结果示于图7。
(1)对照(n=3)
(2)HA(n=3)
(3)化合物1(n=3)
(4)正常(无关节炎诱发)(n=1)。
图7中,通过平均值(n=3、仅正常组n=1)示出结果。正常兔子膝关节中合成的透明质酸观察到在高于2300000的高分子量区域的峰(正常关节液)。在给予化合物1后兔子膝关节中合成的透明质酸观察到在2300000附近的峰。与透明质酸钠给予组相比,化合物1给予组中产生的高分子量透明质酸量组是显著的。另外,与正常组相比,化合物1给予组中的透明质酸的产量更为显著。
本发明与具体的实施例和各种实施方式相关地进行了记载,但本领域技术人员应容易理解在不脱离本发明的精神和范围地进行本说明书中记载的实施方式的大量修改、应用。
本申请主张基于2018年3月27日在日本专利局申请的特愿2018-59772号的优先权,其内容作为参照整体引入本申请中。
Claims (18)
2.根据权利要求1所述的制剂,其中,所述多糖选自由透明质酸、软骨素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素和羧基C1~4烷基葡聚糖组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的制剂,其中,所述间隔基残基选自由C1~6亚烷基、氨基酸残基和多肽链组成的组。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的制剂,其中,所述促进透明质酸合成是使用该制剂的对象中合成的透明质酸分子量的增加。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的制剂,其中,所述多糖的平均分子量为10000以上且5000000以下。
8.根据权利要求7所述的促进透明质酸合成的方法,其中,所述多糖选自由透明质酸、软骨素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素和羧基C1~4烷基葡聚糖组成的组。
9.根据权利要求7或8所述的促进透明质酸合成的方法,其中,所述间隔基残基选自由C1~6亚烷基、氨基酸残基和多肽链组成的组。
10.根据权利要求7~9中任一项所述的促进透明质酸合成的方法,其中,所述促进透明质酸合成是所述透明质酸产生细胞中合成的透明质酸分子量的增加。
11.根据权利要求7~10中任一项所述的促进透明质酸合成的方法,其中,所述多糖的平均分子量为10000以上且5000000以下。
12.根据权利要求7~11中任一项所述的促进透明质酸合成的方法,其中,所述透明质酸产生细胞选自由滑膜细胞、软骨细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、平滑肌细胞、口腔粘膜细胞、血管内皮细胞和乳腺上皮细胞组成的组。
13.一种评价透明质酸产生细胞对下述式1所示的多糖衍生物或其盐的响应性的方法,其包括如下工序:
(1)在包含所述多糖衍生物或其盐的培养基中,培养所述透明质酸产生细胞的工序;及
(2)测定所述培养基中的透明质酸的分子量和/或含量的工序,
式1中,X为源自具有羧基和羟基中的至少一者的多糖的残基;A为取代基;n为取代基A的导入率,其为1摩尔%以上且80摩尔%以下;X-A之间为所述羧基或羟基与所述取代基A的键,该键选自由酯、硫酯和酰胺组成的组;所述取代基A由下述式2表示:
*-Y-Z 式2
式2中,Y为间隔基残基或酯键;Z为双氯芬酸残基;Y为间隔基残基时,Y-Z之间的键选自由酯、硫酯和酰胺组成的组;*是与X的结合位点。
14.根据权利要求13所述的方法,其还包括如下工序:(3)将所述透明质酸的分子量和/或含量的增加作为指标,确认所述透明质酸产生细胞对所述多糖衍生物或其盐的响应性的存在。
17.一种评价下述式1所示的多糖衍生物或其盐对透明质酸产生细胞的响应性的方法,其包括如下工序:
(1)在包含所述多糖衍生物或其盐的培养基中,培养所述透明质酸产生细胞的工序;及
(2)测定所述培养基中的透明质酸的分子量和/或含量的工序,
式1中,X为源自具有羧基和羟基中的至少一者的多糖的残基;A为取代基;n为取代基A的导入率,其为1摩尔%以上且80摩尔%以下;X-A之间为所述羧基或羟基与所述取代基A的键,该键选自由酯、硫酯和酰胺组成的组;所述取代基A由下述式2表示:
*-Y-Z 式2
式2中,Y为间隔基残基或酯键;Z为双氯芬酸残基;Y为间隔基残基时,Y-Z之间的键选自由酯、硫酯和酰胺组成的组;*是与X的结合位点。
18.根据权利要求17所述的方法,其还包括如下工序:(3)将所述透明质酸的分子量和/或含量的增加作为指标,确认所述多糖衍生物或其盐对所述透明质酸产生细胞的响应性的存在。
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