CN102348464A - 可注射生物材料 - Google Patents

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Abstract

由原弹性蛋白形成的、用于组织修复和复原的可注射生物材料组合物。所述组合物包含多糖或多糖衍生物形式的聚结控制剂，其量有效地为所述物质提供流动特性，使其能够用于注射。

Description

可注射生物材料
技术领域
本发明涉及原弹性蛋白(tropoelastin)，并涉及使用生物材料进行组织修复和复原。
背景技术
弹性蛋白是细胞外基质蛋白质，其主要存在于皮肤、血管、肺以及需要一定程度的弹性来行使功能的其它组织和器官中。它通常是这样形成的：原弹性蛋白分子上的赖氨酸残基与另一些原弹性蛋白分子上的赖氨酸残基发生交联，形成在水溶液中几乎不溶的团。
预期弹性蛋白、原弹性蛋白和相关蛋白质可用于包括组织修复和复原的医疗应用中，尤其需要可通过注射施用给组织的、具有高固含量(highsolids content)的此类蛋白质的组合物。尽管在WO99/11196和WO2008/058323中提到了由生物材料形成的微颗粒，但是尚没有具有高固含量之此类蛋白质并具有足以通过注射进行组织递送之流动特性的更小颗粒结构的组合物。一个问题是，当固含量高时，原弹性蛋白形成的团不能通过临床和美容应用中采用的各种规格的针进行递送。
仍需要这样的组合物，其具有高固含量的原弹性蛋白或其它弹性材料并具有使所述组合物能通过注射递送到组织的流动特性。
在本说明书中对任何现有技术的引用不是也不应被认为是对以下的承认或任何形式的暗示，即该现有技术形成澳大利亚或任何其它管辖区域的公知常识的一部分，或者本领域技术人员有理由预期该现有技术被确认、理解并认为是相关的。
发明概述
在一些实施方案中，提供了一种由原弹性蛋白形成的可注射组合物，所述组合物包含含有原弹性蛋白的物质，其中所述物质还包含一种其量有效地为所述物质提供流动特性以使所述组合物能被注射的试剂。所述含有原弹性蛋白的物质可为颗粒或非颗粒。
在一些实施方案中，提供了一种用于矫正组织缺陷的可注射组合物，所述组合物包含含有多个由原弹性蛋白形成之微颗粒的液相，所述液相具有溶于其中的聚结控制剂，其量有效地减少所述微颗粒的聚结。
在一些实施方案中，提供了生产由原弹性蛋白形成之微颗粒的方法，其包括在液相中凝聚或聚合原弹性蛋白的步骤，所述液相中溶解有聚结控制剂。
除了根据上下文有另外解释的情形外，本文所用的术语“包含”及该术语的多种变化形式(如“包括”、“含有”)不旨在排除其它添加物、组分、整数或步骤。
附图说明
图1A：由原弹性蛋白形成的、估计直径为1μm的微颗粒的SEM图，其通过用碱处理2mg/mL的原弹性蛋白溶液[实施例1]而后在37℃孵育4小时来制备。
图1B：弹性材料团的图，所述弹性材料团如实施例2所述进行制备，即用碱处理10mg/ml的原弹性蛋白溶液，然后在不存在聚结控制剂的情况下于37℃下孵育。制得的材料是不适于注射的致密弹性团。
图2：由原弹性蛋白形成的小球的SEM图，所述小球通过在1％(重量/体积)CMC存在下用0.05％(体积/体积)戊二醛处理50mg/mL的原弹性蛋白溶液而后在37℃孵育24小时来制备。
图3：由原弹性蛋白形成的聚结小球的SEM图，所述聚结小球通过在1％(重量/体积)中等粘度HA存在下用0.05％(体积/体积)戊二醛处理50mg/mL的原弹性蛋白溶液而后在37℃孵育16小时来制备。
图4A：由原弹性蛋白形成之聚结小球制成的材料的SEM图，所述聚结小球的表观直径范围为约1～4μm，所述材料通过在1％(重量/体积)HA存在下用碱处理10mg/mL的原弹性蛋白溶液而后在37℃孵育过夜来制备。
图4B：由原弹性蛋白形成之聚结小球制成的材料的SEM图，所述聚结小球的表观直径范围为约1～4μm，所述材料通过在1％(重量/体积)HA存在下用碱处理25mg/mL的原弹性蛋白溶液而后在37℃孵育过夜来制备。
图4C：由原弹性蛋白形成之聚结小球制成的材料的SEM图，所述聚结小球的表观直径范围为约1～10μm，所述材料通过在1％(重量/体积)HA存在下用碱处理50mg/mL的原弹性蛋白溶液而后在37℃孵育过夜来制备。
图4D：由原弹性蛋白形成之聚结小球制成的材料的SEM图，所述聚结小球的表观直径范围为约0.5～20μm，所述材料通过在1％(重量/体积)HA存在下用碱处理75mg/mL的原弹性蛋白溶液而后在37℃孵育过夜来制备。
图5：通过在1％(重量/体积)HA存在下用碱处理(○)10mg/mL原弹性蛋白；(●)25mg/mL原弹性蛋白；(□)50mg/mL原弹性蛋白和(■)75mg/mL原弹性蛋白而后在37℃孵育过夜制成的小球的大小分布(小球直径(μm)相对于所计数小球的百分比)。数据从图4A-4D的SEM图中获取。
图6A和6B：由原弹性蛋白形成的多种大小的聚结小球所制成的材料的SEM图，所述材料通过在1％(重量/体积)CMC存在下用0.05％(体积/体积)GA处理100mg/mL的原弹性蛋白溶液而后在37℃搅拌4小时来制备。
图7A和7B：由原弹性蛋白形成的聚结小球所制成的材料的SEM图，所述材料通过在1％(重量/体积)CMC存在下用碱处理100mg/mL的原弹性蛋白溶液而后在37℃搅拌孵育4小时来制备。
图7C和7D：由原弹性蛋白形成的聚结小球所制成的材料的SEM图，所述材料如下制备：在1％(重量/体积)CMC存在下用碱处理100mg/mL的原弹性蛋白溶液，然后在37℃搅拌孵育4小时，在4℃冷藏16小时，之后用1M HCl对溶液进行中和。
图8A和8B：通过在1.5％(重量/体积)黄原胶存在下用0.05％(体积/体积)GA处理100mg/mL原弹性蛋白溶液而后在37℃搅拌4小时所制成的材料的SEM图。
图9A和9B：通过在2％(重量/体积)HPC存在下用0.05％(体积/体积)GA处理100mg/mL的原弹性蛋白溶液而后在37℃搅拌4小时所制成的材料的照片和SEM图。
实施方案详述
本发明人发现，当在原弹性蛋白固含量高的情况下原弹性蛋白聚结并交联形成弹性蛋白和/或对原弹性蛋白进行碱性聚合作用形成弹性材料时(如WO2008/058323所述，其内容通过引用整体并入本文)，所形成的团不能通过手术针。本发明人发现，不能注射之团的形成是由于固含量高的原弹性蛋白单体凝集或聚结成微颗粒或小球，其进一步凝集或聚结形成不能注射的团。本发明人还发现，通过在聚结控制剂的存在下聚结或聚合原弹性蛋白，原弹性蛋白固含量高时形成的不能注射的团可被减少(如果不能完全避免的话)，从而形成具有高固含量和可注射组合物所需之流动特性的组合物。而且发现，通过调整原弹性蛋白和聚结控制剂的相对量，可以控制小球凝集的程度，从而得到凝集小球形式的含原弹性蛋白的物质，所述凝集小球具有预定的大小或结构并具有注射应用所期望的流动特性。还可以产生团形式的含原弹性蛋白的物质，所述团也是可注射的但基本无微颗粒或小球结构。在该情况下，所述可注射材料可以更好地被描述为“可变形团”，而不是分散的颗粒或小球。这是引人关注的，因为通过原弹性蛋白交联或碱性聚合形成的团通常不适于注射。这些实施方案在如下情况下尤其有利：临床或美容应用需要可注射入应用位点的植入物。
I.定义
应理解“原弹性蛋白”是指这样的蛋白质，其含有源自可交联(通常通过赖氨酰氧化酶在赖氨酸残基处交联)形成弹性蛋白的蛋白质分子的至少部分疏水结构域。已知多种原弹性蛋白的同工型(参见例如WO99/03886，其内容通过引用整体并入本文)。正常情况下在组织中不存在任何显著量的原弹性蛋白，因为其通常几乎在合成后立即交联形成弹性蛋白。原弹性蛋白可以具有与GenBank条目AAC98394相同的序列。本领域已知另一些原弹性蛋白序列，其包括但不限于CAA33627(人，Homo sapiens)、P15502(人)、AAA42271(褐家鼠，Rattus norvegicus)、AAA42272(褐家鼠)、AAA42268(褐家鼠)、AAA42269(褐家鼠)、AAA80155(小家鼠，Mus musculus)、AAA49082(原鸡，Gallus gallus)、P04985(家牛，Bos taurus)、ABF82224(斑马鱼，Danio rerio)、ABF82222(非洲爪蟾，Xenopus tropicalis)、P11547(绵羊，Ovis aries)。原弹性蛋白还可以是这些序列的片段。一个实例是AAC98394的27至724位氨基酸。原弹性蛋白的另一实例由UniProtKB/Swiss Prot条目P15502描述。术语原弹性蛋白还旨在涉及弹性蛋白样肽(elastin like peptide)或“ELP”。原弹性蛋白可以是天然或重组的。例如，可通过重组表达系统(其实例在WO00/04043和WO94/14958(其内容通过引用在本文中全部公开)以及WO99/03886中讨论)或肽合成(如固相肽合成)获得原弹性蛋白。
“原弹性蛋白同源物”是指所具有的序列与原弹性蛋白参照序列不相同但相似的蛋白质。其还与所述参照序列具有相同的功能。
“弹性蛋白”是指正常情况下存在于皮肤、血管、肺以及需要弹性来行使功能的其它组织和器官中的细胞外基质蛋白。其通过原弹性蛋白分子上的赖氨酸残基共价交联成团而形成，所述团几乎不溶于水溶液。通常体内原弹性蛋白分子的交联通过一种或多种赖氨酰氧化酶发生。原弹性蛋白分子的交联可以在体外通过化学交联剂(如戊二醛或六亚甲基二异氰酸酯或其它能与蛋白质反应的交联剂)介导。胺反应性交联剂的实例包括双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸盐(BS3)、中性条件(pH 7)下的乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)、三琥珀酰亚胺氨基三乙酸酯(TSAT)、双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)和β-[三(羟甲基)膦基]丙酸(THPP)。羧基反应性交联剂的实例包括1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和酸性条件(pH＜4)下的乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)。由于原弹性蛋白可以以多种形式提供，弹性蛋白本身可以由多种结构构成，这影响弹性蛋白的弹性。交联的程度不需要完全，在完全交联时原弹性蛋白分子的所有潜在反应位点都已交联。事实上，原弹性蛋白可以仅部分交联。
“聚结”是指随着温度升高到生理范围原弹性蛋白(其通常在低温下可溶于水溶液)倾向于凝集形成致密粘弹性相的过程。该过程主要由原弹性蛋白疏水结构域之间的相互作用产生。
通常认为聚结是原弹性蛋白形成弹性蛋白的共价交联的必要前提。
“弹性材料”是指通过碱性聚合过程由原弹性蛋白形成的材料，所述过程如WO2008/058323所述涉及原弹性蛋白的疏水结构域，它是形成具有弹性(可拉伸、有张力、有弹性并且能回缩)的固体的不可逆过程。所述弹性材料可以仅部分聚合；在某些实施方案中聚合反应不完全。弹性材料无论是否交联均具有弹性；因此形成弹性材料的碱性聚合过程可以任选地进一步包括化学交联步骤。
“原弹性蛋白形成的小球”或“原弹性蛋白形成的微颗粒”是指包含“弹性蛋白”和“弹性材料”之一或两者或由其组成的颗粒。这些颗粒倾向于在无聚结控制剂存在下进一步聚结或凝集成不可注射的团。
“基本无颗粒结构的可注射组合物”是原弹性蛋白形成的组合物，其中原弹性蛋白形成的小球已经聚结或凝集成组合物中小球或颗粒结构已不再明显的状态。尽管如此，所述组合物仍能被注射。
“聚结控制剂”是指减少、抑制或以另外方式控制原弹性蛋白形成之颗粒或小球的凝集、聚簇或聚结从而允许本发明组合物进行递送(通常经由具有一般临床或美容应用中采用的内径或管径的针或插管通过正压递送)的化合物或提取物。聚结控制剂一般增加液相的粘度，在所述液相中发生由原弹性蛋白聚结或聚合成弹性蛋白或弹性材料的过程。在某些实施方案中，聚结控制剂限制从原弹性蛋白形成的小球进一步彼此聚结。在某些实施方案中，聚结控制剂阻止或抑制基本无颗粒结构的含原弹性蛋白的材料形成不可注射固体。
短语“有效减少聚结的量”是指足以抑制、减缓、延迟或基本上阻止由原弹性蛋白聚结形成小球的聚结控制剂之量。不需要阻止所有小球与其它小球的凝集或聚结。在某些实施方案中，优选地可以发生小球的进一步聚结，前提是这基本不会防碍组合物被注射。特别地，在某些实施方案中，有效阻止凝结的量提供了基本无颗粒或小球结构的可注射组合物。
“可注射组合物”是指具有使其流过针或插管的特性的组合物。通常，所述针或插管具有临床或美容应用中通常采用的内径或管径。在某些实施方案中，组合物将无显著阻碍地通过内径约1.194mm(对应16号(gauge，G)针)的针或插管。更优选地，所述组合物能容易地通过21号针。更优选地，所述组合物能容易地通过27号针。
术语“组织缺陷”是指导致异常组织结构和/或功能的异常、畸形或不健全。组织缺陷可源于先天病症、外科手术、外伤、疾病或其它损伤，或者通常与它们相关。或者，组织缺陷可与衰老相关。实例包括组织弹性缺损、组织体积缺损、组织起皱和凹陷。“组织缺陷”还可以指组织的结构和功能处于解剖学和生理学的正常范围内，但患者认为不充足并希望扩充的情形。
“矫正组织缺陷”是指至少部分地复原和/或增大组织结构和/或功能，包括支持、加强、扩大组织或使组织更具弹性，或者促使组织缺陷中的组织生长。
术语“治疗有效量”是指改变或矫正组织缺陷所需的可注射组合物的量。所述有效量可根据以下因素来变化：患者吸收或降解可注射组合物之组分的能力、被治疗之病症的性质、治疗部位、可注射组合物的组成、由原弹性蛋白形成的小球的浓度和特性，或者基本无颗粒结构的含原弹性蛋白之团的量和性质。
II.组合物和制剂
在某些实施方案中，提供了用于矫正组织缺陷的可注射组合物，所述组合物包含含有由原弹性蛋白形成的多个颗粒或小球的液相，所述液相中溶解有能有效减少小球聚结之量的聚结控制剂。
通常，由原弹性蛋白形成的小球的平均大小为0.1微米至100微米。小球可以球或微球形式来提供。优选的微球直径范围一般为约0.05μm至50μm，优选0.1μm至25μm。在某些实施方案中，小球基本上被聚结，从而提供了非颗粒外观的组合物。
包含在组合物中的原弹性蛋白的量为约1.5mg/mL至约400mg/mL。优选地，所包含的原弹性蛋白的量为约5mg/mL至约300mg/mL。更优选地，所包含的原弹性蛋白的量为约10mg/mL至约200mg/mL。
如本文所讨论地，每个小球均由原弹性蛋白形成，这意味着小球本身可以包含弹性蛋白、弹性材料或两者皆有。因此，小球可以由共价交联的原弹性蛋白或非交联的原弹性蛋白形成，或者由这两者形成。
所述可注射组合物通常具有更加颗粒化的外观，其中当原弹性蛋白的浓度为约50mg/mL及更低时，组合物具有分散的(或更典型地，部分凝集或聚结的)小球。不希望受理论的约束，认为颗粒化外观是由于原弹性蛋白浓度较低时小球聚结或凝集的水平降低所致。
在另一些实施方案中，提供了用于矫正组织缺陷的可注射组合物，所述组合物包含由原弹性蛋白形成的凝集小球和聚结控制剂(其量有效地减少小球的聚结)。
当原弹性蛋白的浓度为约50mg/mL以上时，可注射组合物通常具有程度较低的颗粒化外观。同样，不希望受理论的约束，认为原弹性蛋白浓度的增加导致小球聚结或凝集的增加，从而产生具有颗粒化或小球结构减少的可注射组合物。
本发明的组合物通常包含聚结控制剂，尤其是为含原弹性蛋白的物质提供流动特性的试剂。
聚结控制剂一般是生物相容性的，例如，它们可显示低毒性并且为非免疫原性的。聚结控制剂可以是合成的、半合成的或天然来源的分子。
在一个实施方案中，当溶于液相时聚结控制剂具有净负电荷。在另一个实施方案中，聚结控制剂包含当溶于液相时具有净负电荷的官能团。
在一个实施方案中，聚结控制剂包含强酸性官能团，例如羧酸、硫酸、磷酸等。在另一实施方案中，聚结控制剂包含羟基官能团。聚结控制剂可以是具有多个羟基官能团的多元醇。
在某些实施方案中，聚结控制剂是多糖。多糖为聚合糖结构，由通过糖苷键连接在一起的重复单元(通常为单糖或二糖)形成。这些结构通常为线性的，但是可以包含不同程度的分支。多糖常常是相当不均一的，含有重复单元的少量修饰。根据结构，这些大分子可具有与其寡糖构成嵌段(oligosaccharide building block)不同的性质。
优选地，多糖包含负电荷的官能团。在另一优选实施方案中，聚结控制剂是包含艾杜糖醛酸、葡糖醛酸或N-乙酰葡糖胺残基的多糖。合适的多糖包括例如：羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、透明质酸、黄原胶、瓜尔豆胶、β-葡聚糖、藻酸盐、羧甲基葡聚糖及其可药用盐。或者，多糖可以是果胶或其衍生物，包括线性或有分支的多糖。
在另一实施方案中，聚结控制剂为单糖或寡糖，例如3’-N-乙酰神经氨酰-N-乙酰氨基乳糖苷、3’-唾液酸基-N-乙酰氨基乳糖苷、3’-N-乙酰神经氨酰-3-岩藻糖基乳糖、6’-唾液酸基-N-乙酰氨基乳糖苷、N-乙酰葡糖胺、葡萄糖、乳糖、麦芽三糖醇、蔗糖、LS-四糖b及其可药用盐。另一些聚结控制剂包括糊精，如琥珀酰-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精，及其可药用盐。
多糖衍生物可包括但不限于交联或未交联的多糖，其通常具有包含一下一种或多种基团的取代基或额外侧链：氢；烷基；芳基；烷基芳基；芳基烷基；含有氧、氮、硫或磷原子的取代烷基芳基；含有氧、氮、硫、磷、卤素原子或金属离子的取代芳基烷基；含有氧、氮、硫、磷、卤素原子或金属离子的取代杂环基；并且其中所述取代基团可以直接彼此连接或者由选自以下的成员所分隔：醚、酮、氨基、氧代羰基、硫酸盐/酯、亚砜、甲酰胺、炔烃和烯烃；其中所述取代基或额外侧链的末端为包括但不限于以下的基团：氢、肽、醛、胺、芳基叠氮、酰肼、马来酰亚胺、硫氢基、活性酯、酯、羧酸盐/酯、亚氨酯、卤素或羟基。在一些实施方案中，多糖衍生物包括已使用化学交联剂交联的多糖，所述化学交联剂包括但不限于二乙烯砜(DVS)、1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、1，2，7，8-二环氧辛烷(DEO)或本领域技术人员通常已知的其它交联剂。
聚结控制剂可以是糖蛋白，如粘蛋白。
在另一实施方案中，所述聚结控制剂为氨基酸。优选地，所述氨基酸具有酸性侧链。合适的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸及其可药用盐。
在另一实施方案中，所述聚结控制剂为脂质或脂肪酸酯。合适的脂肪酸酯包括例如：磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱和甘油单油酸酯。所述脂肪酸酯可以与多种另外的试剂联用。例如，丙二醇和磷脂可以彼此联用。
在另一实施方案中，所述聚结控制剂为合成聚合物。此类聚合物包括例如：聚甲基丙烯酸脂、聚乙二醇和具有聚乙二醇亚单元的(嵌段)共聚物。例如，共聚物Poloxamer 188和Poloxamer 407可适于用作聚结控制剂。
在另一实施方案中，所述聚结控制剂为表面活性剂。合适的表面活性剂的实例包括月桂基硫酸钠和聚山梨酸酯。
优选的聚结控制剂包括泛醇、聚乙二醇、黄原胶、瓜尔豆胶、聚山梨酸酯80、N-乙酰葡糖胺及其可药用盐。尤其优选的聚结控制剂为羧甲基纤维素、透明质酸、黄原胶、羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素及其可药用盐。
通常，当聚结控制剂为多糖时，组合物中提供的该试剂量为约0.01(重量/体积)％至约10(重量/体积)％。优选地，当聚结控制剂为多糖时，所提供的该试剂的量为约0.5(重量/体积)％至约3.5(重量/体积)％。
当所述聚结控制剂为羧甲基纤维素或黄原胶时，可提供的该试剂的量为约0.01(重量/体积)％至10(重量/体积)％。在一个优选实施方案中，当聚结控制剂为羧甲基纤维素或黄原胶时，所提供的该试剂的量为0.5(重量/体积)％至3.5(重量/体积)％。
当所述聚结控制剂为透明质酸时，可提供的该试剂的量为约0.01(重量/体积)％至10(重量/体积)％。在一个优选实施方案中，当所述聚结控制剂为透明质酸时，所提供的该试剂的量为0.5(重量/体积)％至3.5(重量/体积)％。
当所述聚结控制剂为PEG时，可提供的该试剂的量为约10(重量/体积)％至约90(重量/体积)％。
应理解，所提供的聚结控制剂的有效量取决于多种因素，例如聚结控制剂的特性、组合物中其它组分的性质以及形成所述组合物所用的方法。尤其地，聚结控制剂的有效量将取决于组合物中原弹性蛋白的浓度。不希望受理论的约束，认为阻止聚结所需的聚结控制剂的量随着组合物中原弹性蛋白浓度的增加而增加。此外，聚结控制剂的性质会影响其控制聚结的能力。
因此，本发明提供了包含原弹性蛋白和多糖聚结控制剂的组合物，其中原弹性蛋白与多糖的质量比为约0.05∶1至3000∶1。优选地，原弹性蛋白与多糖的比为约0.1∶1至约500∶1。更优选地，原弹性蛋白与多糖的比为约0.2∶1至约100∶1。
在一些实施方案中，本发明提供了包含原弹性蛋白和羧甲基纤维素的组合物，其中原弹性蛋白与羧甲基纤维素的质量比为0.1∶1至约500∶1。在一些实施方案中，原弹性蛋白与羧甲基纤维素的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
在另一些实施方案中，本发明提供了包含原弹性蛋白和黄原胶的组合物，其中原弹性蛋白与黄原胶的质量比为0.1∶1至约500∶1。在一些实施方案中，原弹性蛋白与黄原胶的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
在另一些实施方案中，本发明提供了包含原弹性蛋白和透明质酸的组合物，其中原弹性蛋白与透明质酸的质量比为0.1∶1至约500∶1。在一些实施方案中，原弹性蛋白与透明质酸的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
在一个实施方案中，用于为含原弹性蛋白的物质提供流动特性的试剂不包括或不是PEG或DMSO。
在另一些实施方案中，本发明的组合物还可以包含液相。应理解，“液相”通常是指适于注射的生物可接受液体载体。通常，液相的溶剂是水。优选的液相包括水溶液，如磷酸盐缓冲液(PBS)。所述液相可以包含缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和另一些有机酸。在另一实施方案中，所述液相包含旨在改变所述液相之离子强度的至少一种试剂。
本发明的组合物可包含一种或多种另外的试剂活性组分(principle)或成分。所述另外的试剂可提供治疗效用，例如激活组织修复。或者，所述另外的试剂可以防止或限制不利的组织应答。此外，所述另外的试剂可以有助于可注射组合物的稳定性或持久性。在某些实施方案中，提供了另一些化合物作为稀释剂、运载体(carrier)、赋形剂等。
所述另外的试剂可存在于(溶解于或悬浮于)组合物的液相中。或者，所述另外的试剂可存在于组合物的小球中。
在一个实施方案中，所述组合物中可包含药剂，包括抗生素、生长促进剂、抗感染剂、杀菌剂、促血管生成化合物、抗癌剂、抗炎剂、蛋白酶抑制剂等。
在另一实施方案中，所述组合物中可包含生物因子，如组织因子、细胞因子、生长因子等。尤其优选的是参与伤口愈合、纤维化和肉芽形成的那些因子。
在另一实施方案中，所述组合物中可包含细胞，尤其是参与伤口愈合的细胞。实例包括上皮细胞、纤维细胞、成纤维细胞、角质形成细胞前体、角质形成细胞、肌成纤维细胞、巨噬细胞等。
所述组合物可采用多种方式包装，包括其中放置有适当形式之组合物的容器。本领域技术人员熟知合适的容器，包括诸如瓶(塑料的和玻璃的)、注射器、袋、安瓿瓶、塑料袋、金属圆筒等用具。所述容器还可以包含防干扰装置(tamper-proof assemblage)以防止轻易获取包装内含物。此外，还可以在容器上放置描述容器内含物的标签。该标签还可以包括适当的警示。
III.制造方法
在另一实施方案中，本发明提供了用于生产由原弹性蛋白形成的组合物的方法，其包括在具有溶于其中之聚结控制剂的液相中聚结或聚合原弹性蛋白的步骤。
所述方法的一个重要优点是由其生产的组合物无需另外操作或加工步骤即可用于注射。这是本发明的一个区别方面，因为本领域目前已知的许多可注射生物材料组合物都需要另外的加工步骤(例如，清洗以除去交联剂)才可用于注射。
所述方法的另一重要优点是通过该方法生产的组合物含有高的原弹性蛋白固含量同时仍保持了所述组合物的可注射特性。与本领域已知的其它含生物材料之组合物相比，这也是本发明的一个区别方面。
一般地，浓度大于约1.5mg/mL的原弹性蛋白溶液能形成具有期望完善性的可注射组合物，但是也可使用更低的浓度。在大多数应用中，所述溶液浓度低于约400mg/mL。因此，优选浓度为约1.5mg/mL至约400mg/mL的原弹性蛋白溶液。更优选地，使用浓度为约5mg/mL至约300mg/mL的原弹性蛋白溶液。最优选地，使用浓度为约10mg/mL至约200mg/mL的原弹性蛋白溶液。
可通过添加盐(包括任何离子化合物)或能影响溶液摩尔渗透压浓度的低分子量种类来控制液相的盐浓度。例如可以使用NaCl、KCl、MgSO4、Na2CO3或葡萄糖。优选的盐是NaCl。
当目的是形成由原弹性蛋白形成的、由弹性蛋白(或交联的原弹性蛋白)组成的组合物时，溶液温度可升至约37℃的生理范围，从而形成粘弹性相。可在该聚结步骤之前或添加交联剂(如戊二醛)，或者可在之后添加。
当目的是形成由原弹性蛋白形成的、包含弹性材料的组合物时，约pH 7.5或更高的pH值足以使溶液中的原弹性蛋白形成弹性材料。通常，将pH值保持为不超过约pH 13，因为高于该pH值不利于形成弹性材料。更优选地，约pH 9至pH 13的pH值是期望的。然而，最优选地，使用约pH 10至pH 11的pH值。可以使用的其它pH量度包括8.0、8.5、9.5、10、10.5和11.5。可在改变pH之前添加交联剂(如戊二醛)，或者可以在之后添加。
可以通过多种方法调节碱度，包括：1)向原弹性蛋白溶液直接添加提高pH的物质，2)将含有足够量之pH提高物质的溶液与原弹性蛋白溶液混合以使其呈碱性。pH提高物质可以是碱、缓冲剂、质子吸附剂材料。已发现可用于pH提高或控制物质的实例包括Tris碱、NH4OH和NaOH。
当pH为碱性并低于约9.5时，可能需要盐来形成本发明的弹性材料。当使用盐时，浓度一般高于25mM并且可高至200mM。优选地，盐浓度为约100mM至150mM。更优选地，盐浓度为约150mM。当pH降低(但仍保持碱性)至低于pH 10时，需要盐来形成弹性材料，并且所需的盐的量随着pH的降低而增加。例如，在约pH 9至10时需要盐，例如应向溶液提供相当于约60mM的盐浓度。在一些实施方案中，溶液具有的摩尔渗透压浓度相当于哺乳动物的等渗盐水(150mM)或更低。在另一些实施方案中，溶液具有的摩尔渗透压浓度高于150mM。盐浓液还可以为0mM。
可通过添加盐(包括任何离子化合物)、一价或二价离子或者能影响溶液摩尔渗透压浓度的低分子量种类来控制溶液的盐浓度。例如可以使用NaCl、KCl、MgSO4、Na2CO3或葡萄糖。优选的盐是NaCl。
任选地，可以在聚结期间搅拌液相。可通过机械手段搅拌液相，例如通过使用磁力搅拌装置、手动混合或置于轨道振荡器上。
可以在无菌条件下实施本发明方法以确保本方法生产的组合物适于体内使用。
在另一实施方案中，可将组合物的pH调整至生理可接受范围内的值。在另一实施方案中，将组合物的离子强度调整至生理可接受的范围内。
IV.装置和药盒
在某些实施方案中，可以以一次性或重复利用之装置的形式提供组合物，所述装置包含用于容纳所述组合物的容器。在一个实施方案中，所述装置是注射器。所述装置可以容纳0.1至10mL的组合物。更优选地，所述装置可以容纳0.5至5ml的组合物。装置中的组合物可以以直接使用的状态(例如以交联形式)或者以需要混合或添加另外成分(如交联剂，如果需要交联剂的话)的状态提供。
在另一些实施方案中，提供了用于上述实施方案之一的药盒，所述药盒包含：
-容纳本发明组合物的容器；
-具有使用说明的标签或说明书。
在某些实施方案中，除小球外，药盒还可包含一种或多种活性组分或成分。这些活性成分如上文所述。
药盒可包含容器以及在容器上或与容器一起的标签或说明书。合适的容器包括例如：瓶、小管、注射器、吸塑包装等。容器可以由多种材料形成，如玻璃或塑料。所述容器容纳组合物或其制剂，并且可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉内施用溶液袋或是具有可被皮下注射针穿透的塞的小管)。标签或说明书标示出组合物用于治疗所选病症，例如扩充组织。在一个实施方案中，标签和说明书包含使用说明，并标示出组合物可用于治疗由组织缺陷引起的失调或并发症。
所述药盒可包含(a)包含本发明组合物的第一容器和(b)其中含有活性组分或成分的第二容器。本发明该实施方案中的药盒还可包含说明书，其标示出所述组合物和其它活性组分可用于治疗疾病。作为替代地或另外地，所述药盒还可包含第二(或第三)容器，其含有可药用缓冲液，如注射用抑菌水(bacteriostatic water for injection，BWFI)、磷酸盐缓冲液、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可包含从商品和使用者角度所期望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针和注射器。
V.治疗方法
在某些实施方案中，提供了本发明组合物在制备用于矫正组织缺陷(特别是需要增大软组织或皮肤的缺陷)的制剂或假体中的用途。
在另一些实施方案中，提供了增大皮肤软组织的方法，该方法包括向需要这种治疗的个体施用有效量的本发明组合物。
适于用该方法治疗的个体可显示轻微的衰老症状，例如，眼和嘴周围的轻微皱纹、唇部的轻微皱纹和唇体积的轻微减小。或者，可以是明显的衰老迹象。例如，个体可显示更明显的衰老迹象，具有深的皱纹和鼻唇沟的加深。另外，可以有面部结构(如颧骨脂肪垫)的萎缩和下陷。此外，个体可期望在尚无任何衰老迹象的情况下改善他们的外观，例如个体可期望增加他们的唇体积。在某些实施方案中，所述组合物可通过真皮内、皮内和/或皮下注射。组合物的注射提供了扩充或填充效果，减少了外观的皱纹或褶皱，或者提供美观功效。
可施用所述组合物的其它组织缺陷包括例如由皮肤病(如痤疮、病毒性腮腺炎、鸡痘或麻疹)导致的皮肤疤痕、外伤(损伤或烧伤)或外科手术导致的疤痕。
可施用所述组合物的其它组织缺陷还包括整个组织缺失或萎缩，例如作为逆转录病毒治疗之副作用的HIV患者面部的脂肪萎缩。
在一个实施方案中，提供了本发明组合物用于治疗与括约肌机能不全相关的病症的用途。适于该治疗的个体可患有如下病症或疾病：例如先天括约肌缺陷、尿失禁、胃肠道回流病或膀胱输尿管回流。此外，适于此类治疗的个体可患有大便失禁。
通常，通过注射向组织缺陷部位施用组合物，然而，根据组织缺陷的性质，其它施用途径可能是合适的。当通过注射施用组合物时，可使用一定范围规格的针。所用规格取决于含原弹性蛋白的材料的性质(例如，其粘度)和缺陷的性质(例如，注射部位的深度)等。例如，当要将组合物用于增大组织时，针的规格一般在约16号至31号的范围内。通常，对于皮肤填充物来说，针的规格在约25号至31号的范围内。对于细小皱纹的浅表真皮注射来说，可采用例如规格在27～31号范围内的针，而对于真皮下的深部注射来说，需要使用例如25号或27号的较大规格的针。对于失禁应用来说，针的规格一般在约16号至约21号之间。
可针对多种治疗施用所述组合物，以矫正组织缺陷和/或实现或维持期望的结果。
应理解，在本说明书中公开并限定的发明可扩展至文字或附图中提及或显见的两个或更多个单独特征的所有替代性组合。所有这些不同的组合构成了本发明的多个替代性方面。
实施例
以下实施例旨在说明而非限制本发明。
实施例1：使用碱性聚合法，在低原弹性蛋白浓度下生产由原弹性蛋白形成的小球
材料和方法
将20mg原弹性蛋白溶于10mL的磷酸盐缓冲液(PBS)中，于4℃过夜(估计16小时)，从而提供终浓度为2mg/ml的原弹性蛋白。在整个过程中将溶液置于冰上，测量溶液的初始pH(pH 7.2)，加入39μL的1M NaOH将溶液的pH值调整为10.7。然后，将所得溶液在15mL管中于37℃孵育4小时，而后将其从孵箱中取出并置于室温下。
结果
所得到的微颗粒倾向于覆盖于管壁上。溶液样品的SEM图(图1A)显示，存在的微颗粒的估计直径为1μm。由于弹性材料的“粘性”特征，球倾向于凝集在一起。
实施例2：在不存在聚结控制剂的情况下，浓度为10mg/ml的原弹性蛋白的碱性聚合
材料和方法
将50mg原弹性蛋白溶于4.9mL PBS中，于4℃过夜(估计16小时)。在整个过程中将溶液置于冰上，测量溶液的初始pH(pH 7.22)，加入47μL的1M NaOH将溶液pH值调整为10.7。加入另外的53μL PBS，使原弹性蛋白溶液的终浓度为10mg/mL。然后，将溶液在5mL平底管中于37℃孵育过夜(16小时)，而后将其从孵箱中取出并置于室温下。
结果
从图1B中可见，所得到的材料是保持其制备管形状的固体弹性材料。从所得固体中分离出多于4.5mL的液体，这表明50mg原弹性蛋白中的大部分(＞40mg)存在于所得构建体中的约0.5mL液体中。换言之，由于在无聚结控制剂的情况下原弹性蛋白在该浓度下的致密凝集，原弹性蛋白与起始材料(10mg/mL)相比在固体中明显地浓度更高。
实施例3：使用化学交联，在作为聚结控制剂的CMC存在下生产小球
材料和方法
通过将300mg原弹性蛋白溶于1.5mL PBS中于4℃过夜得到200mg/mL的原弹性蛋白贮液。通过将2g CMC溶于100mL PBS中并在室温下搅拌过夜得到2％(重量/体积)的高粘度羧甲基纤维素(CMC；Sigma货号C5013)贮液。
在整个过程中将溶液置于冰上，将250μL原弹性蛋白贮液与200μLPBS和500μL的2％(重量/体积)CMC混合。在冰上开启新的25％(体积/体积)戊二醛(GA)溶液管，将2μL的25％(体积/体积)GA与48μL PBS混合，而后立即加入原弹性蛋白溶液中。将所得的50mg/mL原弹性蛋白、1％(重量/体积)CMC、0.05％(体积/体积)GA的混合物用冷却的吸管头搅拌(通过在-20℃放置过夜来预冷吸管头)，而后在5mL平底管中于37℃下孵育24小时。
结果
在孵育3小时后所得到的材料呈粉色且粘稠，并且在24小时孵育期间的剩余阶段后仍保持该性状。该材料可通过29号针，而后通过31号针，并在通过针后表现出更低的粘度。该材料样品的SEM图显示直径范围为约0.5～1μm的小球的均一混合物(图2)。在该制剂中，小球之间的聚结水平明显很低。
实施例4：使用化学交联，在作为聚结控制剂的HA存在下生产小球
材料和方法
原弹性蛋白贮液
向200mg冻干原弹性蛋白中加入H2O(1mL)+PBS(0.5ml)，并置于2～8℃下用以溶解，所得浓度(通过测量280nm下H2O中1/250稀释物的UV吸光度来确定)为150mg/ml。使用0.3125mL/mg.cm的消光系数来确定浓度。
透明质酸(HA)贮液
通过向1g HA添加高压灭菌的PBS而用PBS制备2％的HA溶液(终体积50mL)，并用磁力搅拌器搅拌。将样品储存在2～8℃。
戊二醛贮液
通过向48μL PBS中添加2μL的25％GA并在Eppendorf管中混合来制备1％的戊二醛溶液。所有吸头均在使用前冷却至＜10℃。
测试样品制备和组成
将所有组分置于冰上备用。使用吸管在置于冰上的5ml管中混合所需量的HA、PBS和原弹性蛋白贮液。将所得的组合物用磁力搅拌器在2～8℃混合2分钟，并用离心机短暂离心以除去所有气泡。添加戊二醛，将所得组合物用磁力搅拌器在2～8℃再混合2分钟。除去搅拌棒；用离心机短暂离心样品以除去所有气泡，然后在37℃孵育16小时。最终组合物：50mg/ml原弹性蛋白、1％HA、0.05％戊二醛。
结果
所得材料显示为粉色粘稠凝胶。该材料可直接通过31号针，并且在通过针之后外观未发生改变。该材料样品的SEM图(图3)显示直径约为1μm的小球的均一混合物。小球之间有明显的清晰连接。从31号针挤出并且用过量水或PBS清洗后的材料的SEM分析显示材料的结构未发生改变。
实施例5：在使用碱催化由原弹性蛋白形成小球时，针对聚结控制剂调整原弹性蛋白浓度的效果
材料和方法
通过将300mg原弹性蛋白溶于1.5mL PBS中并在4℃过夜得到200mg/mL原弹性蛋白贮液。通过将100mg HA溶于5mL PBS中并在4℃过夜得到2％(重量/体积)透明质酸(来自人脐带的HA钠盐；Sigma货号H1876)贮液。
为了得到针对HA浓度的原弹性蛋白不同浓度的测定，通过在冰上混合适当的溶液来制备以下样品：
样品A：50μL原弹性蛋白溶液+450μL PBS+500μL HA溶液。通过添加4μL的1M NaOH将初始pH 6.8调整至pH 10.7。所得到的最终溶液为10mg/mL原弹性蛋白，1％(重量/体积)HA。
样品B：125μL原弹性蛋白溶液+375μL PBS+500μL HA溶液。通过添加7μL的1M NaOH将初始pH 6.8调整至pH 10.3。所得到的最终溶液为25mg/mL原弹性蛋白，1％(重量/体积)HA。
样品C：250μL原弹性蛋白溶液+250μL PBS+500μL HA溶液。通过添加10.5μL的1M NaOH将初始pH 6.8调整至pH 10.4。所得到的最终溶液为50mg/mL原弹性蛋白，1％(重量/体积)HA。
样品D：375μL原弹性蛋白溶液+125μL PBS+500μL HA溶液。通过添加16μL的1M NaOH将初始pH 6调整至pH 10.3。所得到的最终溶液为75mg/mL原弹性蛋白，1％(重量/体积)HA。
然后，将所有样品在5ml平底管中于37℃孵育过夜(16小时)。
结果
样品A：10mg/mL原弹性蛋白，1％(重量/体积)HA，pH 10.7
所产生的材料为均一的白色液体，其可以在通过18号、21号、25号和30号针依次挤出后通过30号针。所得溶液的SEM图(图4A)显示了由原弹性蛋白形成的直径范围约1～4μm的聚结小球的相对均一混合物。
样品B：25mg/mL原弹性蛋白，1％(重量/体积)HA，pH 10.3
所产生的材料为管底部形成的白色浓稠糊状物，并被白色液体所覆盖。该糊状物可混合入剩余的溶液中；然而，该溶液相当不均一并阻塞29号针，可能该材料能被挤出通过更大规格的针(如18号)[注意：仅尝试了直接进入所确定之29号针的挤出，此处没有尝试依次挤出方法]。混合后所得溶液的SEM图(图4B)表明存在直径范围约1～4μm的聚结小球。
样品C：50mg/mL原弹性蛋白，1％(重量/体积)HA，pH 10.4
所产生的材料为管底部形成的白色浓稠糊状物/固体。该糊状物可以部分地混合入上层液体中，然而这样得到的是含有大块固体材料的不均一混悬液。其不能通过29号针，但是可能该材料能被挤出通过更大规格的针(如18号)[注意：仅尝试了直接进入所确定之29号针的挤出，此处没有尝试依次挤出方法]。混合后所得溶液的SEM图(图4C)表明存在直径范围约1～10μm的聚结小球。
样品D：75mg/mL原弹性蛋白，1％(重量/体积)HA，pH 10.3
所产生的材料为管底部形成的白色浓稠糊状物/固体。该糊状物可以部分地混合入上层液体中，然而这样得到的是含有大块固体材料的不均一混悬液。其不能通过29号针，但是可能该材料能被挤出通过更大规格的针(如18号)[注意：仅尝试了直接进入所确定之29号针的挤出，此处没有尝试依次挤出方法]。混合后所得溶液的SEM图(图4D)表明存在直径范围约0.5～20μm的聚结小球。
利用上述SEM图，图5中显示了小球直径的大小分布。随着原弹性蛋白浓度的升高，小球的大小和聚结水平增加。
实施例6：在存在聚结控制剂的情况下搅拌对小球形成的作用
材料和方法
通过将100mg原弹性蛋白溶于450μL PBS中并在4℃过夜得到222mg/mL原弹性蛋白溶液。通过将2g CMC溶于100mL PBS中并在室温下搅拌过夜得到2％(重量/体积)高粘度羧甲基纤维素(CMC；Sigma货号C5013)的贮液。
在整个过程中将溶液置于冰上，将450μL原弹性蛋白溶液与500μL的2％(重量/体积)CMC混合。在冰上开启新的25％(体积/体积)戊二醛溶液管，将2μL的25％(体积/体积)GA与48μL PBS混合，而后立即加入原弹性蛋白溶液中。将所得的100mg/mL原弹性蛋白、1％(重量/体积)CMC、0.05％(体积/体积)GA的混合物用冷却的吸管头搅拌(通过在-20℃放置过夜来预冷吸管头)。将混合物放置在37℃孵箱中并用磁力搅拌器搅拌4小时。然后，溶液在无搅拌的情况下冷藏过夜(16小时)。
结果
在37℃孵育最初4小时后，所产生的材料为粉色、不透明和粘稠的。冷藏后材料变得略微半透明(但仍为粉色且粘稠的)；然而，当温热至室温后，其再次迅速地变为不透明的。该材料可以通过31号针。在通过针后溶液仍不发生变化。
在SEM下观察时，样品(图6A和6B)显示不同大小的聚结小球。
实施例7：使用碱性聚合法，在聚结控制剂的存在下生产小球
材料和方法
在冰上将450μL原弹性蛋白(222mg/ml)加入500μL的2％CMC中。在充分混合后，用19μL的1M NaOH将溶液pH从7.1调节到10.2，然后加入31μL PBS，其间样品始终置于冰上。然后，将样品在37℃孵育4小时并搅拌，而后在4℃储存。对于中性样品，用11μL的1M HCl在室温下将pH从9.7调节至7.4。所得溶液包含100mg/mL原弹性蛋白，1％(重量/体积)CMC。
结果
所得的材料为白色均一液体，其可以通过26号～29号的针。碱性溶液(图7A和7B)和经中和的碱性溶液(图7C和7D)的SEM图显示包含聚结小球的材料。两种材料在4℃均为半透明的浅棕粘稠液体，温热后变成不透明的白色/棕色粘稠液体。
实施例8：在聚结控制剂的存在下由原弹性蛋白形成的微颗粒的稳定性
将实施例4A和实施例6得到的样品于4℃保存超过60天。在超过60天后，材料仍适于注射，并且通过SEM判断其外观未发生改变。
实施例9：包含交联的原弹性蛋白和黄原胶(XG)的可注射材料的形成
材料和方法
在冰上将450μL原弹性蛋白(222mg/ml)加入到500μL的3％XG中并充分混合。在冰上开启新的25％(体积/体积)戊二醛溶液管，将2μL的25％(体积/体积)GA与48μL PBS混合，而后立即加入原弹性蛋白溶液中。然后，将样品在37℃孵育4小时并搅拌，而后在4℃储存。所得的混合物包含100mg/mL原弹性蛋白，1.5％(重量/体积)XG、0.05％(体积/体积)GA。
结果
所产生的材料在4℃为半透明的粉色粘稠凝胶，温热后变成不透明的粉色凝胶。SEM成像(图8A和8B)显示该材料包含粘连物。所述材料能够通过31号针。在通过针后溶液不发生改变。
实施例10：含有交联原弹性蛋白和HPC的、用于通过宽内径针或插管递送的材料的形成
材料和方法
在冰上将450μL原弹性蛋白(222mg/ml)加入到500μL的4％羟丙基纤维素(HPC)中并充分混合。在冰上开启新的25％(体积/体积)戊二醛溶液管，将2μL的25％(体积/体积)GA与48μL PBS混合，而后立即加入原弹性蛋白溶液中。然后，将样品在37℃孵育4小时并搅拌，而后在4℃储存。所得的混合物包含100mg/mL原弹性蛋白、2％(重量/体积)HPC、0.05％(体积/体积)GA。
结果
得到了淡粉色、软的大块材料(图9A)。SEM成像(图9B)显示所述材料是纤维状的并具有一些粘连迹象。所述材料可通过注射器的2mm内径。
实施例11：用于通过小规格针递送的制剂的优化
进行了优化研究，以确定用于原弹性蛋白制剂的原弹性蛋白∶聚结控制剂之质量比的可能限制，所述制剂适于通过29号～31号规格范围的针注射。下表中粗体显示的样品不能通过29/31号针。
Figure BPA00001431364900221
aAlk或CL：碱性聚合(Alk)或交联(CL)
b混合：在聚结时是否对混合物搅拌？
cHA：透明质酸
dCMC(med vis)：羧甲基纤维素(中等粘度)
eCMC(high vis)：羧甲基纤维素(高粘度)
fXG：黄原胶
实施例12：可注射组合物在组织增大中的使用方法
描述
组合物为在pH＝7时在1％纤维素衍生物溶液的存在下与戊二醛化学交联的合成人原弹性蛋白(由细菌物种大肠杆菌产生)产生的凝胶，其中原弹性蛋白终浓度为100mg/mL。
适应症
所述组合物适于矫正中度至严重的面部皱纹和褶皱(如鼻唇沟)的中度至深度皮肤植入。
提供方式
组合物在带有31号×1/2”针的一次性注射器中提供。
治疗方法
1.必须与患者协商并且告知他们治疗的适应症、禁忌症、警示、注意事项、治疗应答、不良反应和施用方法。应在治疗前全面了解患者的病史。
2.评估患者所需的疼痛管理。
3.用酒精或其它合适的杀菌溶液清洁待治疗的区域。
4.在注射前，推压柱塞杆以使针尖可见少量的组合物。
5.组合物应用细规格的针(31号×1/2”)施用。针的插入角度约与平行于皱纹或褶皱长度的方向呈约30°。考虑到倾斜角的角度和取向、注射的深度以及所施用的量，注射技术可以有所不同。
如果组合物注射得过深或注射到肌内，则作用的持续时间将变短。
6.注射组合物，对柱塞杆施加均匀的推力同时缓慢向后拉动针。在注射结束时皱纹应被填平和消除。重要的是，在针马上要被拉出皮肤时停止注射，以防止材料漏出或者在皮肤中的位置过于表面。
7.注射结束时，应轻柔地按摩治疗部位，使其与周围组织的形状相协调。
8.对于每次治疗通常每个治疗部位使用1ml。
正确的注射技术对于最终的治疗结果很关键。

Claims (43)

1.由原弹性蛋白形成的可注射组合物，所述组合物包含含原弹性蛋白的物质，其中所述物质还包含多糖或多糖衍生物形式的试剂，所述试剂的量有效地为所述物资提供使所述组合物能用于注射的流动特性。
2.权利要求1的组合物，其中所述物资采用非颗粒状的团的形式。
3.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述试剂是透明质酸、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和黄原胶中的一种或多种。
4.权利要求3的组合物，其中所述试剂是透明质酸，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
5.权利要求3的组合物，其中所述试剂是羧甲基纤维素，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
6.权利要求3的组合物，其中所述试剂是黄原胶，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
7.权利要求3的组合物，其中所述试剂是羟丙基纤维素，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
8.权利要求3的组合物，其中所述试剂是羟丙基甲基纤维素，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
9.权利要求1的组合物，其中所述物质采用颗粒状的团的形式。
10.权利要求9的组合物，其中所述试剂是透明质酸、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和黄原胶中的一种或多种。
11.权利要求10的组合物，其中所述试剂是透明质酸，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
12.权利要求10的组合物，其中所述试剂是羧甲基纤维素，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
13.权利要求10的组合物，其中所述试剂是黄原胶，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
14.权利要求10的组合物，其中所述试剂是羟丙基纤维素，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
15.权利要求10的组合物，其中所述试剂是羟丙基甲基纤维素，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
16.权利要求1的组合物，其中所述物质采用小球的形式。
17.权利要求16的组合物，其中所述试剂是透明质酸、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和黄原胶中的一种或多种。
18.权利要求16的组合物，其中所述试剂是透明质酸，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
19.权利要求16的组合物，其中所述试剂是羧甲基纤维素，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
20.权利要求16的组合物，其中所述试剂是黄原胶，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
21.权利要求16的组合物，其中所述试剂是羟丙基纤维素，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
22.权利要求16的组合物，其中所述试剂是羟丙基甲基纤维素，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
23.用于生产由原弹性蛋白形成的小球的方法，其包括在液相中聚结原弹性蛋白的步骤，所述液相具有溶于其中的多糖或多糖衍生物形式的聚结控制剂。
24.权利要求23的方法，其中所述液相的pH为7至13。
25.权利要求23的方法，其中所述液相的温度为约37℃。
26.权利要求23的方法，其中所述液相还包含盐。
27.权利要求23的方法，其中所述液相还包含用于使聚结的原弹性蛋白交联的交联剂。
28.权利要求27的方法，其中在聚结后将所述交联剂添加到所述液相中。
29.权利要求23的方法，其包括在聚结过程中搅拌所述液相。
30.权利要求23的方法，其包括将所聚结的原弹性蛋白通过小规格的针挤出从而使在所述液相中形成的小球分散。
31.用于生产由原弹性蛋白形成的小球的方法，其包括在液相中加热原弹性蛋白以形成由弹性材料形成之小球的步骤，所述液相具有碱性pH并具有溶于其中的多糖或多糖衍生物形式的聚结控制剂。
32.权利要求31的方法，其中所述液相还包含盐。
33.权利要求31的方法，其还包括用交联剂使所述弹性材料交联。
34.用于改变或矫正组织缺陷的可注射组合物，所述组合物包含含有多个由原弹性蛋白形成之小球的液相，所述液相具有溶于其中的多糖或多糖衍生物形式的聚结控制剂，所述聚结控制剂的量有效地减少所述小球的聚结。
35.权利要求34的组合物，其中所述试剂是透明质酸、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和黄原胶中的一种或多种。
36.权利要求35的组合物，其中所述试剂是透明质酸，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
37.权利要求35的组合物，其中所述试剂是羧甲基纤维素，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
38.权利要求35的组合物，其中所述试剂是黄原胶，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
39.权利要求35的组合物，其中所述试剂是羟丙基纤维素，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
40.权利要35的组合物，其中所述试剂是羟丙基甲基纤维素，并且原弹性蛋白与试剂的质量比为约0.2∶1至约100∶1。
41.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述物质由非交联原弹性蛋白形成。
42.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述原弹性蛋白为原弹性蛋白的片段。
43.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述小球为微球形式。
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