JP6692505B2

JP6692505B2 - ヒアルロン酸合成促進剤、ヒアルロン酸合成促進方法、および細胞評価方法

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Description

本発明は、ヒアルロン酸産生細胞によるヒアルロン酸合成の促進技術に関する。

ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸とがβ１，３結合した構造を二糖単位（構成二糖単位）とし、当該構成二糖単位が繰り返しβ１，４結合した基本骨格により構成されたグリコサミノグリカンの一種である。ヒアルロン酸は、生体内において軟骨、関節腔の滑液（関節液）、臍帯、血清、尿、眼の硝子体等、広く全身組織に分布し、特に関節液中に豊富に存在する。細胞レベルにおいて、生体内のほとんど全ての細胞がヒアルロン酸を合成する機能を有しており、ヒアルロン酸は生物にとって重要な物質と考えられている。関節においては、動的状況および静的状況のいずれにおいても関節液の潤滑特性を維持する役割を果たしている。ヒアルロン酸はまた、関節において、炎症誘発性サイトカイン産生を低下させて軟骨変性を和らげたり、ＣＯＸ−２の産生を抑制することで疼痛を減弱させたりするなどの、様々な生理的役割をも担っている。
非特許文献１には、健常者の関節液におけるヒアルロン酸と比べて、変形性関節症患者（以下、本明細書において「ＯＡ」とも称する。）やリウマチ性関節症患者（以下、本明細書において「ＲＡ」とも称する。）の関節液では、ヒアルロン酸含有量が少ない場合やヒアルロン酸分子量が低下している場合があることが報告されている。

国際公開第２００５／０６６２１４号

ＤａｈｌＬＢ，ＤａｈｌＩＭ，Ｅｎｇｓｔｒoｍ−ＬａｕｒｅｎｔＡ，ａｎｄＧｒａｎａｔｈＫ．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆｓｏｄｉｕｍｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅｉｎｓｙｎｏｖｉａｌｆｌｕｉｄｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓａｎｄｏｔｈｅｒａｒｔｈｒｏｐａｔｈｉｅｓ．Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．１９８５；４４（１２）：８１７−２２．

本発明の目的は、ヒアルロン酸産生細胞によるヒアルロン酸合成の促進技術を提供することにある。
本発明の別の目的は、ヒアルロン酸産生細胞の化合物に対する応答性を評価する方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、ヒアルロン酸産生細胞に対する、後述の式１で表される多糖誘導体またはその塩の応答性を評価する方法を提供することにある。

本発明者らは、後述の式１で表される多糖誘導体またはその塩をヒアルロン酸産生細胞に接触させることにより、当該ヒアルロン酸産生細胞においてヒアルロン酸の合成を促進することができることを見出し、本発明の完成に至った。
本発明の一側面は、ヒアルロン酸合成促進のための、所定構造の多糖誘導体またはその塩の使用に関する。
本発明の別の側面は、後述の式１で表される多糖誘導体またはその塩を用いて、ヒアルロン酸産生細胞の応答性を評価する方法に関する。

図１Ａは、滑膜細胞により生産されるヒアルロン酸の分子量に対する、式１の多糖誘導体（０．１％化合物１）の影響を評価した結果である。図１Ｂは、滑膜細胞により生産されるヒアルロン酸の分子量に対する、式１の多糖誘導体（０．０１％化合物１）の影響を評価した結果である。図２は、式１の多糖誘導体を含む培地中で滑膜細胞を培養する過程において、細胞内で生産が促進された高分子量物質がヒアルロン酸であることを示す結果である。図中、パネルＡ及びＢはそれぞれ、ヒアルロニダーゼ処理なし（●）、及び処理あり（○）の場合の結果を示す。図３は、式１の多糖誘導体を含む培地中での滑膜細胞の培養時間と、細胞で生産されたヒアルロン酸分子量との関係を示す結果である。図中、パネルＡ〜Ｃは、順に、無処理、ヒアルロン酸（ＨＡ）処理、及び化合物１処理の場合の結果を示す。図４Ａは、滑膜細胞により生産されるヒアルロン酸の分子量に対する、種々の化合物の影響を評価した結果である。図４Ｂは、滑膜細胞により生産されるヒアルロン酸の分子量に対する、培地中のジクロフェナクナトリウム（ＤＦ-Ｎａ）濃度の影響を評価した結果である。図５Ａは、リウマチ患者に由来する滑膜細胞により生産されるヒアルロン酸の分子量に対する、式１の多糖誘導体の影響を評価した結果である。図５Ｂは、変形性関節症患者に由来する滑膜細胞により生産されるヒアルロン酸の分子量に対する、式１の多糖誘導体の影響を評価した結果である。図５Ｃは、変形性関節症患者に由来する滑膜細胞により生産されるヒアルロン酸の分子量に対する、式１の多糖誘導体の影響を評価した結果である。図５Ｄは、変形性関節症患者に由来する滑膜細胞の細胞培養後の細胞数に対する、式１の多糖誘導体の影響を評価した結果である。図６は、ヒアルロン酸合成またはヒアルロン酸分解に関わる遺伝子発現量に対する、式１の多糖誘導体の影響を評価した結果を示す。パネルＡはヒアルロン酸合成に関わる遺伝子ＨＡＳ１〜ＨＡＳ３の発現レベルを、パネルＢはヒアルロン酸分解に関わる遺伝子ＨＹＡＬ１〜ＨＹＡＬ３の発現レベルを、それぞれ示す。図７は、ウサギ関節内でのヒアルロン酸合成に対する、式１の多糖誘導体の影響を評価した結果を示す。

本発明によれば、ヒアルロン酸産生細胞によるヒアルロン酸合成を促進する技術が提供される。
本発明によればまた、ヒアルロン酸産生細胞の化合物に対する応答性を評価する方法が提供される。

以下、本発明の実施の形態を説明するが、本発明が以下の実施の形態のみに限定されるものではない。
本明細書において、「ヒアルロン酸またはその塩」を、単に「ＨＡ」とも称する。
本明細書において「有効量」および「有効成分として」とは、合理的なリスク／ベネフィット比に見合って、且つ過度の有害事象を生じさせずに、所望の応答を得るのに十分な成分の量を意味する。当業者であれば、諸要素の組み合わせのそれぞれについての個別の試験を要するまでもなく、一又は複数の具体的な試験例の結果と技術常識とに基づいて、他の場合における有効量をも決定することができる。
本発明の一側面は、下記式１で表される多糖誘導体またはその塩の有効量を含有する、ヒアルロン酸合成促進剤に関する；

式１中、Ｘはカルボキシ基および水酸基の少なくとも一方を有する多糖由来の残基であり；Ａは置換基であり；ｎは置換基Ａの導入率であって、１モル％以上８０モル％以下であり；Ｘ−Ａ間は、前記カルボキシ基または水酸基と前記置換基Ａとの結合であって、当該結合はエステル、チオエステル、およびアミドからなる群から選択され；前記置換基Ａは下記式２で表され：

式２中、Ｙはスペーサー残基またはエステル結合であり；Ｚはジクロフェナク残基であり；Ｙがスペーサー残基の場合、Ｙ−Ｚ間の結合はエステル、チオエステル、およびアミドからなる群から選択され；＊はＸとの結合部位である。

本発明に係る式１の多糖誘導体における多糖残基が由来する多糖としては、カルボキシ基および水酸基の少なくとも一方を有するものが用いられる。本発明に係る多糖誘導体では、多糖のカルボキシ基および／または水酸基の少なくとも一部と、置換基Ａとが共有結合を形成する。

本明細書における多糖誘導体は、塩の形態であってもよい。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩のような金属塩；アンモニウム塩；メチルアミン塩、ジエチルアミン塩、エチレンジアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩のようなアミン塩；塩酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、硝酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のような無機酸塩；酢酸塩、フタル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、酒石酸塩、酒石酸水素塩、リンゴ酸塩のような有機酸塩等が挙げられるが、特に限定されない。多糖誘導体の塩は、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）が好ましく、ナトリウム塩がより好ましい。
多糖としては、例えば、ヒアルロン酸、コンドロチン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびカルボキシＣ_１〜_４アルキルデキストラン（例えば、カルボキシメチルデキストラン）などが例示できるが、これらに限定されない。好ましくは、上記多糖は、ヒアルロン酸である。
多糖は、動物由来、または微生物由来の精製物、化学的合成等の合成物など、いずれの手法により得られたものであっても用いることが可能である。

多糖誘導体、およびその多糖残基が由来する多糖の平均分子量は特に限定されないが、１０，０００以上５，０００，０００以下が例示され、好ましくは５００，０００以上３，０００，０００以下、より好ましくは６００，０００以上３，０００，０００以下、さらに好ましくは６００，０００以上１，２００，０００以下である。なお、本明細書において、多糖誘導体、およびその多糖残基が由来する多糖の「平均分子量」は、極限粘度法により測定した重量平均分子量を指す。

式１中、ｎは置換基Ａの導入率、すなわち構成糖単位の数に対する置換基Aの数の割合であって、１モル％以上８０モル％以下である。置換基Ａの導入率は、好ましくは５モル％以上５０モル％以下であり、より好ましくは１０モル％以上３０モル％以下であり、更に好ましくは１５モル％以上３０モル％以下である。
ここで、本明細書における「導入率」とは、下記計算式１にて算出される値であり、例えば吸光度測定により求めることができる。導入率は、カルバゾール吸光度法により算出した糖単位当たりのモル数と、ジクロフェナク特有の吸収度を用いて予め作成した検量線から算出した置換基Ａのジクロフェナクのモル数とを、下記計算式１に当てはめることにより得られる。導入率は、多糖への置換基Ａの導入反応工程において、縮合剤、縮合補助剤、スペーサー分子の反応当量、置換基Ａの反応当量等を変えることにより調整可能である。なお、計算式１における「構成糖単位」とは、例えばヒアルロン酸のような二糖単位を構成糖単位とする多糖については、当該構成二糖単位を指す。

式１中、Ｘ−Ａ間は、多糖のカルボキシ基および水酸基の少なくとも一方と前記置換基Ａとの結合であって、当該エステル、チオエステル、およびアミドからなる群から選択される。好ましくは、Ｘ−Ａ間の結合は、エステルまたはアミドである。Ｘ−Ａ間にスペーサー残基が含まれず、ＸとＺとが直接結合している場合、Ｘ−Ａ間の結合はエステルである。Ｘ−Ａ間がスペーサー残基を介して結合している場合、多糖のカルボキシ基とスペーサー残基とがアミド結合で連結されていることがより好ましい。

式２において、Ｙはスペーサー残基またはエステル結合であり、Ｚはジクロフェナク残基である。好ましい一実施形態では、多糖誘導体は、スペーサー残基を介して、多糖のカルボキシ基の一部とジクロフェナク残基Ｚとが連結した構造を有する。
Ｙがエステル結合（ＸとＺとの直接結合）の場合、ＸとＺとは、多糖の水酸基とＺが有するカルボキシ基とがエステル結合によって連結される。
Ｙがスペーサー残基の場合、Ｙ−Ｚ間の結合はエステル、チオエステル、およびアミドからなる群から選択される。Ｙがスペーサー残基の場合、Ｙ−Ｚ間の結合はエステルであることが好ましい。

好ましい一実施形態では、Ｘ−Ａ間は、多糖のカルボキシ基と置換基Ａとのアミド結合であり；Ｙはスペーサー残基であり；Ｙ−Ｚ間の結合はエステルである。
スペーサー残基としては、特に限定されないが、Ｃ_１〜_６アルキレン基、アミノ酸残基、およびポリペプチド鎖からなる群から選択される二価の連結基が例示できる。Ｃ_１〜_６アルキレン基としては、より具体的には、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基などが例示できる。アミノ酸残基としては、より具体的には、例えば、グリシン残基、β−アラニン残基、γ−アミノ酪酸残基などが例示できる。ポリペプチド鎖は、例えば、アミノ酸残基数２〜１２のポリペプチド鎖であり得る。上記スペーサー残基のうち、好ましくはＣ_１〜_６アルキレン基が用いられ、より好ましくはエチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基が用いられる。

スペーサー残基として利用する化合物（スペーサー化合物）は、多糖のカルボキシ基および／または水酸基と結合する第一の官能基、およびジクロフェナクと結合する第二の官能基を、それぞれ少なくとも１つ有するものを、多糖およびジクロフェナクとの結合様式に応じて適宜選択すればよい。
例えば、多糖のカルボキシ基との間でアミド結合を形成させてスペーサー残基を導入する場合は、アミノ基を有するスペーサー化合物が選択され得る。多糖のカルボキシ基との間でエステル結合を形成させてスペーサー残基を導入する場合は、水酸基を有するスペーサー化合物が選択され得る。多糖のカルボキシ基との間でチオエステル結合を形成させてスペーサー残基を導入する場合は、メルカプト基を有するスペーサー化合物が選択され得る。多糖の水酸基との間でエステル結合を形成させてスペーサー残基を導入する場合は、カルボキシ基を有するスペーサー化合物が選択され得る。スペーサー化合物としては、多糖への導入のし易さおよび生体内での安定性の観点から、多糖残基とスペーサー残基との結合様式はアミド結合であることが好ましい。
また、例えば、ジクロフェナクのカルボキシ基との間でエステル結合を形成させてスペーサー残基を導入する場合は、水酸基を有するスペーサー化合物が選択され得る。ジクロフェナクのカルボキシ基との間でアミド結合を形成させてスペーサー残基を導入する場合は、アミノ基を有するスペーサー化合物が選択され得る。ジクロフェナクのカルボキシ基との間でチオエステル結合を形成させてスペーサー残基を導入する場合は、メルカプト基を有するスペーサー化合物が選択され得る。生分解によるジクロフェナクのリリースの観点から、スペーサー残基とジクロフェナク残基との結合様式はエステル結合であることが好ましい。
スペーサー化合物は、上述の様に、多糖やジクロフェナクとの結合様式に応じて適宜選択可能であるが、例えば、Ｃ_１〜_６ジアミノアルカン、炭素数１〜６のアミノアルキルアルコール、アミノ酸、およびポリペプチド等が挙げられる。アミノ酸としては、天然、非天然のアミノ酸であってもよく、特に限定されないが、例えば、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸が挙げられる。

多糖誘導体の合成に用いるジクロフェナクは、遊離のジクロフェナク、ならびにジクロフェナクナトリウムおよびジクロフェナクカリウム等の塩を例示できる。
多糖にスペーサー残基およびジクロフェナク残基を導入する方法は、特に限定されない。すなわち、スペーサー残基を導入した多糖にジクロフェナク残基を導入してもよく、予めスペーサー残基を導入したジクロフェナクを多糖と反応させてもよい。

多糖、ジクロフェナク、およびスペーサー化合物をそれぞれ結合させる方法は特に限定されない。例えば、エステル、チオエステル、およびアミドなどを形成できる方法であれば、該結合反応を行う手段として一般的に用いられる常法を用いることが可能であり、反応条件に関しても当業者が適宜判断し選択することが出来る。
スペーサー化合物またはスペーサー結合ジクロフェナクと、多糖のカルボキシ基または水酸基との結合を達成する方法として、例えば水溶性カルボジイミド等（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドメチオジド等）の水溶性の縮合剤を使用する方法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）やＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）等の縮合補助剤と上記の縮合剤とを使用する方法、活性エステル法、酸無水物法等が挙げられる。

製剤は、対象におけるヒアルロン酸合成促進のために用いられることを特徴とする。本明細書における「ヒアルロン酸合成促進」は、対象において合成されるヒアルロン酸分子量の増加、および／またはヒアルロン酸生産速度の向上を含み得る。ヒアルロン酸分子量の増加は、分子量が２，０００，０００以上であるヒアルロン酸の生産量の増加であり得る。
一実施形態では、製剤は、０．０１重量％以上８０重量％以下の多糖誘導体またはその塩を含有する。他の実施形態では、製剤は、０．１重量％以上１０重量％以下の多糖誘導体またはその塩を含有する。
製剤は、多糖誘導体またはその塩に加えて、担体を含み得る。当該担体としては、滅菌精製水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等の水性溶媒が好ましく例示される。一実施形態では、製剤は、当該担体と多糖誘導体とを混合することにより調製される。必要に応じ、緩衝剤などのような添加物を製剤に添加してもよい。また、製剤は、各成分の混合後に、例えばフィルター濾過等により、除塵、除菌、滅菌等の処理を行ってもよい。一実施形態では、製剤は粉末の形態である。他の実施形態では、製剤は溶液またはゲルの形態である。

好ましい一実施形態では、２，０００，０００以下の分子量ピークを有するヒアルロン酸を産生する対象に対して、製剤が用いられる。なお、当該「分子量ピーク」は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた下記方法によって試料中のヒアルロン酸を分離し、フラクションコレクターを用いて０．５分毎にフラクションを回収した場合の、フラクションナンバー１〜１７における上に凸なピークである：

（分子量ピーク測定方法）
移動相：５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、０．８２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ：アセトニトリル＝２：１（ｖ：ｖ）の溶液
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム：ＯＨｐａｋＳＢ−８０７ＨＱｃｏｌｕｍｎ，Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）、カラム温度：３５℃
注入量：１０μＬ。
上記の試料は、例えば、滑膜細胞を培養した培地、または関節液等であり得る。

本発明の一側面は、少なくとも下記（Ａ）および（Ｂ）を含むキットに関する：
（Ａ）上記式１で表される多糖誘導体またはその塩
（Ｂ）ヒアルロン酸合成促進のために用いられることを示す使用説明書またはラベル。
一実施形態では、キットに含まれる式１の多糖誘導体またはその塩は、バイアルや試薬瓶等の容器に充填されている。ある実施形態では、容器内に充填された製剤は、滅菌状態で提供され得る。
上記（Ｂ）は、上記式１で表される多糖誘導体またはその塩が、ヒアルロン酸合成が促進される旨を示す使用説明書またはラベルであってもよい。

本発明の一側面は、式１で表される多糖誘導体またはその塩の有効量をヒアルロン酸産生細胞に接触させることを含む、ヒアルロン酸の合成促進方法に関する。多糖誘導体またはその塩をヒアルロン酸産生細胞に対して接触させる方法は、特に制限されない。一実施形態では、式１で表される多糖誘導体またはその塩を含む培地中でヒアルロン酸産生細胞を培養することにより、上記接触は行われ得る。
本明細書における「ヒアルロン酸産生細胞」は、ヒアルロン酸を産生する動物細胞であれば特に制限されないが、例えば、滑膜細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞、角化細胞、平滑筋細胞、口腔粘膜細胞、血管内皮細胞、および乳腺上皮細胞等が例示できる。このうち、滑膜細胞が好ましく用いられる。
本発明の一側面は、式１で表される多糖誘導体またはその塩の、ヒアルロン酸の合成促進方法としての用途に関する。

本発明の一側面は、式１で表される多糖誘導体またはその塩に対する、ヒアルロン酸産生細胞の応答性を評価する方法であって、（１）式１の多糖誘導体またはその塩を含む培地中で、前記ヒアルロン酸産生細胞を培養すること、および（２）前記培地中のヒアルロン酸の分子量および／または含有量を測定することを含む方法、に関する。培地中のヒアルロン酸の分子量および／または含有量の測定は、例えば実施例に記載の方法により行ってもよく、または市販のヒアルロン酸定量キットや測定試薬等を用いて行ってもよい。
上記のヒアルロン酸産生細胞の応答性を評価する方法は、工程（３）として、工程（２）において測定されたヒアルロン酸の分子量および／または含有量の増加を指標として、式１の多糖誘導体またはその塩に対する前記ヒアルロン酸産生細胞の応答性の存在を認めることを含んでもよい。一実施形態では、ヒアルロン酸の分子量および／または含有量の増加は、式１の多糖誘導体またはその塩を含まない培地中で前記ヒアルロン酸産生細胞を培養し、当該培養後の培地中のヒアルロン酸の分子量および／または含有量に対する増加であり得る。別の実施形態では、ヒアルロン酸の分子量および／または含有量の増加は、工程（１）における培養前の培地中のヒアルロン酸の分子量および／または含有量に対する増加であり得る。

本発明の一側面は、ヒアルロン酸産生細胞に対する、式１で示される多糖誘導体またはその塩の応答性を評価する方法であって、（１）式１の多糖誘導体またはその塩を含む培地中で、前記ヒアルロン酸産生細胞を培養すること、および（２）前記培地中のヒアルロン酸の分子量および／または含有量を測定することを含む方法、に関する。式１で示される多糖誘導体またはその塩の応答性を評価する方法は、工程（３）として、工程（２）において測定されたヒアルロン酸の分子量および／または含有量の増加を指標として、前記ヒアルロン酸産生細胞に対するヒアルロン酸誘導体またはその塩の応答性の存在を認めることを含んでいてもよい。

本発明の一側面は、ヒアルロン酸の生産方法であって、（１’）式１で表される多糖誘導体またはその塩を含む培地中で、ヒアルロン酸産生細胞を培養すること、および（２’）前記培地からヒアルロン酸を回収することを含む方法、に関する。式１で表される多糖誘導体またはその塩を含む培地中でヒアルロン酸産生細胞を培養することで、分子量の大きなＨＡを得たり、ＨＡ生産量を増加させたりできる。
培地からのヒアルロン酸の回収は、当業者であれば、塩析、硫安分画、遠心分離、透析、限外ろ過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の従来公知の手法により行うことができる。回収されたヒアルロン酸を、必要に応じて、従来公知の手段により乾燥してもよい。

本発明の一側面は、式１で示される多糖誘導体またはその塩の、ヒアルロン酸合成促進剤の製造における使用、に関する。式１で示される多糖誘導体またはその塩は、ヒアルロン酸合成促進剤として用いることができる。ヒアルロン酸合成促進剤とは、すなわち、ヒアルロン酸合成を促進する作用を有するものであればよい。このため、式１で示される多糖誘導体またはその塩をヒアルロン酸合成促進のための製剤の製造のために使用することもできる。

＜実施形態＞
本発明の好ましい実施形態を以下に例示する。
［１］多糖誘導体またはその塩を含有する製剤であって、
前記多糖誘導体は下記式１で表され、
ヒアルロン酸合成促進のために用いられることを特徴とする、製剤：

式２中、Ｙはスペーサー残基またはエステル結合であり；Ｚはジクロフェナク残基であり；Ｙがスペーサー残基の場合、Ｙ−Ｚ間の結合はエステル、チオエステル、およびアミドからなる群から選択され；＊はＸとの結合部位である。
［２］前記多糖が、ヒアルロン酸、コンドロチン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびカルボキシＣ_１〜_４アルキルデキストランからなる群から選択される［１］に記載の製剤。
［３］前記スペーサー残基が、Ｃ_１〜_６アルキレン基、アミノ酸残基、およびポリペプチド鎖からなる群から選択される、［１］または［２］に記載の製剤。
［４］前記ヒアルロン酸合成促進が、当該製剤が用いられる対象において合成されるヒアルロン酸分子量の増加である、［１］から［３］のいずれか１つに記載の製剤。
［５］前記多糖の平均分子量が１０，０００以上５，０００，０００以下である、［１］から［４］のいずれか１つに記載の製剤。
［６］少なくとも下記（Ａ）および（Ｂ）を含む、キット：
（Ａ）上記式１で表される多糖誘導体またはその塩
（Ｂ）ヒアルロン酸合成促進のために用いられることを示す使用説明書またはラベル。
［７］上記式１で表される多糖誘導体またはその塩を、ヒアルロン酸産生細胞に接触させる工程を含む、ヒアルロン酸の合成促進方法。
［８］前記多糖が、ヒアルロン酸、コンドロチン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびカルボキシＣ_１〜_４アルキルデキストランからなる群から選択される、［７］に記載のヒアルロン酸の合成促進方法。
［９］式１におけるスペーサー残基が、Ｃ_１〜_６アルキレン基、アミノ酸残基、およびポリペプチド鎖からなる群から選択される、［７］または［８］に記載のヒアルロン酸の合成促進方法。
［１０］前記ヒアルロン酸合成促進が、前記ヒアルロン酸産生細胞において合成されるヒアルロン酸分子量の増加である、［７］から［９］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸の合成促進方法。
［１１］前記多糖の平均分子量が１０，０００以上５，０００，０００以下である、［７］から［１０］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸の合成促進方法。
［１２］前記ヒアルロン酸産生細胞が滑膜細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞、角化細胞、平滑筋細胞、口腔粘膜細胞、血管内皮細胞、および乳腺上皮細胞からなる群から選択される、［７］から［１１］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸の合成促進方法。
［１３］上記式１で表される多糖誘導体またはその塩に対する、ヒアルロン酸産生細胞の応答性を評価する方法であって、
（１）前記多糖誘導体またはその塩を含む培地中で、前記ヒアルロン酸産生細胞を培養する工程、および
（２）前記培地中のヒアルロン酸の分子量および／または含有量を測定する工程、を含む、
方法。
［１４］（３）前記ヒアルロン酸の分子量および／または含有量の増加を指標として、前記多糖誘導体またはその塩に対する前記ヒアルロン酸産生細胞の応答性の存在を認める工程をさらに含む、［１３］に記載の方法。
［１５］ヒアルロン酸の生産方法であって、
（１’）上記式１で表される多糖誘導体またはその塩を含む培地中で、ヒアルロン酸産生細胞を培養する工程、および
（２’）前記培地からヒアルロン酸を回収する工程、を含む、
方法。
［１６］少なくとも下記（Ａ）および（Ｂ）を含む、キット：
（Ａ）上記式１で表される多糖誘導体またはその塩
（Ｂ）上記式１で示される多糖誘導体またはその塩が、ヒアルロン酸合成を促進させる旨を示す使用説明書またはラベル。
［１７］ヒアルロン酸産生細胞に対する、上記式１で表される多糖誘導体またはその塩の応答性を評価する方法であって、
（１）前記多糖誘導体またはその塩を含む培地中で、前記ヒアルロン酸産生細胞を培養する工程、および
（２）前記培地中のヒアルロン酸の分子量および／または含有量を測定する工程、を含む、
方法。
［１８］（３）前記ヒアルロン酸の分子量および／または含有量の増加を指標として、前記ヒアルロン酸産生細胞に対する前記多糖誘導体またはその塩の応答性の存在を認める工程をさらに含む、［１７］に記載の方法。
［１９］上記式１で表される多糖誘導体またはその塩の、ヒアルロン酸の合成促進方法としての使用。
［２０］前記ヒアルロン酸の合成促進方法は、式１で表される多糖誘導体またはその塩を、ヒアルロン酸産生細胞に接触させる工程を含む、［１９］に記載の使用。
［２１］上記式１で示される多糖誘導体またはその塩の、ヒアルロン酸産生細胞の応答評価方法におけるヒアルロン酸合成促進剤としての使用。
［２２］前記ヒアルロン酸産生細胞の応答評価方法は、下記工程を含む［２１］に記載の使用：
（１）前記多糖誘導体またはその塩を含む培地中で、前記ヒアルロン酸産生細胞を培養する工程、および
（２）前記培地中のヒアルロン酸の分子量および／または含有量を測定する工程。
［２３］前記ヒアルロン酸産生細胞の応答評価方法は、（３）前記ヒアルロン酸の分子量および／または含有量の増加を指標として、前記多糖誘導体またはその塩に対する前記ヒアルロン酸産生細胞の応答性の存在を認める工程をさらに含む、［２２］に記載の使用。
［２４］ヒアルロン酸産生細胞の、上記式１で表される多糖誘導体またはその塩の応答性評価方法におけるヒアルロン酸合成促進剤としての使用。
［２５］上記式１で表される多糖誘導体またはその塩の応答性評価は、下記工程を含む［２４］に記載の使用：
（１）前記多糖誘導体またはその塩を含む培地中で、前記ヒアルロン酸産生細胞を培養する工程、および
（２）前記培地中のヒアルロン酸の分子量および／または含有量を測定する工程。
［２６］上記式１で表される多糖誘導体またはその塩の応答性評価は、（３）前記ヒアルロン酸の分子量および／または含有量の増加を指標として、前記ヒアルロン酸産生細胞に対する前記多糖誘導体またはその塩の応答性の存在を認める工程をさらに含む、［２５］に記載の使用。

以下、実施例を用いて本発明の好ましい実施形態についてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例によって限定されるわけではない。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０℃以上２５℃以下）／相対湿度４０％ＲＨ以上５０％ＲＨ以下の条件で測定した。

＜実施例１＞
式１で表される化合物によるヒアルロン酸の合成促進作用を、滑膜細胞培養系で検証した。

（合成例）
以下の手法により、アミノエタノール−ジクロフェナク導入ヒアルロン酸ナトリウム（化合物１）合成した。
２−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩２．１５５ｇ（１０．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２０ｍＬに溶解し、氷冷下でトリエチルアミン１．４６３ｍＬ（１０．５ｍｍｏｌ）を加え、さらにジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカルボナート（Ｂｏｃ_２Ｏ）２．２９９ｇ（１０．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液５ｍＬを加えて撹拌した。室温で９０分間撹拌した後、酢酸エチルを加え、５重量％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で順次分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を減圧留去してＢｏｃ−アミノエチルブロマイドを得た。
上記で得られたＢｏｃ−アミノエチルブロマイド２．２８７ｇ（１０．２ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液５ｍＬを氷冷し、ジクロフェナクナトリウム（和光純薬工業株式会社）３．２５５ｇ（１０．２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液６ｍＬを加え、室温で一晩撹拌した。６０℃で１１時間撹拌し、室温で一晩撹拌した。酢酸エチルを加え、５重量％炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、酢酸エチルを減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１（ｖ／ｖ）、０．５体積％トリエチルアミン）で精製し、Ｂｏｃ−アミノエタノール−ジクロフェナクを得た。
上記で得られたＢｏｃ−アミノエタノール−ジクロフェナク２．１０８ｇ（４．８０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５ｍＬに溶解し、氷冷下で４Ｍ塩酸／酢酸エチル２０ｍＬを加えて２．５時間撹拌した。ジエチルエーテル、ヘキサンを加えて沈殿させ、沈殿を減圧乾燥した。これにより、アミノエタノール−ジクロフェナク塩酸塩を得た。構造は^１Ｈ−ＮＭＲにて同定した：
^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝３．１８（２Ｈ，ｔ，ＮＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−），３．９４（２Ｈ，ｓ，Ｐｈ−ＣＨ_２−ＣＯ），４．３７（２Ｈ，ｔ，ＮＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−），６．４７−７．３１（８Ｈ，ｍ，ＡｒｏｍａｔｉｃＨ，ＮＨ）。
ヒアルロン酸（重量平均分子量：８０万）５００ｍｇ（１．２５ｍｍｏｌ／二糖単位）を水５６．３ｍＬ／ジオキサン５６．３ｍＬに溶解させた後、ヒドロキシコハク酸イミド（１ｍｍｏｌ）／水０．５ｍＬ、水溶性カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣＩ・ＨＣｌ）（０．５ｍｍｏｌ）／水０．５ｍＬ、上記で得られたアミノエタノール−ジクロフェナク塩酸塩（０．５ｍｍｏｌ）／（水：ジオキサン＝１：１（ｖ／ｖ）、５ｍＬ）を順次加え、一昼夜撹拌した。反応液に５重量％炭酸水素ナトリウム水溶液７．５ｍＬを加え、約４時間撹拌した。反応液に５０％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液２１５μＬを加えて中和後、塩化ナトリウム２．５ｇを加えて撹拌した。エタノール４００ｍｌを加えて沈殿させ、沈殿物を８５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で２回、エタノールで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥し、アミノエタノール−ジクロフェナク導入ヒアルロン酸ナトリウム（化合物１）を得た。分光光度計により測定されたジクロフェナクの導入率は１８モル％であった。

（試験物質）
化合物１またはヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）（ＡＲＴＺＤｉｓｐｏ（登録商標）（生化学工業株式会社製））を、リン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ）とα−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）の濃縮培地とを含む溶液に混和した。さらに、終濃度が１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ））、１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｆ２（以下、ＩＬ−１β（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ））、１％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）及び３７０ｋＢｑ／ｍＬ［^３Ｈ］グルコサミン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）となるように、前記の溶液に各試薬を添加・混和した。これにより、試験物質として、以下の５つの溶液を得た。
（１）Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液（化合物１またはＨＡを含まない）
（２）０．１％（ｗ／ｖ％）化合物１溶液
（３）０．１％（ｗ／ｖ％）ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）溶液
（４）０．０１％（ｗ／ｖ％）化合物１溶液
（５）０．０１％（ｗ／ｖ％）ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）溶液。

（試験方法）
（１）細胞培養、試験物質添加及び培養上清回収
ヒトリウマチ患者由来滑膜細胞（ＨＦＬＳ−ＲＡ、ＣＥＬＬＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＩＮＣ．）を１７５ｃｍ^２フラスコで継代培養して増殖させた。細胞培養には、Ｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍ（１０％（ｖ／ｖ）Ｇｒｏｗｔｈｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）（ＣｅｌｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．製）を用いた。その後、６ウェルプレートに３．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種し、コンフルエントになるまで約２４時間培養した。細胞の培養には、α−ＭＥＭ培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）を用いた。培養上清除去後、細胞に試験物質を２ｍＬ添加し、さらに４８時間培養した。培養はＣＯ_２インキュベーター（５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２）内で、３７℃で行った。培養終了後に培養上清を回収し、測定まで超低温フリーザーで凍結保存した。
（２）培養上清の分画及び放射能測定
グルコサミンはヒアルロン酸の構成単糖であることから、試験物質添加後に細胞内で新たに合成されるヒアルロン酸には、［^３Ｈ］グルコサミンが取り込まれる。そこで、回収した培養上清中のヒアルロン酸をＨＰＬＣを用いて分子量によって分離し、フラクションコレクターを用いて０．５分毎にフラクションを回収した。回収した各フラクションにシンチレーション液を０．５ｍＬ添加して混和した。その後、各フラクションの放射能（ｄｐｍ、ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｓｐｅｒｍｉｎｕｔｅ）をシンチレーションカウンターを用いて測定し、放射能（新たに産生されたヒアルロン酸への［^３Ｈ］グルコサミンの取り込み量）を評価した。ＨＰＬＣ条件は下記のとおり：
移動相：５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、０．８２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ：アセトニトリル＝２：１（ｖ：ｖ）の溶液
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム：ＯＨｐａｋＳＢ−８０５ＨＱｃｏｌｕｍｎ（Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標））、カラム温度：３５℃
注入量：１０μＬ
シンチレーションカウンター条件
^３Ｈ、ｄｐｍ、３ｍｉｎ
シンチレーション液：Ｕｌｔｉｍａ−ＦｌｏＴＭＭフローシンチレーションアナライザー用カクテル。
ヒアルロン酸標準溶液をＨＰＬＣで分離し、波長２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定した。各分子量のヒアルロン酸標準溶液のピークトップが回収されるフラクションＮｏ．を算出した。ヒアルロン酸標準溶液として、Ｓｅｌｅｃｔ−ＨＡＴＭ５００ｋ（平均分子量５２８，０００）、Ｓｅｌｅｃｔ−ＨＡＴＭ１，０００ｋ（平均分子量１，０７６，０００）、Ｓｅｌｅｃｔ−ＨＡＴＭ２，５００ｋ（平均分子量２，４２０，０００）を用いた。

（結果）
結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。
図１Ａ
１）Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝２）
２）０．１％（ｗ／ｖ％）ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）群（ｎ＝１）
３）０．１％（ｗ／ｖ％）化合物１群（ｎ＝１）。
図１Ｂ
１）Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝１）
２）０．０１％（ｗ／ｖ％）ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）群（ｎ＝１）
３）０．０１％（ｗ／ｖ％）化合物１群（ｎ＝１）。
図１Ａ及び図１Ｂにおいて、結果は、平均値（各群例数＝１〜２）によって示した。
Ｃｏｎｔｒｏｌ群では５００，０００付近をピークとするヒアルロン酸が産生されたことが図１Ａ及び図１Ｂで示された。また、ＨＡ群では５００，０００〜２，４００，０００付近をピークとするヒアルロン酸が産生され、化合物１群ではＨＡ群で産生されたヒアルロン酸を超える高分子量のヒアルロン酸が濃度依存的に産生されたことも示された。化合物１群で産生されたヒアルロン酸は、いずれの濃度においてもＨＡ群のそれと比較してより高分子量であった。
以上より、化合物１は、ヒトリウマチ患者由来滑膜細胞に対して、高分子量ヒアルロン酸の合成を促進する作用を有することが明らかとなった。その作用はヒアルロン酸ナトリウムを上まわっており、０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度でも認められた。

＜実施例２＞
化合物１の作用により合成が促進された物質がヒアルロン酸であることを、ヒアルロン酸分解酵素（ヒアルロニダーゼ）による分解の有無を確認することによって検証した。

（試験物質）
実施例１の方法と同様に、試験物質として、以下の２つの溶液を用意した。
（１）０．０１％（ｗ／ｖ％）ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）溶液
（２）０．０１％（ｗ／ｖ％）化合物１溶液。

（試験方法）
（１）細胞培養、試験物質添加及び培養上清回収
実施例１の方法と同様に実施した。
（２）ヒアルロニダーゼ処理
０．０１％ＨＡ溶液を添加した後に回収した培養上清（９０μＬ）と、１０μＬの１００ＴＲＵ／ｍＬヒアルロニダーゼ（あるいは注射用水）とを混和し、３７℃で一晩反応させることでヒアルロニダーゼ処理した。０．０１％化合物１溶液を添加した後に回収した培養上清（９０μＬ）と、３０μＬの１００ＴＲＵ／ｍＬヒアルロニダーゼ（あるいは注射用水）とを混和し、６０℃で３時間反応させることでヒアルロニダーゼ処理した。ヒアルロニダーゼ（放線菌由来）は、生化学バイオビジネスから購入した。
（３）培養上清の分画及び放射能測定
実施例１の方法と同様に実施した。

（結果）
結果を図２に示す。
図２Ａ（各ｎ＝１）
１）０．０１％ＨＡ（ヒアルロニダーゼ（−））群
２）０．０１％ＨＡ（ヒアルロニダーゼ（＋））群。
図２Ｂ（各ｎ＝１）
１）０．０１％化合物１（ヒアルロニダーゼ（−））群
２）０．０１％化合物１（ヒアルロニダーゼ（＋））群。
０．０１％ＨＡ（ヒアルロニダーゼ（−））群及び０．０１％化合物１（ヒアルロニダーゼ（−））群ともに高分子量の放射性物質の産生が確認された。０．０１％化合物１（ヒアルロニダーゼ（−））群の放射性物質は、０．０１％ＨＡ（ヒアルロニダーゼ（−））群の放射性物質よりも分子量が大きかった。
一方、０．０１％ＨＡ（ヒアルロニダーゼ（＋））群及び０．０１％化合物１（ヒアルロニダーゼ（＋））群ともに、それらの高分子量放射性物質のピークの消失が確認された。
以上より、ＨＡまたは化合物１の添加によって分子量が増加した物質は、ヒアルロン酸であることが確認された。

＜実施例３＞
化合物１によるヒアルロン酸の合成促進作用の経時変化を検証した。

（試験物質）
実施例１の方法と同様に、試験物質として、以下の３つの溶液を用意した。
（１）Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液
（２）０．１％（ｗ／ｖ％）化合物１溶液
（３）０．１％（ｗ／ｖ％）ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）溶液。

（試験方法）
実施例１の方法と同様に実施した。なお、細胞に試験物質を添加した後の各時点（８，２４，３６，４８，７２時間）において培養上清を回収した。

（結果）
結果を図３に示す。
図３ＡＣｏｎｔｒｏｌ（８，２４，３６，４８，７２時間）群（各ｎ＝１）
図３Ｂ０．１％ＨＡ（８，２４，３６，４８，７２時間）群（各ｎ＝１）
図３Ｃ０．１％化合物１（８，２４，３６，４８，７２時間）群（各ｎ＝１）。
Ｃｏｎｔｒｏｌ群、ＨＡ群及び化合物１群において、いずれもヒアルロン酸を産生し、経時的にヒアルロン酸含有量が増大することが確認された。Ｃｏｎｔｒｏｌ群では５００，０００付近をピークとするヒアルロン酸が産生された。ＨＡ群では１，０００，０００付近をピークとするヒアルロン酸が産生された。化合物１群ではＨＡ群よりも高分子量のヒアルロン酸が産生された。
以上より、化合物１及びヒアルロン酸ナトリウムはいずれも高分子量ヒアルロン酸の産生を誘導し、経時的に高分子量ヒアルロン酸を培地中に増加させた。また、化合物１群のヒアルロン酸の分子量はＨＡ群のそれと比較してより大きかった。分子量に関して、いずれの群でも経時的なピークの変動は認められなかった。化合物１は、測定期間内において常に内因性の高分子量ヒアルロン酸産生作用を有していた。

＜実施例４＞
化合物１によるヒアルロン酸の合成促進作用を、化合物１の構成成分であるヒアルロン酸ナトリウムおよびジクロフェナクナトリウム（ＤＦ−Ｎａ）と比較した。

（試験物質）
実施例１の方法と同様に、Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液、０．０１％（ｗ／ｖ％）化合物１溶液、および０．０１％（ｗ／ｖ％）ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）溶液を用意した。ＤＦ−Ｎａ（０．０１４μｇ／ｍＬ、０．１４μｇ／ｍＬ、１．４μｇ／ｍＬ及び１４μｇ／ｍＬ）溶液は、Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液にＤＦ−Ｎａを溶解させることで調製した。また、０．０１％（ｗ／ｖ％）ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）溶液にＤＦ−Ｎａ（１．４μｇ／ｍＬ）を溶解させて、ＨＡ＋ＤＦ−Ｎａ混合液を得た。
（１）Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液
（２）０．０１％（ｗ／ｖ％）化合物１溶液
（３）０．０１％（ｗ／ｖ％）ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）溶液
（４）ＤＦ−Ｎａ（０．０１４、０．１４、１．４及び１４μｇ／ｍＬ）溶液
（５）０．０１％（ｗ／ｖ％）ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）＋ＤＦ−Ｎａ（１．４μｇ／ｍＬ）混合液。

（試験方法）
実施例１の方法と同様に実施した。

（結果）
結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。
図４Ａ（各ｎ＝２）
１）Ｃｏｎｔｒｏｌ群
２）０．０１％化合物１群
３）０．０１％ＨＡ群
４）ＤＦ−Ｎａ（１．４μｇ／ｍＬ）群
５）０．０１％ＨＡ＋ＤＦ−Ｎａ（１．４μｇ／ｍＬ）群。
図４Ｂ
１）Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝１）
２）ＤＦ−Ｎａ（０．０１４、０．１４、１．４及び１４μｇ／ｍＬ）群（各ｎ＝１）。
なお、ＤＦ−Ｎａ（１４μｇ／ｍＬ）の濃度は、０．０１％化合物１に含有されるＤＦ−Ｎａ濃度に相当する。
Ｃｏｎｔｒｏｌ群では５００，０００付近をピークとするヒアルロン酸の産生が、ＨＡ群では１，０００，０００付近をピークとするヒアルロン酸の産生が確認された（図４Ａ）。化合物１群は、高分子量ヒアルロン酸の産生が、ＨＡ群より一層顕著であった。
ＨＡ＋ＤＦ−Ｎａ混合液群では、ＨＡ群と同様に、１，０００，０００付近をピークとするヒアルロン酸の産生が確認された（図４Ａ）。
ＤＦ−Ｎａ群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と同様に、５００，０００付近をピークとするヒアルロン酸の産生が確認された（図４Ａ）。
ＤＦ−Ｎａ群及びＨＡ＋ＤＦ−Ｎａ混合液群では、化合物１群で認められる高分子量ヒアルロン酸産生作用は認められなかった（図４Ａ）。また、ＤＦ−Ｎａは０．０１４〜１４μｇ／ｍＬのいずれの濃度においてもヒアルロン酸の合成促進作用は認められなかった（図４Ｂ）。
以上より、化合物１投与で認められる高分子量ヒアルロン酸産生作用は、ヒアルロン酸ナトリウム、ＤＦ−Ｎａ、またはＨＡ＋ＤＦ−Ｎａ混合液投与では認められなかった。すなわち、化合物１による内因性ヒアルロン酸の分子量増加作用は、化合物１の構成成分の単純な混合では認められないことから、式１で表される多糖誘導体特有の作用であることが明らかとなった。

＜実施例５＞
ヒト滑膜細胞を用いて、化合物１によるヒアルロン酸の合成促進作用を検証した。この時、複数のヒト由来の滑膜細胞を用いることで、患者の違いによる影響を検討した。

（試験物質）
実施例１の方法と同様に、試験物質として、以下の５つの溶液を用意した。
（１）Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液
（２）０．０１％（ｗ／ｖ％）化合物１溶液
（３）０．０１％（ｗ／ｖ％）ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）溶液
（４）０．１％（ｗ／ｖ％）化合物１溶液
（５）０．１％（ｗ／ｖ％）ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）溶液。

（試験方法）
（１）細胞培養、試験物質添加及び培養上清回収
実施例１の方法と同様に実施した。なお、３名のヒト変形性関節症患者由来滑膜細胞（ＨＦＬＳ−ＯＡ、ＣＥＬＬＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＩＮＣ．）及び３名のヒトリウマチ患者由来滑膜細胞（ＨＦＬＳ−ＲＡ、ＣＥＬＬＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＩＮＣ．）を用いた。３人の各疾患患者由来の細胞（３ロット）を別々に評価し、例数３とした。
（２）培養上清の分画及び放射能測定
実施例１の方法と同様に実施した。なお、ＨＰＬＣカラム（ＯＨｐａｋＳＢ−８０５ＨＱｃｏｌｕｍｎ，Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標））より高分子量側の分離能に長けたカラム（ＯＨｐａｋＳＢ−８０７ＨＱｃｏｌｕｍｎ，Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標））を用いた。
（３）細胞数計測
培養上清回収後、各ウェルから接着した細胞を剥がした。その後、トリパンブルー溶液及び血球計算盤を用いて細胞数を計測した。

（結果）
結果を図５Ａ〜図５Ｄに示す。
図５Ａ（各ｎ＝３、３人のリウマチ患者に由来する滑膜細胞）
１）Ｃｏｎｔｒｏｌ群
２）０．０１％ＨＡ群
３）０．０１％化合物１群。
図５Ｂ（各ｎ＝３、３人の変形性関節症患者に由来する滑膜細胞）
１）Ｃｏｎｔｒｏｌ群
２）０．０１％ＨＡ群
３）０．０１％化合物１群。
図５Ｃ（各ｎ＝３、３人の変形性関節症患者に由来する滑膜細胞）
１）Ｃｏｎｔｒｏｌ群
２）０．１％ＨＡ群
３）０．１％化合物１群。
図５Ｄ（各ｎ＝３、３人の変形性関節症患者に由来する滑膜細胞）
１）Ｃｏｎｔｒｏｌ群
２）０．１％ＨＡ群
３）０．１％化合物１群。
図５Ａ〜図５Ｄの各々において、結果は、平均値±標準誤差（各ｎ＝３）によって示した。図５Ａ（リウマチ患者由来滑膜細胞）と図５Ｂ（変形性関節症患者由来滑膜細胞）において、０．０１％化合物１群では２，４００，０００付近をピークとする高分子量のヒアルロン酸の産生が確認され、０．０１％ＨＡ群では１，０００，０００付近をピークとするヒアルロン酸の産生が確認された。図５Ｃ（変形性関節症患者由来滑膜細胞）において、０．１％化合物１群では２，４００，０００を超える高分子量ヒアルロン酸の産生が確認された。高分子量側の分離能に長けたカラムを用いることで、化合物１投与によって産生される高分子量ヒアルロン酸の分子量がより明確となった。また、化合物１の濃度依存的に、より高分子量のヒアルロン酸が産生されることが認められた。図５Ｄ（変形性関節症患者由来滑膜細胞）において、各群の細胞数に有意差は認められず（パラメトリックＴｕｋｅｙ型多重比較検定でｐ＞０．０５）、０．１％化合物１及び０．１％ＨＡ添加による細胞数の有意な増減はなかった。
以上のとおり、化合物１投与による高分子量ヒアルロン酸産生作用は、リウマチ患者及び変形性関節症患者のいずれに由来する滑膜細胞においても認められた。化合物１によるヒアルロン酸分子量の増加は、試料間差が小さいことが明らかとなった。また、化合物１は、ヒアルロン酸ナトリウムよりも高分子量のヒアルロン酸の産生を誘導する作用を有していた。また、化合物１による高分子量ヒアルロン酸産生作用は、細胞数の増加によるものでなく、細胞において合成されるヒアルロン酸を高分子量化していることが明らかとなった。

＜実施例６＞
化合物１によるヒアルロン酸合成促進作用の作用機序を検証した。

（試験物質）
化合物１またはヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）（ＡＲＴＺＤｉｓｐｏ（登録商標）（生化学工業株式会社製））を、リン酸緩衝液とα−ＭＥＭの濃縮培地とを含む溶液に混和した。さらに、終濃度が１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳ）、１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｆ２（以下、ＩＬ−１β）及び１％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンとなるように、前記の溶液に各試薬を添加・混和した。これにより、試験物質として、以下の３つの溶液を用意した。
（１）Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液
（２）０．１％（ｗ／ｖ％）化合物１溶液
（３）０．１％（ｗ／ｖ％）ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）溶液。

（試験方法）
（１）細胞培養、試験物質添加
ヒト変形性関節症患者由来滑膜細胞（ＨＦＬＳ−ＯＡ、ＣＥＬＬＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＩＮＣ．）を１７５ｃｍ^２フラスコで継代培養して増殖させた。細胞培養には、Ｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍ（１０％（ｖ／ｖ）Ｇｒｏｗｔｈｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）（ＣｅｌｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．製）を用いた。その後、６ウェルプレートに３．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種し、コンフルエントになるまで約２４時間培養した。細胞の培養には、α−ＭＥＭ培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）を用いた。培養上清除去後、ウェルに試験物質を２ｍＬ添加し、さらに４８時間培養した。培養はＣＯ_２インキュベーター（５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２）内で、３７oＣで行った。
（２）培養細胞中のＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ試料調製
培養終了後、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ＰｌｕｓＭｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ウェル毎に細胞からＲＮＡを抽出した。超微量分光光度計を用いてＲＮＡ濃度を測定した後、試料を超低温フリーザーで凍結保存した。抽出ＲＮＡを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩＦｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｃＤＮＡ試料を調製した。
（３）相対的ｍＲＮＡ量の算出（リアルタイムＰＣＲ）
ｃＤＮＡ試料を、ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（タカラバイオ株式会社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ターゲット遺伝子（ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２及びＨＹＡＬ３）及びＧＡＰＤＨのＣｔ値を測定し、ΔΔＣｔ法により相対的ｍＲＮＡ量を算出した。
ｐｒｏｂｅ＆ｐｒｉｍｅｒにはＴａｑｍａｎ（登録商標）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＨＡＳ１（ＩＤ：Ｈｓ００９８７４１８＿ｍ１）、ＨＡＳ２（ＩＤ：Ｈｓ００１９３４３５＿ｍ１）、ＨＡＳ３（ＩＤ：Ｈｓ００１９３４３６＿ｍ１）、ＨＹＡＬ１（ＩＤ：Ｈｓ００２０１０４６＿ｍ１）、ＨＹＡＬ２（ＩＤ：Ｈｓ０１１１７３４３＿ｇ１）、ＨＹＡＬ３（ＩＤ：Ｈｓ００１８５９１０＿ｍ１）、ＧＡＰＤＨ（ＩＤ：Ｈｓ０３９２９０９７＿ｇ１）。

（結果）
結果を図６に示す（各群ｎ＝３、３名の変形性関節症患者に由来する滑膜細胞）。
図６ＡＨＡＳ１、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３の相対的ｍＲＮＡ量
１）Ｃｏｎｔｒｏｌ群
２）０．１％ＨＡ群
３）０．１％化合物１群。
図６ＢＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２及びＨＹＡＬ３の相対的ｍＲＮＡ量
１）Ｃｏｎｔｒｏｌ群
２）０．１％ＨＡ群
３）０．１％化合物１群。
図６において、結果は、平均値±標準誤差（各群例数＝３）によって示した。＊及び＊＊は、それぞれＤｕｎｎｅｔｔ検定においてｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１（ｖｓＣｏｎｔｒｏｌ）を示す。
化合物１はＨＹＡＬ２ｍＲＮＡ発現を有意に抑制し、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現を有意に促進することが認められた。一方、ヒアルロン酸ナトリウムのＨＹＡＬ１，２，３及びＨＡＳ１，２，３のｍＲＮＡ発現に対する影響は認められなかった。
以上のとおり、高分子量ヒアルロン酸産生に関与するＨＡＳ２のｍＲＮＡ発現を化合物１が促進した。このことから、化合物１によるヒアルロン酸合成促進の作用機序は、ＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現促進が関与している可能性が高い。また、高分子量ヒアルロン酸分解に関与するＨＹＡＬ２のｍＲＮＡ発現を化合物１が抑制したことから、高分子量ヒアルロン酸分解の抑制も当該作用機序に関係している可能性が示唆された。

＜実施例７＞
抗原誘発関節炎モデルウサギにおける、化合物１によるヒアルロン酸合成促進作用を検証した。

（試験物質）
１％（ｗ／ｖ）化合物１溶液（リン酸緩衝液）、１０％（ｗ／ｖ）卵白アルブミン溶液（リン酸緩衝液）及び［^３Ｈ］グルコサミン（リン酸緩衝液、３７ＭＢｑ／ｍＬ）の各溶液を５：１：４（ｖ：ｖ：ｖ）の割合で混合し、０．５％（ｗ／ｖ％）化合物１溶液を得た。Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液の調製には、上記の化合物１溶液に代えて、リン酸緩衝液を用いた。ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）溶液の調製には、上記の化合物１溶液に代えて、ＡＲＴＺＤｉｓｐｏ（登録商標）（生化学工業株式会社製）を用いた。また、リン酸緩衝液及び［^３Ｈ］グルコサミン（リン酸緩衝液、３７ＭＢｑ／ｍＬ）の各溶液を３：２（ｖ：ｖ）の割合で混合し、卵白アルブミン（関節炎惹起物質）を含有しないＮｏｒｍａｌ溶液を得た。試験物質として、以下を使用した。
（１）Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液
（２）０．５％（ｗ／ｖ％）ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）溶液
（３）０．５％（ｗ／ｖ％）化合物１溶液
（４）Ｎｏｒｍａｌ溶液。

（試験方法）
（１）感作、関節炎惹起、試験物質投与及び関節液回収
卵白アルブミン（ＳＩＧＭＡ）を生理食塩液（株式会社大塚製薬工場）で１％（ｗ／ｖ）に溶解・調製し、フロイント完全アジュバント（ＣＡＰＰＥＬ）と１：１（ｖ：ｖ）の油中水型エマルジョンを作製した。エマルジョンを全身麻酔下（ミダゾラム、キシラジン及びブトルファノール、各々、０．６７ｍｇ／ｋｇ、５．３ｍｇ／ｋｇ及び０．６７ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の日本白色種ウサギ（雄性、１６週齢、オリエンタル酵母工業株式会社）の背部皮内数十カ所に計１ｍＬ投与し、感作した。感作後１２日目に同様にエマルジョンを投与し、追加感作した。２回目感作から約２〜３ヵ月後の試験物質投与（関節炎惹起）直前に、全身麻酔下のウサギ後肢膝関節腔内を１ｍＬ生理食塩液で３回洗浄し、関節液を回収した。その後、ウサギ後肢膝関節腔内に０．５ｍＬ／関節の用量で試験物質（関節炎惹起物質含有）を投与した。正常群にはＮｏｒｍａｌ溶液（関節炎惹起物質なし）を投与し、関節炎を惹起させなかった。投与後４８時間に、全身麻酔下のウサギ後肢膝関節腔内を１ｍＬ生理食塩液で３回洗浄し、関節液を回収した。回収した関節液を遠心分離し、上清を回収・冷凍保存した。
（２）プロナーゼ処理
回収した関節液を１００℃で１０分加熱した。その後、３０μＬの２００μｇ／ｍＬプロナーゼ（メルク株式会社）と２７０μＬの関節液とを混和し、３７℃で一晩消化することでプロナーゼ処理した。プロナーゼ処理後の関節液を１００℃で１０分加熱した後、遠心分離した上清を回収・冷凍保存した。
（３）上清の分画及び放射能測定
グルコサミンはヒアルロン酸の構成単糖であることから、試験物質投与後に生体内で新たに合成されるヒアルロン酸には［^３Ｈ］グルコサミンが取り込まれる。そこで、回収した上清中のヒアルロン酸をＨＰＬＣを用いて分子量によって分離し、フラクションコレクターを用いて０．５分毎にフラクションを回収した。回収した各フラクションにシンチレーション液を０．５ｍＬ添加して混和した。その後、各フラクションの放射能（ｄｐｍ、ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｓｐｅｒｍｉｎｕｔｅ）をシンチレーションカウンターを用いて測定し、放射能（新たに合成されたヒアルロン酸への［^３Ｈ］グルコサミンの取り込み量）を評価した。ＨＰＬＣ条件は下記のとおり：
移動相：５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、０．８２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ：アセトニトリル＝２：１（ｖ：ｖ）の溶液
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム：ＯＨｐａｋＳＢ−８０７ＨＱｃｏｌｕｍｎ（Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標））、カラム温度：３５℃
注入量：１００μＬ
シンチレーションカウンター条件
^３Ｈ、ｄｐｍ、３ｍｉｎ
シンチレーション液：Ｕｌｔｉｍａ−ＦｌｏＴＭＭフローシンチレーションアナライザー用カクテル。
ヒアルロン酸標準溶液をＨＰＬＣで分離し、波長２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定した。各分子量のヒアルロン酸標準溶液のピークトップが回収されるフラクションＮｏ．を算出した。標準ヒアルロン酸試料として、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌＨｙａｌｕｒｏｎｉｃＡｃｉｄＰｏｌｙｍｅｒ（平均分子量８０４，０００、ＩｄｕｒｏｎＬｔｄ）及びＳｅｌｅｃｔ−ＨＡＴＭ２，５００ｋ（平均分子量２，３８４，０００）を用いた。また、正常ウサギ膝関節から回収した関節液でも同様にフラクションＮｏ．を算出した。

（結果）
結果を図７に示す。
（１）Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｎ＝３）
（２）ＨＡ（ｎ＝３）
（３）化合物１（ｎ＝３）
（４）正常（関節炎惹起なし）（ｎ＝１）。
図７において、結果は、平均値（ｎ＝３、正常群のみｎ＝１）によって示した。正常ウサギ膝関節で合成されたヒアルロン酸は、２，３００，０００よりも高分子量域にピークが認められた（正常関節液）。化合物１投与後にウサギ膝関節で合成されたヒアルロン酸は２，３００，０００付近にピークが認められた。化合物１投与群で産生される高分子量ヒアルロン酸量は、ヒアルロン酸ナトリウム投与群と比較して顕著であった。また、ヒアルロン酸の生産量は、正常群と比較しても、化合物１投与群においてより顕著であった。

本発明は具体的実施例と様々な実施形態とに関連して記載されているが、本明細書に記載される実施形態の多くの改変や応用が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく可能であることは、当業者によって容易に理解される。
本出願は、２０１８年３月２７日付で日本国特許庁に出願された特願２０１８−５９７７２号に基づく優先権を主張し、その内容は参照によって全体として本出願に組み込まれる。

Claims

下記式１で表されるヒアルロン酸誘導体またはその塩に対する、ヒアルロン酸産生細胞の応答性を評価する方法であって、
（１）前記ヒアルロン酸誘導体またはその塩を含む培地中で、前記ヒアルロン酸産生細胞を培養する工程、および
（２）前記培地中のヒアルロン酸の分子量および／または含有量を測定する工程、を含む、
方法：

式１中、Ｘはヒアルロン酸由来の残基であり；Ａは置換基であり；ｎは置換基Ａの導入率であって、１モル％以上８０モル％以下であり；Ｘ−Ａ間は、前記ヒアルロン酸のカルボキシ基または水酸基と前記置換基Ａとの結合であって、当該結合はエステル、チオエステル、およびアミドからなる群から選択され；前記置換基Ａは下記式２で表され：

式２中、Ｙはスペーサー残基またはエステル結合であり；Ｚはジクロフェナク残基であり；Ｙがスペーサー残基の場合、Ｙ−Ｚ間の結合はエステル、チオエステル、およびアミドからなる群から選択され；＊はＸとの結合部位である。
（３）前記ヒアルロン酸の分子量および／または含有量の増加を指標として、前記ヒアルロン酸誘導体またはその塩に対する前記ヒアルロン酸産生細胞の応答性の存在を認める工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
ヒアルロン酸の生産方法であって、
（１’）下記式１で表されるヒアルロン酸誘導体またはその塩を含む培地中で、ヒアルロン酸産生細胞を培養する工程、および
（２’）前記培地からヒアルロン酸を回収する工程、を含む、
方法：

式１中、Ｘはヒアルロン酸由来の残基であり；Ａは置換基であり；ｎは置換基Ａの導入率であって、１モル％以上８０モル％以下であり；Ｘ−Ａ間は、前記ヒアルロン酸のカルボキシ基または水酸基と前記置換基Ａとの結合であって、当該結合はエステル、チオエステル、およびアミドからなる群から選択され；前記置換基Ａは下記式２で表され：

式２中、Ｙはスペーサー残基またはエステル結合であり；Ｚはジクロフェナク残基であり；Ｙがスペーサー残基の場合、Ｙ−Ｚ間の結合はエステル、チオエステル、およびアミドからなる群から選択され；＊はＸとの結合部位である。