TW201941776A - 玻尿酸合成促進劑、玻尿酸合成促進方法及細胞評價方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係提供藉由玻尿酸產生細胞所致之玻尿酸合成的促進技術,評價玻尿酸產生細胞對化合物的回應性的方法,或評價本說明書的式1表示的多糖衍生物或其鹽對玻尿酸產生細胞的回應性的方法。
藉由本說明書中式1表示的多糖衍生物或其鹽與玻尿酸產生細胞接觸,達到於該玻尿酸產生細胞中玻尿酸的合成促進。另外,藉由玻尿酸產生細胞之上述多糖衍生物或其鹽的使用,以玻尿酸產生作為指標,可評價玻尿酸產生細胞的回應性。另外,藉由玻尿酸產生細胞的使用,以玻尿酸產生作為指標,可評價多糖衍生物或其鹽的回應性。
Description
本發明係關於藉由玻尿酸產生細胞所致之玻尿酸合成的促進技術。
玻尿酸是以N-乙醯基-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸經β1,3鍵結而成之構造作為雙糖單元(構成雙糖單元),並由該雙糖單元重複且經β1,4鍵結而成之基本骨架而構成之葡糖胺聚糖的一種。玻尿酸廣泛地分布於生物體內的軟骨、關節腔滑液(關節液)、臍帶、血清、尿液、眼球玻璃體等全身組織,特別是富集地存在於關節液中。以細胞等級來看,幾乎所有生物體內的細胞都具有合成玻尿酸的機能,玻尿酸被認為對生物體而言是重要的物質。在關節中,無論是動態或靜態的情況下其都發揮維持關節液潤滑特性的作用。玻尿酸在關節中還擔任降低炎症誘發細胞介素產生而緩解軟骨變性,抑制COX-2的產生而減弱疼痛等各種生理的作用。
非專利文獻1報導,與健康者的關節液中的玻尿酸相比,變形性關節症患者(以下在本說明書中也稱為「OA」)或類風濕性關節症患者(以下在本說明書也稱為「RA」)的關節液中,有玻尿酸含量少的情況或玻尿酸酸分子量降低的情況。
[專利文獻1]國際公開第2005/066214號
[非專利文獻1]Dahl LB, Dahl IM, Engstrom-Laurent A, and Granath K. Concentration and molecular weight of sodium hyaluronate in synovial fluid from patients with rheumatoid arthritis and other arthropathies. Ann. Rheum. Dis. 1985;44(12):817-22.
本發明的目的係提供一種藉由玻尿酸產生細胞所致之玻尿酸合成的促進技術。
本發明的另一個目的是提供一種評價玻尿酸產生細胞對化合物的回應性的方法。
本發明的另一個目的是提供評價後述的式1表示的多糖衍生物或其鹽對玻尿酸產生細胞的回應性的方法。
本發明之發明者發現,透過將後述的式1表示的多糖衍生物或其鹽與玻尿酸產生細胞接觸,可促進玻尿酸產生細胞中玻尿酸的合成,以致完成發明。
本發明的一個方面係關於玻尿酸合成促進用之預定結構的多糖衍生物或其鹽的用途。
本發明的另一方面係關於使用由後述的式1表示的多糖衍生物或其鹽,評價玻尿酸產生細胞的回應性的方法。
第1A圖是評價式1的多糖衍生物(0.1%化合物1)對由滑膜細胞生產的玻尿酸的分子量的影響的結果。
第1B圖是評價式1的多糖衍生物(0.01%化合物1)對由滑膜細胞生產的玻尿酸的分子量的影響的結果。
第2圖是顯示在含有式1的多糖衍生物的培養基中培養滑膜細胞的過程中,細胞內生產受到促進的高分子量物質是玻尿酸的結果。在該圖中,圖A和B分別顯示無玻尿酸酶處理(●)和有處理(○)的情況的結果。
第3圖顯示含有式1的多糖衍生物的培養基中滑膜細胞的培養時間,與細胞所生產的玻尿酸的分子量的關係。在該圖中,圖A至C依序顯示無處理、玻尿酸(HA)處理、以及化合物1處理的情況的結果。
第4A圖為評價各種化合物對由滑膜細胞生產的玻尿酸的分子量的影響之結果。
第4B圖為評價培養基中雙氯芬酸鈉(DF-Na)濃度對由滑膜細胞生產的玻尿酸的分子量的影響之結果。
第5A圖為評價式1表示的多糖衍生物對由源自類風濕患者的滑膜細胞生產的玻尿酸的分子量的影響之結果。
第5B圖為評價式1表示的多糖衍生物對由源自變形性關節症患者的滑膜細胞生產的玻尿酸的分子量的影響之結果。
第5C圖為評價式1表示的多糖衍生物對由源自變形性關節症患者的滑膜細胞生產的玻尿酸的分子量的影響之結果。
第5D圖為評價式1表示的多糖衍生物對源自變形性關節症患者的滑膜細胞的細胞培養後的細胞數的影響之結果。
第6圖顯示評價式1表示的多糖衍生物對玻尿酸合成或玻尿酸分解相關的基因表現量的影響之結果。圖A顯示玻尿酸合成相關的基因HAS1至HAS3的表現程度,圖B表示玻尿酸分解相關的基因HYAL1至HYAL3的表現程度。
第7圖顯示評價式1表示的多糖衍生物對兔關節內的玻尿酸合成的影響之結果。
根據本發明,提供藉由玻尿酸產生細胞促進玻尿酸合成的技術。
根據本發明,還提供評價玻尿酸產生細胞對化合物的回應性的方法。
在下文中,將說明本發明的實施方式,但本發明不僅限於以下之實施方式。
本說明書中,「玻尿酸或其鹽」也簡稱為「HA」。
本說明書中,「有效量」和「作為活性成分」是指符合合理的風險/效益比,且不引起過度的有害事項,而為了充分地得到期望的回應所需的成分量之意。只要身為本領域技術人員,不需要對於諸多要素的組合的各者個別地測試,並且基於一或複數個具體的試驗例的結果與技術常識,亦可決定於其他情形中的有效量。
式1中,X是源自具有羧基和羥基之至少一者的多糖的殘基;A是取代基;n是取代基A的導入率,為1莫耳%以上80莫耳%以下;X-A之間是前述羧基或羥基與前述取代基A的鍵結,該鍵結選自由酯、硫酯或醯胺構成之群組;前述取代基A以下述式2表示:*-Y-Z 式2在式2中,Y是間隔子殘基或酯鍵;Z是雙氯芬酸殘基;當Y是間隔子殘基時,Y和Z之間的鍵結選自由酯、硫酯或醯胺構成群組等;*是與X的鍵結部位。
本發明之式1的多糖衍生物中作為多糖殘基源自的多糖,係使用具有羧基和羥基之至少一者的多糖。在本發明之多糖衍生物,多糖的羧基和/或羥基之至少一部分與取代基A形成共價鍵。
本說明書中的多糖衍生物,可為鹽的形態。作為鹽,可列舉鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋇鹽等金屬鹽;銨鹽;甲胺鹽、二乙胺鹽、乙二胺鹽、環己胺鹽、乙醇胺鹽等胺鹽;鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽等無機酸鹽;乙酸鹽、苯二甲酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、草酸鹽、琥珀酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、酒石酸鹽、酒石酸氫鹽、蘋果酸鹽等有機酸鹽類,不特別限定。多糖衍生物的鹽較佳為鹼金屬鹽類(例如,鈉鹽、鉀鹽),更佳為鈉鹽。
作為多糖,例如,可列示玻尿酸、軟骨素、硫酸軟骨素、肝素、硫酸乙醯肝素及羧基C1-4烷基葡聚糖(例如,羧甲基葡聚糖)等,但不限定於其等。上述的多糖較佳為玻尿酸。
多糖可使用源自動物、或源自微生物的精製物、化學合成等的合成物,亦可為藉由任何手法而獲得者。
多糖衍生物以及其多糖殘基源自的多糖之平均分子量沒有特別限定,例示10,000以上5,000,000以下,較佳為500,000以上3,000,000以下,更佳為600,000以上3,000,000以下,再佳為600,000以上且1,200,000以下。又,本說明書中,多糖衍生物以及其多糖殘基源自的多糖之「平均分子量」是指藉由極限黏度法測量定的重量平均分子量。
式1中,n為取代基A的導入率,亦即相對於構成糖單位的數之取代基A的數的比例,為1莫耳%以上80莫耳%以下。取代基A的導入率較佳為5
莫耳%以上且50莫耳%以下,更佳為10莫耳%以上30莫耳%以下,再更佳為15莫耳%以上且30莫耳%以下。
在此,本說明書中的「導入率」是透過下述計算式1計算出的值,可以藉由例如吸光度測量求出。導入率係將藉由咔唑吸光度法算出的每糖單元的莫耳數,以及由使用雙氯芬酸特有的吸收度預先作成的校準曲線所算出的取代基A的雙氯芬酸莫耳數,適用下述計算式1而得。對多醣的取代基A的導入反應步驟中,導入率可藉由改變縮合劑、縮合助劑、間隔子分子的反應當量、取代基A的反應當量等而調整。又,關於計算式1中的「構成糖單元」,例如在如玻尿酸的以雙糖單元作為構成糖單元構成的多糖之情形中,是指該構成雙糖單元。
在式1中,X-A之間是多糖中的羧基或羥基之至少一者與上述取代基A之間的鍵結,選自由酯或硫酯或醯胺構成之群組。X-A之間的鍵結較佳是酯或醯胺。在X-A之間不含間隔子殘基而X和Z直接鍵結的情況,X-A之間的鍵結是酯。當X-A之間經由間隔子殘基鍵結時,多糖的羧基與間隔子殘基較佳以醯胺鍵結連接。
在式2中,Y是間隔子殘基或酯鍵結,Z是雙氯芬酸殘基。較佳一實施態樣中,多糖衍生物具有經由間隔子殘基,將多糖的羧基的一部分和雙氯芬酸殘基Z連接的結構。
Y是酯鍵結(X和Z直接鍵結)的情況,X及Z係多糖的羥基和Z所具有的羧基藉由酯鍵結連接。
Y是間隔子殘基的情況,Y-Z之間的鍵結選自由酯或硫酯或醯胺構成之群組。Y是間隔子殘基的情況,Y-Z之間的鍵結較佳為酯。
較佳一實施態樣中,X-A之間是多糖的羧基與取代基A的醯胺鍵結;Y是間隔子殘基;Y-Z之間的鍵結是酯。
作為間隔子殘基沒有特別限制,可例示由C1-6伸烷基、胺基酸殘基和多肽鏈構成之群組選擇的二價連接基等。作為C1-6伸烷基,更具體地,可例示亞甲基、伸乙基、三亞甲基和伸異丙基等。作為胺基酸殘基,更具體地,例如可例示:甘胺酸殘基、β-丙胺酸殘基、γ-胺基丁酸殘基等。多肽鏈,例如,可為胺基酸殘基數2至12的多肽鏈。上述間隔子殘基中,較佳為使用C1-6伸烷基,更佳為伸乙基、三亞甲基或伸異丙基。
做為間隔子殘基利用的化合物(間隔子化合物),是將與多糖的羧基和/或羥基結合之第一官能基及與雙氯芬酸結合之第二官能基,至少含有其中一種官能基者,可因應多糖和雙氯芬酸的結合模式適宜選擇。
例如,與多糖的羧基間形成醯胺鍵結以導入間隔子殘基的情形,可以選擇具有胺基的間隔子化合物。與多糖的羧基間形成酯鍵結以導入間隔子殘基的情形,可以選擇具有羥基的間隔子化合物。與多糖的羧基間形成硫酯鍵結以導入間隔子殘基的情形,可以選擇具有巰基的間隔子化合物。與多糖的羥基間形成酯鍵結以導入間隔子殘基的情形,可以選擇具有羧基的間隔子化合物。作為間隔子化合物,由對多糖體的導入容易度與生物體內的穩定性之觀點來看,多糖殘基與間隔子殘基的結合樣式較佳為醯胺鍵結。
另外,例如,與雙氯芬酸的羧基間形成酯鍵結以導入間隔子殘基的情形,可以選擇具有羥基的間隔子化合物。與雙氯芬酸的羧基間形成醯胺鍵結以導入間隔子殘基的情形,可以選擇具有胺基的間隔子化合物。與雙氯芬酸的羧基間形成硫酯鍵結以導入間隔子殘基的情形,可以選擇具有巰基的間隔子化合物。從經由生物分解而釋放雙氯芬酸的觀點來看,間隔子殘基和雙氯芬酸殘基的鍵結樣式較佳為酯鍵結。
如上所述,間隔子化合物可以根據與多糖或雙氯芬酸的鍵結樣式適宜選擇,例如可列舉C1至6二胺基烷、碳數1至6的胺基烷基醇、胺基酸、及多肽等。作為胺基酸可以是天然、非天然的胺基酸,沒有特別限制,例如可列舉甘胺酸、β-丙胺酸、γ-胺基丁酸等。
用於合成多糖衍生物的雙氯芬酸,可例示游離雙氯芬酸,及雙氯芬酸鈉和雙氯芬酸鉀等鹽。
將間隔子殘基和雙氯芬酸殘基導入多糖的方法沒有特別限制。也就是說,可以將雙氯芬酸殘基導入已導入間隔子殘基的多糖,亦可以使預先已導入間隔子殘基的雙氯芬酸與多糖反應。
多糖、雙氯芬酸和間隔子化合物的各自鍵結的方法沒有特別限制,例如只要是能夠形成酯、硫酯、醯胺等的方法,可使用通常使用的方法作為進行該鍵結反應的手段,並且本領域技術人員能夠適宜判斷並選擇反應條件。
作為達成間隔子化合物或間隔子鍵結的雙氯芬酸,與多糖的羧基或羥基的鍵結的方法,例如可列舉使用水溶性碳二亞胺等(例如,1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI.HCl)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺甲碘
鹽等)水溶性縮合劑的方法、使用N-羥基琥珀醯亞胺(HOSu)或N-羥基苯并三唑(HOBt)等縮合輔助劑與上述縮合劑的方法、活性酯法、酸酐法等。
該製劑的特徵在於用於對象的玻尿酸合成促進。本說明書中「玻尿酸合成促進」,可包括對象的合成的玻尿酸分子量的增加和/或玻尿酸產生速度的提升。玻尿酸分子量的增加是指分子量為2,000,000以上的玻尿酸的生產量增加。
一實施形態中,製劑含有0.01重量%以上80重量%以下的多糖衍生物或其鹽。其他實施形態中,製劑含有0.1重量%以上10重量%以下的多糖衍生物或其鹽。
除了多糖衍生物或其鹽外,製劑可含有載體。作為該載體,可例示較佳為無菌精製水、磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)、生理鹽水等水性溶劑。一實施形態中,製劑係經由混合該載體和多糖衍生物調製。必要時,亦可在製劑添加如緩衝劑等添加物。此外,製劑在各成分混合後,亦可進行例如經由過濾器等過濾,除塵、消毒、滅菌等處理。一實施形態中,製劑為粉末的形態。其他實施形態中,製劑是溶液或是凝膠的形態。
較佳一實施態樣中,對於產生具有2,000,000以下分子量峰的玻尿酸之對象,使用製劑。又,該「分子量峰」是使用高效液相色譜(HPLC)藉由以下方法將樣品中的玻尿酸分離,並使用分液收集器每0.5分鐘收集分液時,由分液編號1至17中向上凸起的峰:
[分子量峰測定方法]
移動相:5mmol/L磷酸鹽緩衝液(pH 6.0),0.82%(w/v)NaCl:乙腈=2:1(v:v)的溶液
流速:0.5mL/min
管柱:OH pak SB-807 HQ管柱,Shodex(註冊商標),管柱溫:35℃。
注入量:10μL。
上述樣品,例如可以是培養滑膜細胞的培養基或關節液等。
本發明其中一方面係關於包含至少下述的(A)和(B)的套組:
(A)上述式1表示的多糖衍生物或其鹽
(B)表示其用於玻尿酸合成促進用的說明書或標籤。
一實施形態中,套組所包含的式1的多糖衍生物或其鹽係填充在如小瓶或試劑瓶等容器中。某實施形態中,經填充在容器內的製劑可以無菌狀態提供。
上述(B)可以是顯示上述式1表示的多糖衍生物或其鹽係用以促進玻尿酸合成之意旨的使用說明書或標籤。
本發明其中一方面係關於玻尿酸的合成促進方法,該方法包含使玻尿酸產生細胞與由式1表示的多糖衍生物或其鹽的有效量接觸。使多糖衍生物或其鹽對玻尿酸產生細胞接觸的方法沒有特別限制。一實施形態中,經由於含有式1表示的多糖衍生物或其鹽的培養基培養玻尿酸產生細胞可進行上述接觸。
本說明書中的「玻尿酸產生細胞」,只要是產生玻尿酸的動物細胞即可並沒有特別限制,例如,可例示滑膜細胞、軟骨細胞、纖維母細胞、角質細胞、平滑肌細胞、口腔黏膜細胞、血管內皮細胞和乳腺上皮細胞等。其中較佳為使用滑膜細胞。
本發明的另一個方面係關於式1表示的多糖衍生物或其鹽作為玻尿酸合成促進的方法的用途。
本發明的一個方面是關於評價玻尿酸產生細胞對式1表示的多糖衍生物或其鹽的回應性的方法,該方法包括(1)於含有式1表示的多糖衍生物或其鹽的培養基中,培養前述玻尿酸產生細胞,和(2)測定前述培養基中玻尿酸的分子量和/或含量。培養基中玻尿酸的分子量和/或含量的測定,例如可以根據實施例記載的方法進行,或者亦可以使用市售的玻尿酸定量套組或測定試劑等進行。
上述評價玻尿酸產生細胞的回應性的方法,亦可包含以步驟(2)中測定的玻尿酸分子量和/或含量的增加作為指標,確認之前述玻尿酸產生細胞對式1的多糖衍生物或其鹽的回應性的存在,來作為步驟(3)。一實施形態中,玻尿酸的分子量和/或含量的增加可為,相對於在不含式1的多糖衍生物或其鹽的培養基中培養前述玻尿酸產生細胞時之該培養後的培養基中玻尿酸的分子量和/或含量之增加。別的實施形態中,玻尿酸的分子量和/或含量的增加可為,以相對於步驟(1)培養前的培養基中玻尿酸的分子量和/或含量之增加。
本發明的一個方面是關於評價式1表示的多糖衍生物或其鹽對玻尿酸產生細胞的回應性的方法,該方法包括(1)在含有式1的多糖衍生物或其鹽的培養基中培養前述玻尿酸產生細胞,及(2)測定前述培養基中玻尿酸的分子量和/或含量。評價式1表示的多糖衍生物或其鹽的回應性的方法,亦可包含以步驟(2)中測定的玻尿酸分子量和/或含量的增加作為指標,確認式1的多糖衍生物或其鹽對前述玻尿酸產生細胞的回應性的存在,來作為步驟(3)。
本發明的一個方面是關於玻尿酸的生產方法,該方法包括(1')在含有式1表示的多糖衍生物或其鹽的培養基中,培養玻尿酸產生細胞,以及(2')從前述培養基回收玻尿酸。藉由在含有式1表示的多糖衍生物或其鹽的培養基中培養玻尿酸產生細胞,可以獲得分子量大的HA,使HA生產量增加。
從培養基之玻尿酸的回收,只要是本領域技術人員,可以藉由鹽析、硫酸銨分級、離心、透析、超濾、吸附色譜、離子交換色譜、疏水性色譜、逆相色譜、凝膠滲透色譜、親和性色譜、電泳等,或此等的組合等從來已知的手法進行。如果需要時,亦可以經由已知的方法乾燥經回收的玻尿酸。
本發明的一個方面係關於式1表示的多糖衍生物或其鹽使用於玻尿酸合成促進劑的製造。式1表示的多糖衍生物或其鹽可用作為玻尿酸合成促進劑。玻尿酸合成促進劑,亦即為具有促進玻尿酸合成的作用者即可。因此式1表示的多糖衍生物或其鹽亦可使用於當玻尿酸合成促進劑用製劑的製造。
(實施型態)
以下舉例說明本發明的較佳實施方式。
[1]一種製劑,其為含有多糖衍生物或其鹽的製劑,其特徵在於:多糖衍生物由下式1表示,用於促進玻尿酸合成促進用:
在式1中,X是源自具有羧基和羥基之至少一者的多糖的殘基;A是取代基;n是取代基A的導入率,其為1莫耳%以上80莫耳%以下;X-A之間為前述羧基或羥基與前述取代基A的鍵結,該鍵結選自由酯、硫酯或醯胺構成之群組;前述取代基A以下述式2表示,
*-Y-Z 式2在式2中,Y是間隔子殘基或酯鍵結;Z是雙氯芬酸殘基;Y是間隔子殘基時,Y-Z之間的鍵結選自由酯、硫酯及醯胺構成之群組;*是與X的鍵結部分。
[2][1]記載的製劑,其中,前述多糖係選自由玻尿酸、軟骨素、硫酸軟骨素、肝素、硫酸乙醯肝素和羧基C1-4烷基葡聚糖構成之群組。
[3][1]或[2]記載的製劑,其中,前述間隔子殘基係選自由C1-6伸烷基、胺基酸殘基和多肽鏈構成之群組。
[4][1]至[3]中任一項所記載的製劑,其中,前述玻尿酸合成促進劑係在使用該製劑的對象中經合成的玻尿酸分子量的增加。
[5][1]至[4]中任一項所記載的製劑,其中,前述多糖的平均分子量為10,000以上5,000,000以下。
[6]至少包含以下(A)和(B)的套組:
(A)上述式1表示的多糖衍生物或其鹽
(B)顯示其用於玻尿酸合成促進用的說明書或標籤。
[7]包括將上述式1表示的多糖衍生物或其鹽與玻尿酸產生細胞接觸的步驟之玻尿酸的合成促進方法。
[8][7]中所記載的玻尿酸的合成促進方法,其中,前述多糖係選自由玻尿酸、軟骨素、硫酸軟骨素、肝素、硫酸乙醯肝素和羧基C1-4烷基葡聚糖構成之群組。
[9][7]或[8]中所記載的玻尿酸的合成促進方法,其中,式1中的間隔子殘基係選自由C1-6伸烷基、胺基酸殘基和多肽鏈構成之群組。
[10][7]至[9]中任一項所記載的玻尿酸的合成促進方法,其中,前述玻尿酸合成促進係前述玻尿酸產生細胞中經合成的玻尿酸分子量的增加。
[11][7]至[10]中任一項所記載的玻尿酸的合成促進方法,其中,前述多糖的平均分子量為10,000以上5,000,000以下。
[12][7]至[11]中任一項所記載的玻尿酸的合成促進方法,其中,前述玻尿酸產生細胞係選自由滑膜細胞、軟骨細胞、纖維母細胞、角質細胞、平滑肌細胞、口腔黏膜細胞、血管內皮細胞和乳腺上皮細胞構成之群組。
[13]一種評價玻尿酸產生細胞對上述式1表示的多糖衍生物或其鹽的回應性的方法,該方法包含:(1)在含有前述多糖衍生物或其鹽的培養基中培養前述玻尿酸產生細胞的步驟,以及(2)測定前述培養基中玻尿酸的分子量和/或含量的步驟。
[14][13]中記載的方法,更包含:(3)以前述玻尿酸的分子量和/或含量的增加作為指標,確認前述玻尿酸產生細胞對前述多糖衍生物或其鹽的回應性存在的步驟。
[15]玻尿酸的生產方法,該生產方法包含:(1')在含有上式1表示的多糖衍生物或其鹽的培養基中培養玻尿酸產生細胞的步驟,以及(2')從前述培養基回收玻尿酸的步驟。
[16]一種套組,至少包含下述(A)和(B):
(A)上式1表示的多糖衍生物或其鹽
(B)顯示上式1所示的多糖衍生物或其鹽係為了促進玻尿酸合成之意旨的說明書或標籤。
[17]一種評價上述式1表示的多糖衍生物或其鹽對玻尿酸產生細胞的回應性的方法,該方法包含(1)在含有前述多糖衍生物或其鹽的培養基中培養前述玻尿酸產生細胞的步驟,以及(2)測定前述培養基中玻尿酸的分子量和/或含量的步驟。
[18][17]中記載的方法,更包含:(3)以前述玻尿酸的分子量和/或含量的增加作為指標,確認前述多糖衍生物或其鹽對前述玻尿酸產生細胞的回應性存在的步驟。
[19]上述式1表示的多糖衍生物或其鹽作為玻尿酸的合成促進方法之用途。
[20][19]中所記載的用途,其中,前述玻尿酸的合成促進方法包含使式1表示的多糖衍生物或其鹽與玻尿酸產生細胞接觸的步驟。
[21]上述式1表示的多糖衍生物或其鹽之在玻尿酸產生細胞的回應評價方法中作為玻尿酸合成促進劑之用途。
[22][21]中記載之用途,其中,前述玻尿酸產生細胞的回應性評價方法,包含下述步驟:(1)在含有前述多糖衍生物或其鹽的培養基中培養玻尿酸產生細胞的步驟,以及(2)測定前述培養基中玻尿酸的分子量和/或含量的步驟。
[23][22]中記載之用途,其中,前述玻尿酸產生細胞的回應評價方法更包含:(3)以前述玻尿酸的分子量和/或含量的增加作為指標,確認前述玻尿酸產生細胞對前述多糖衍生物或其鹽的回應性存在的步驟。
[24]玻尿酸產生細胞之在上述式1表示的多糖衍生物或其鹽以的回應性評價方法中之作為玻尿酸合成促進劑之用途。
[25][24]中記載之用途,其中,上述式1表示的多糖衍生物或其鹽的回應性的評價係包含下述步驟:(1)在含有前述多糖衍生物或其鹽的培養基中培養前述玻尿酸產生細胞的步驟,以及(2)測定前述培養基中玻尿酸的分子量和/或含量的步驟。
[26][25]中記載的用途,其中,上述式1表示的多糖衍生物或其鹽的回應性評價,係更包含(3)以前述玻尿酸的分子量和/或含量的增加作為指標,確認前述多糖衍生物或其鹽對前述玻尿酸產生細胞的回應性存在的步驟。
在下文中使用實施例詳細描述本發明的較佳實施形態,但是本發明的技術範圍不受以下實施例的限制。此外,只要沒有加以說明,該操作和物性的測定以在室溫(20℃以上25℃以下)/相對濕度40%RH以上50%RH以下之條件測量。
[實施例1]
以滑膜細胞培養系驗證因式1表示的化合物之玻尿酸的合成促進作用。
(合成例)
經由以下方法合成導入胺基乙醇-雙氯芬酸之玻尿酸鈉(化合物1)。
將2.155g(10.5mmol)2-溴乙胺氫溴酸鹽溶於20mL二氯甲烷,於冰冷下加入1.463mL(10.5mmol)三乙胺,進一步加入二碳酸二第三丁酯(Boc 2 O))2.299g(10.5mmol)的二氯甲烷溶液5mL並攪拌。在室溫攪拌90分鐘後,加入乙酸乙酯,依次用5重量%檸檬酸水溶液、水、飽和食鹽水洗滌。以硫酸鈉脫水後,減壓蒸餾除去溶劑,得到Boc-胺基乙基溴。
將上述得到2.287g(10.2mmol)Boc-胺基乙基溴的二甲基甲醯胺(DMF)溶液5mL冰冷,加入3.255g(10.2mmol)雙氯芬酸鈉(和光純藥工業股份有限公司)的DMF溶液6mL,在室溫攪拌過夜。於60℃攪拌11小時,在室溫攪拌過夜。加入乙酸乙酯,依次以5重量%碳酸氫鈉水溶液、水、飽和食鹽水分液洗滌。以硫酸鈉脫水後,減壓蒸餾除去乙酸乙酯。將殘渣以矽膠管柱色譜法(甲苯:乙酸乙酯=20:1(v/v),0.5體積%三乙胺)精製,得到Boc-胺基乙醇-雙氯芬酸。
將上述取得的2.108g(4.80mmol)Boc-胺基乙醇-雙氯芬酸溶於二氯甲烷5mL中,在冰冷下加入20mL 4M鹽酸/乙酸乙酯,並攪拌2.5小時。加入乙醚、己烷使其沉澱,並將沉澱減壓乾燥。由此得到胺基乙醇-雙氯芬酸鹽酸鹽。構造利用1H-NMR鑑定:1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)=3.18(2H,t,NH2CH2CH2O-),3.94(2H,s,Ph-CH2-CO),4.37(2H,t,NH2CH2CH2O-),6.47-7.31(8H,m,Aromatic H,NH)。
使玻尿酸(重量平均分子量:80萬)500mg(1.25mmol/雙糖單元)溶解於水56.3mL/二噁烷56.3mL後,依序加入羥基琥珀酸醯亞胺(1mmol)/水0.5mL、水溶性羧基醯亞胺鹽酸鹽(WSCI˙HCl)(0.5mmol)/水0.5mL、上述所得之胺基乙醇-雙氯芬酸鹽酸鹽(0.5mmol)/(水:二噁烷=1:1(v/v)5mL),攪拌一晝夜。反應液中加入5重量%碳酸氫鈉水溶液7.5mL,攪拌約4小時。反應液中加入50%(v/v)乙酸水溶液215μl中和後,加入氯化鈉2.5g攪拌。加入乙醇400ml使其沉澱,沉澱物以85%(v/v)乙醇水溶液2次、乙醇2次、乙醚2次洗淨,於室溫減壓乾燥一夜,獲得胺基乙醇-雙氯芬酸導入玻尿酸鈉(化合物1)。藉由分光光度計測定之雙氯芬酸的導入率為18莫耳%。
(試驗物質)
將化合物1或玻尿酸鈉(HA)(ARTZ Dispo(註冊商標)(生化學工業股份有限公司製)),混合於含有磷酸鹽緩衝液(GIBCO)和α-MEM(GIBCO)的濃縮培養基的溶液。進一步地,以終濃度成為10%(v/v)胎牛血清(以下簡稱FBS(MP Biomedicals))、10ng/mL重組人IL-1β/IL-1F2(以下稱IL-1β(R&D Systems))、1%(w/v)青黴素/鏈黴素(GIBCO)和370kBq/mL[3H]葡萄糖胺(Perkin Elmer)的方式,於前述溶液添加、混合各試劑。由此,取得以下五種溶液作為試驗物質。
(1)對照溶液(不含化合物1或HA)
(2)0.1%(w/v%)化合物1溶液
(3)0.1%(w/v%)玻尿酸鈉(HA)溶液
(4)0.01%(w/v%)化合物1溶液
(5)0.01%(w/v%)玻尿酸鈉(HA)溶液。
(試驗方法)
源自關節炎患者的滑膜細胞(HFLS-RA,Cell Applications,Inc)用175cm2燒瓶繼代培養使其增殖。用基礎培養基(含10%(v/v)的生長補充物,1%(w/v)青黴素/鏈黴素)(Cell Applications,Inc製)進行細胞培養。之後,在6孔板中以3.0×105個細胞/2mL/孔的方式接種細胞,培養約24小時直至融合。細胞的培養使用α-MEM培養基(含10%(v/v)FBS,1%(w/v)青黴素/鏈黴素)。除去培養上清液後,於細胞加入2mL試驗物質,進一步培養48小時。培養在於CO2培養箱(5%(v/v)CO2)內,於37℃進行。培養結束後,回收培養上清液並冷凍保存在超低溫冰箱直至測定。
由於葡萄糖胺是玻尿酸的構成單糖,因此在添加試驗物質後於細胞內新合成的玻尿酸,攝入[3H]葡萄糖胺。因此,使用HPLC根據分子量分離回收培養上清液中的玻尿酸,使用分液收集器每0.5分鐘回收分液。回收的各分液中加入0.5mL閃爍液並混合。接著,使用閃爍計數器測定各分液的放射能(dpm,disintegrations per minute),評價放射能(對新產生的玻尿酸的[3H]葡萄糖胺的攝入量)。HPLC條件如下:移動相:5mmol/L磷酸鹽緩衝液(pH 6.0),0.82%(w/v)NaCl:乙腈=2:1(v:v)的溶液
流速:0.5mL/min
管柱:OH pak SB-805 HQ柱(Shodex®登錄商標),管柱溫度:35℃
注入量:10μL
閃爍計數器條件
3H,dpm,3分鐘
閃爍液:用於流動閃爍分析儀的Ultima-FloTMM閃爍液。
玻尿酸標準溶液以HPLC分離,測定波長210nm的UV吸收。各分子量的玻尿酸標準溶液的最高峰算出回收分液數。使用Select-HATM 500k(平均分子量528,000),Select-HATM 1,000k(平均分子量1,076,000),Select-HATM 2,500k(平均分子量2,420,000)作為玻尿酸標準溶液。
(結果)
結果示於第1A圖和第1B圖。
第1A圖
1)對照組(n=2)
2)0.1%(w/v%)玻尿酸鈉(HA)組(n=1)
3)0.1%(w/v%)化合物1組(n=1)。
第1B圖
1)對照組(n=1)
2)0.01%(w/v%)玻尿酸鈉(HA)組(n=1)
3)0.01%(w/v%)化合物1組(n=1)。
在第1A圖和第1B圖中,結果由平均值表示(每組的例數=1至2)。
在對照組中,產生峰約為500,000的玻尿酸,如第1A圖和第1B圖所示。再者,在HA組中,產生峰約500,000至2,400,000的玻尿酸,顯示在化合物1組中超過HA組中產生的玻尿酸之高分子量的玻尿酸係濃度依賴性的產生。化合物1組中產生的玻尿酸,於任一濃度與HA組產生的玻尿酸相比,均為較高分子量。
由上可知,化合物1,對於源自人類風濕病患者的滑膜細胞,具有促進高分子量玻尿酸的合成的作用。亦確認其作用高於玻尿酸鈉,即使為在0.01%(w/v)的濃度。
[實施例2]
因化合物1的作用使合成受到促進的物質為玻尿酸,藉由確認因玻尿酸分解酵素(玻尿酸酶)之分解的有無而證實。
(試驗物質)
以與實施例1的方相同的方式,製備以下兩種溶液作為試驗物質。
(1)0.01%(w/v%)玻尿酸鈉(HA)溶液
(2)0.01%(w/v%)化合物1溶液。
(試驗方法)
以與實施例1的方法相同的方式實施。
添加0.01%HA溶液後回收的培養上清液(90μL),與10μL的100TRU/mL玻尿酸酶(或注射用水)混合,在37℃反應一夜進行玻尿酸酶處理。將添加0.01%化合物1溶液後回收的培養上清液和30μ的L100TRU/mL玻尿酸酶(或注射用水)混合,於60℃反應3小時來進行玻尿酸酶處理。玻尿酸酶(源自放線菌)係購自生化學Bio Business公司。
以與實施例1的方法相同的方式實施。
(結果)
結果如第2圖所示。
第2圖A(各n=1)
1)0.01%HA(玻尿酸酶(-))組
2)0.01%HA(玻尿酸酶(+))組。
第2圖B(各n=1)
1)0.01%化合物1(玻尿酸酶(-))組
2)0.01%化合物1(玻尿酸酶(+))組。
在0.01%HA(玻尿酸酶(-))組和0.01%化合物1(玻尿酸酶(-))組中均確認高分子量放射性物質的產生。0.01%化合物1(玻尿酸酶(-))組的放射性物質的分子量大於0.01%HA(玻尿酸酶(-))組的放射性物質分子量。
另一方面,在0.01%HA(玻尿酸酶(+))組和0.01%化合物1(玻尿酸酶(+))組中均確認這些高分子量放射性物質的峰消失。
由上可知,藉由添加HA或化合物1而分子量增加的物質是玻尿酸。
[實施例3]
檢測化合物1對玻尿酸合成促進作用的歷時變化。
(試驗物質)
以與實施例1的方法相同的方式,製備以下三種溶液作為試驗物質。
(1)對照組溶液
(2)0.1%(w/v%)化合物1溶液
(3)0.1%(w/v%)玻尿酸鈉(HA)溶液。
(試驗方法)
以與實施例1的方法相同的方式實施。而且,於將試驗物質加入細胞後的每個時間點(8、24、36、48、72小時)收集培養上清液。
(結果)
結果如第3圖所示。
第3圖A 對照組(8、24、36、48、72小時)組(各n=1)
第3圖B 0.1%HA(8、24、36、48、72小時)組(各n=1)
第3圖C 0.1%化合物1(8、24、36、48、72小時)組(各n=1)。
在對照組、HA組和化合物1組中均有產生玻尿酸,並且確認玻尿酸含量隨著時間而增大。在對照組中,產生峰約為500,000的玻尿酸。在HA組中,產生峰約1,000,000的玻尿酸。在化合物1組中,產生具有比HA組更高分子量的玻尿酸。
由上可知,化合物1和玻尿酸鈉任一者均誘導高分子量玻尿酸的產生,歷時性地使培養基中的高分子量玻尿酸增加。此外,化合物1組中玻尿酸的分子量與HA組中玻尿酸的分子量比較為更大。關於分子量,在任何一組中均未確認到經時的峰變化。化合物1組於測定期內一直有內因性高分子量玻尿酸產生作用。
(實施例4)
比較化合物1成分的玻尿酸鈉和雙氯芬酸鈉(DF-Na)之因化合物1所致之玻尿酸的合成促進作用。
(試驗物質)
以與實施例1的方法相同的方式,製備對照溶液、0.01%(w/v%)化合物1溶液和0.01%(w/v%)玻尿酸鈉(HA)溶液。藉由將DF-Na溶解在對照溶液中來製備DF-Na(0.014μg/mL、0.14μg/mL、1.4μg/mL和14μg/mL)溶液。另外,將DF-Na(1.4μg/mL)溶解在0.01%(w/v%)玻尿酸鈉(HA)溶液中,得到HA+DF-Na混合溶液。
(1)對照組溶液
(2)0.01%(w/v%)化合物1溶液
(3)0.01%(w/v%)玻尿酸鈉(HA)溶液
(4)DF-Na(0.014、0.14、1.4和14μg/mL)溶液
(5)玻尿酸鈉(HA)+DF-Na(1.4μg/mL)的0.01%(w/v%)混合溶液。
(試驗方法)
以與實施例1的方法相同的方式實施。
(結果)
結果如第4A圖和第4B圖中所示。
第4A圖(各n=2)
1)對照組
2)0.01%化合物1組
3)0.01%HA組
4)DF-Na(1.4μg/mL)組
5)0.01%HA+DF-Na(1.4μg/mL)組。
第4B圖
1)對照組(n=1)
2)DF-Na(0.014、0.14、1.4和14μg/mL)組(各n=1)。
DF-Na(14μg/mL)的濃度相當於0.01%化合物1中含有的DF-Na濃度。
在對照組中產生峰為約500,000的玻尿酸,並且在HA組中確認約1,000,000的峰的玻尿酸的產生(第4A圖)。化合物1組,高分子量玻尿酸的產生比HA組更為顯著。
在HA+DF-Na混合溶液組中,與HA組一樣都確認有約1,000,000峰的玻尿酸的產生(第4A圖)。
在DF-Na組中,與對照組相似,確認有峰約500,000的玻尿酸的產生(第4A圖)。
在DF-Na組和HA+DF-Na混合物組中,未觀察到如同化合物1組中確認到的高分子量玻尿酸的產生作用(第4A圖)。此外,DF-Na在0.014至14μg/mL的任何濃度均未確認到玻尿酸的合成促進作用(第4B圖)。
根據上述結果,化合物1投與中確認的高分子量玻尿酸產生作用,在玻尿酸鈉、DF-Na或HA+DF-Na混合液投與中,均未確認。亦即,因化合物1所致內因
性玻尿酸的分子量增加作用,由於在化合物1的構成成分的單純混合中未確認,瞭解其為式1表示的多糖衍生物特有的作用。
[實施例5]
使用人類滑膜細胞,驗證因化合物1所致玻尿酸的合成促進作用。此時,使用源自複數的人類的滑膜細胞檢驗患者差異的影響。
(試驗物質)
以與實施例1的方法相同的方式,製備以下五種溶液作為試驗物質。
(1)對照組溶液
(2)0.01%(w/v%)化合物1溶液
(3)0.01%(w/v%)玻尿酸鈉(HA)溶液
(4)0.1%(w/v%)化合物1溶液
(5)0.1%(w/v%)玻尿酸鈉(HA)溶液。
(試驗方法)
以與實施例1的方法相同的方式實施。此外,使用源自3名人類變形性關節症患者的滑膜細胞(HFLS-OA,Cell Applications,Inc製)和源自3名人類類風濕患者的滑膜細胞(HFLS-RA,Cell Applications,Inc製)。分別評價源自3人的各疾患患者的細胞(3批)。
以與實施例1的方法相同的方式實施。使用相較於HPLC管柱(OH pak SB-805 HQ柱,Shodex(註冊商標))對於高分子量方面具有更佳分離能力的長管柱(OH pak SB-807 HQ柱,Shodex(註冊商標))。
培養上清液回收後,從各孔中剝離黏著的細胞。此後,使用台盼藍溶液和血球計數盤計測細胞數目。
(結果)
結果如第5A圖至第5D圖所示。
第5A圖(各n=3,源自3位類風濕患者的滑膜細胞)
1)對照組。
2)0.01%HA組。
3)0.01%化合物1組。
第5B圖(各n=3,源自3位變形性關節症患者的滑膜細胞)
1)對照組。
2)0.01%HA組。
3)0.01%化合物1組。
第5C圖(各n=3,源自3位變形性關節症患者的滑膜細胞)
1)對照組。
2)0.1%HA組。
3)0.1%化合物1組。
第5D圖(各n=3,源自3位變形性關節症患者的滑膜細胞)
1)對照組。
2)0.1%HA組。
3)0.1%化合物1組。
在第5A圖至第5D圖各者中,結果由平均值±標準誤差(各n=3)表示。在第5A圖(源自類風濕性關節炎患者的滑膜細胞)和第5B圖(源自變形性關節症患者的滑膜細胞)中,在0.01%化合物組1中,確認有峰在約2,400,000的高分子量玻尿酸產生,在0.01%HA組中確認有峰約1,000,000的玻尿酸產生。在第5C圖中(源自變形性關節症患者的滑膜細胞),確認在0.1%化合物1組中超過2,400,000的高分子量玻尿酸的產生。以使用高分子量方面的分離能力的長管柱,因化合物1投與而產生的高分子量玻尿酸的分子量變得更明確。此外,確認到化合物1的濃度依賴性地而產生更高分子量的玻尿酸。第5D圖(源自變形性關節症患者的滑膜細胞)中,未確認各組細胞數有顯著差異(參數Tukey型多重比較試驗中p>0.05),添加0.1%化合物1以及0.1%HA時,細胞數沒有顯著地增減。
如上所述,因化合物1投與所致之高分子量玻尿酸產生作用,在源自風濕病患者和變形性關節症患者任一者的滑膜細胞中均確認。瞭解因化合物1所致之玻尿酸分子量的增加,在樣品之間的差異小。此外,化合物1相較於玻尿酸鈉具有誘導高分子量玻尿酸產生的作用。此外,瞭解了因化合物1所致之高分子量玻尿酸產生的作用,不是由於細胞數的增加,而是在細胞中合成的玻尿酸高分子量化。
(實施例6)
驗證因化合物1所致之玻尿酸合成促進作用的作用機制。
(試驗物質)
將化合物1或玻尿酸鈉(HA)(ARTZ Dispo(註冊商標)(生化學工業股份有限公司製))加入到含有磷酸鹽緩衝溶液和α-MEM濃縮培養基的溶液中混合。進一步地,將最終濃度為10%(v/v)的胎牛血清(以下簡稱FBS)、10ng/mL重組人類IL-
1β/IL-1F2(以下稱IL-1β)以及1%(w/v)的青黴素/鏈黴素的方式,於前述的溶液添加、混合各試藥。藉此,製備以下三種溶液作為試驗物質。
(1)對照組溶液。
(2)0.1%(w/v%)化合物1溶液。
(3)0.1%(w/v%)玻尿酸鈉(HA)溶液。
(測試方法)
將源自人類變形性關節症患者的滑膜細胞(HFLS-OA,Cell Applications,Inc製)在175cm2燒瓶繼代培養使其增殖。細胞培養時,用基礎培養基(包括10%(V/V)生長補充物,1%(w/v)青黴素/鏈黴素)(Cell Applications,Inc製)。接著,將細胞以3.0×105個細胞/2mL/孔的方式接種在6孔板,培養約24小時直至融合。細胞的培養使用α-MEM培養基(包括10%(v/v)FBS、1%(w/v)青黴素/鏈黴素)。除去培養上清液後,在孔中添加入2mL試驗物質進一步培養48小時。培養在CO2培養箱(5%(v/v)CO2)內,於37℃進行。
培養完成後,使用RNeasy(註冊商標)Plus Mini Kit(QIAGEN),從每孔的細胞抽出RNA。使用超微量分光光度計測定RNA濃度後,將樣品在超低溫冰箱中冷凍保存。使用抽出的RNA,使用Super Script(註冊商標)III First-Strand Synthesis System(Invitrogen),調製cDNA樣品。
將cDNA樣品用Premix ExTaq(Perfect Real Time)(Takara Bio Inc.)進行實時PCR,測定標靶基因(HAS 1、HAS 2、HAS 3、HYAL 1、HYAL 2和HYAL 3)和GAPDH的Ct值,並以△△Ct法算出相對的mRNA量。
Probe & primer是使用Taqman(註冊商標)的Gene Expression Assay(Applied Biosystems)。HAS1(ID:Hs00987418_m1),HAS2(ID:Hs00193435_m1),HAS3(ID:Hs00193436_m1),HYAL1(ID:Hs00201046_m1),HYAL2(ID:Hs01117343_g1),HYAL3(ID:Hs00185910_m1),GAPDH(ID:Hs03929097_g1)。
(結果)
結果如第6圖所示(各n=3,源自3位患有變形性關節症患者的滑膜細胞)。
第6A圖HAS1,HAS2和HAS3之相對的mRNA量
1)對照組。
2)0.1%HA組。
3)0.1%化合物1組。
第6B圖HYAL1,HYAL2和HYAL3之相對的mRNA量
1)對照組。
2)0.1%HA組。
3)0.1%化合物1組。
在第6圖中,結果用平均值±標準誤差表示(各組例數=3)。*和**分別表示在Dunnett試驗中p<0.05,p<0.01(vs對照組)。
確認化合物1顯著地抑制HYAL2 mRNA表達,顯著地促進HAS 2 mRNA表達。另一方面,未確認對玻尿酸鈉對HYAL 1、2、3和HAS 1、2、3的表達的影響。
如上所述,化合物1促進高分子量玻尿酸產生有關的HAS2 mRNA的表達。由此可知,因化合物1所致之玻尿酸合成促進的作用機制,與可HAS 2 mRNA的表達促進相關的可能性高。此外,由於化合物1抑制與高分子量玻尿酸分解有關的HYAL2 mRNA表達,因此顯示出抑制高分子量玻尿酸分解的機制也與該作用機制有關的可能性。
(實施例7)
抗原誘發關節炎模型兔中,驗證因化合物1所致之玻尿酸合成促進作用。
(試驗物質)
1%(w/v)的化合物1溶液(磷酸鹽緩衝溶液)、10%(w/v)卵白蛋白溶液(磷酸緩衝液)和[3H]葡糖胺(磷酸鹽緩衝液,37MBq/mL)的各溶液以5:1:4(v:v:v)的比率的混合,以獲得0.5%(w/v%)的化合物1溶液。對照組溶液為使用磷酸鹽緩衝溶液替代上述化合物1溶液而調製。玻尿酸鈉(HA)溶液的調製係使用ARTZ DISPO(註冊商標)(生化學工業股份有限公司製)以替代上述的化合物1溶液。此外,磷酸緩衝液和[3H]葡糖胺(磷酸鹽緩衝液,37MBq/mL)的各溶液以3:2(v:v)的比例混合,而獲得不含有卵白蛋白(關節炎誘發物質)的標準溶液。以下用作試驗物質。
(1)對照組溶液。
(2)0.5%(w/v%)玻尿酸鈉(HA)溶液。
(3)0.5%(w/v%)化合物1溶液。
(4)標準溶液。
(試驗方法)
將卵白蛋白(SIGMA製)以1%(w/v)生理鹽水溶解調製(大塚製藥股份有限公司製),並與弗氏完全佐劑(CAPPEL製)以1:1(v:v)混合製成油包水型乳劑。將全身麻醉下的日本白色種兔(雄性,16週齡,東方酵母工業股份有限公司)用一般乳劑(咪達唑侖、甲苯噻嗪和布托啡諾,分別為0.67mg/kg、5.3mg/kg和0.67mg/kg,iv)在背部數十個位置共計1mL投與並致敏。在致敏後第12天,再次投與同樣的乳劑追加致敏。在第二次致敏約2至3個月後投與試驗物質(關節炎誘發)之前,將全身麻醉狀態下的兔後肢膝關節腔內部,以1mL生理食鹽液洗滌3次並回收關節液。隨後,將試驗物質(含有關節炎誘發物質)以0.5mL/關節的劑量投與到兔後肢膝關節腔中。將標準溶液(不含關節炎誘發物質)投與正常組並且不誘發關節炎。投與48小時後,全身麻醉狀態下的兔後肢膝關節腔用1mL生理食鹽液洗滌3次,並回收關節液。將回收的關節液離心,收集上清液並冷凍保存。
將回收的關節液在100℃加熱10分鐘。接著,將30μL的200μg/mL蛋白酶(Merck股份有限公司製)和270μL關節液混合,於37℃分解一夜進行蛋白酶處理。將蛋白酶處理後的關節液於100℃加熱10分鐘後,收集離心後的上清液並冷凍保存。
由於葡萄糖胺是玻尿酸的構成單糖,因此在投與試驗物質後的生體內新合成的玻尿酸中攝入[3H]葡糖胺。因此,將回收到的上清液中的玻尿酸用HPLC根據分子量而分離,並使用分液收集器每0.5分鐘回收分液。在回收到的每個分液中加入0.5mL閃爍液並混合。接著,使用閃爍計數器測定每個分液的放射能(dpm,
disintegrations per minute)以評估放射能(新合成的玻尿酸中[3H]葡萄糖胺的攝入量)。HPLC條件如下:移動相:5mmol/L磷酸鹽緩衝液(pH 6.0),0.82%(w/v)NaCl:乙腈=2:1(v:v)的溶液
流速:0.5mL/min
柱:OH pak SB-807 HQ管柱(Shodex(註冊商標)),管柱溫度:35℃。
注入量:100μL
閃爍計數器條件
3H,dpm,3分鐘
閃爍液:用於流動閃爍分析儀的Ultima-FloTMM混合物。
以HPLC分離玻尿酸標準溶液,並測定在210nm波長的UV吸收。各分子量的玻尿酸標準溶液的頂峰算出回收分液數。以鏈球菌玻尿酸聚合物(平均分子量804,000,Iduron公司製)及Select-HATM 2,500k(平均分子量2,384,000)作為標準玻尿酸樣品使用。此外,由正常兔膝關節回收的關節液也同樣算出分液數。
(結果)
結果如第7圖所示。
(1)對照組(n=3)
(2)HA(n=3)
(3)化合物1(n=3)
(4)正常(無誘發關節炎)(n=1)。
在第7圖中,結果由平均值表示(n=3,僅正常組n=1)。在正常兔膝關節中合成的玻尿酸確認在高於2,300,000高分子量域的峰(正常關節液)。化合物1投與
後在兔膝關節中合成的玻尿酸,確認在2,300,000附近的峰。化合物1投與組中的高分子量玻尿酸量,與玻尿酸鈉投與組相比較為顯著。而且,化合物1投與組中玻尿酸的生產量與正常組的相比也更加顯著。
本發明雖然已經記載了相關的具體實施例和各種實施型態,但若是本領域技術人員則輕易可以理解,於本說明書所記載的實施形態中符合本發明的精神和範圍內得有多數的修改和應用。
本申請案基於2018年3月27日提交於日本專利局的日本專利申請案特願2018-59772號主張優先權,要求參照該內容並引用其全部併入本申請案。
Claims (13)
- 如申請專利範圍第2項所述之玻尿酸的合成促進方法,其中,前述多糖選自由玻尿酸、軟骨素、硫酸軟骨素、肝素、硫酸乙醯肝素、以及羧基C1-4烷基葡聚糖構成之群組。
- 如申請專利範圍第2項或第3項所述之玻尿酸的合成促進方法,其中,前述間隔子殘基選自由C1至C6伸烷基、胺基酸殘基、以及多肽鏈構成之群組。
- 如申請專利範圍第2項至第4項中任一項所述之玻尿酸的合成促進方法,其中,前述的玻尿酸合成促進係前述玻尿酸產生細胞中,合成的玻尿酸分子量的增加。
- 如申請專利範圍第2項至第5項中任一項所述之玻尿酸的合成促進方法,其中,前述多糖的平均分子量為10,000以上5,000,000以下。
- 如申請專利範圍第2項至第6項中任一項所述之玻尿酸的合成促進方法,其中,前述玻尿酸產生細胞選自由滑膜細胞、軟骨細胞、纖維母細胞、角質細胞、平滑肌細胞、口腔黏膜細胞、血管內皮細胞和乳腺上皮細胞構成之群組。
- 一種評價玻尿酸產生細胞對下述式1表示的多糖衍生物或其鹽的回應性的方法,該方法包含:(1)在含有前述多糖衍生物或其鹽的培養基中培養前述玻尿酸產生細胞的步驟,以及(2)測定前述培養基中玻尿酸的分子量和/或含量的步驟,
- 如申請專利範圍第8項所述之方法,更包含(3)以前述玻尿酸的分子量和/或含量的增加作為指標,確認前述玻尿酸產生細胞對前述多糖衍生物或其鹽的回應性存在的步驟。
- 一種評價下述式1表示的多糖衍生物或其鹽對玻尿酸產生細胞的回應性的方法,該方法包含:(1)在包含前述多糖衍生物或其鹽的培養基中,培養前述玻尿酸產生細胞的步驟,以及(2)測定前述培養基中的玻尿酸的分子量和/或含量的步驟,
- 如申請專利範圍第12項所述之方法,更包含(3)以前述玻尿酸的分子量和/或含量的增加作為指標,確認前述多糖衍生物或其鹽對前述玻尿酸產生細胞之回應性的步驟。
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