CN111886052B - 含永久花精油和永久花蒸馏残留物的油性提取物的化妆品组合物 - Google Patents

含永久花精油和永久花蒸馏残留物的油性提取物的化妆品组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种化妆品组合物，所述化妆品组合物包含永久花精油和永久花蒸馏残留物的油性提取物，以及涉及所述组合物用于护肤的用途，尤其是对抗皮肤的衰老迹象和/或皮肤干燥的用途。

Description

含永久花精油和永久花蒸馏残留物的油性提取物的化妆品组 合物
技术领域
本发明涉及一种化妆品组合物，所述化妆品组合物包含永久花精油和永久花蒸馏残留物的油性提取物，以及所述组合物对于护肤的使用，尤其是对于对抗皮肤上的衰老迹象。
背景技术
目前，男性和女性倾向于希望尽可能长时间看上去年轻并因此寻求淡化皮肤衰老的痕迹，所述衰老尤其导致皱纹和细纹。
皮肤由两部分组成，一部分是浅层的表皮，且另一部分是更深的真皮，两者相互作用。天然的人类表皮主要由三种细胞构成：非常占优势的角质形成细胞、黑色素细胞和朗格汉斯细胞。这些细胞类型的每一种和它们特定的功能都对皮肤在身体中的必需作用有贡献，尤其是保护身体免受外界攻击的作用，名为“屏障功能”。
所述表皮照惯例分为组成表皮生发层的角质形成细胞的基底层、由位于生发层上的几层多面形细胞组成的“棘”层、一至三层由含有明显胞质内含物的扁平细胞组成的“颗粒”层、透明角质颗粒和最后由处于分化末期并被称为角质细胞的角质形成细胞层的集合组成的角质层。在表皮内，不断产生新的角质形成细胞以补充角质层内持续失去的表皮细胞。皮肤稳态，尤其是表皮稳态，是精细调控皮肤细胞增殖和分化过程之间平衡的结果。这些增殖和分化过程被完美地调控：它们参与皮肤的更新和/或再生并导致皮肤恒定厚度的维持，且尤其是表皮的恒定厚度。皮肤稳态也参与皮肤机械性能的维持。
然而，表皮更新的速度和质量不断由于皮肤所受的物理和化学攻击以及由于衰老而改变。
因此，所述角质形成细胞的细胞活力可能降低，尤其是在衰老的情况下或由于氧化应激(例如太阳辐射，即UV、可见、远红、蓝光辐射)、由于来自毒素或微生物代谢产物的攻击，或更通常地，在随时间的衰老中。特别地，表皮的再生潜力变得不那么显著，也就是说基底层的细胞分裂不那么活跃，导致表皮更新的变慢和/或减少，所述表皮更新不再能够弥补在表面消除的细胞损失。这导致了表皮的萎缩和/或皮肤厚度的减少。表皮稳态的缺陷也导致暗淡或外观不佳的肤色。也观察到屏障功能的缺陷，其通过基于位置的不同迹象自我呈现：皮肤干燥、过度角化、薄表皮、薄嘴唇、浅层皱纹。
随着年龄观察到的皮肤屏障的缺陷还与表皮内细胞内聚力的松弛有关，其导致表皮的弱化和脱水。参与角质形成细胞分化和粘附的蛋白的表达增加促进皮肤屏障的形成和密封，这也使得在另一方面维持皮肤的水合以及在另一方面保护皮肤免受外界攻击和对抗其衰老成为可能。这样的基因尤其是编码谷氨酰胺转氨酶1(TGM1)的基因，所述酶是一种能够催化角质包膜前体和细胞膜之间的结合的酶，且其在表皮分化中起重要作用。
因此，应理解如下化妆品组合物的优势，即所述化妆品组合物使得有可能增加表皮分化而基本上不影响基底细胞池，以延迟皮肤上衰老迹象的发生或减慢它们的进程，并且还防止或治疗皮肤干燥。
申请人已经提出，与永久花的水性提取物和油性提取物结合使用富含萜烯化合物的永久花精油，以巩固屏障功能(WO 2012/153064)。所述永久花的油性提取物通过例如微波提取获得，并且其特征为含有至少99重量％的脂肪酸和0.2重量％至0.5重量％的植物固醇。
就文件FR2819718的部分而言，文件FR2819718描述了一种植物的脂提取物，尤其是永久花的脂提取物，所述脂提取物在由植物来源的甘油三酯(辛酸/癸酸甘油三酯)构成的溶剂存在下通过用超临界CO2提取获得。在清除溶剂并添加蜡质化合物后，已证明此脂提取物如视黄酸一样作用于细胞分化，增加编码细胞蛋白结合视黄酸的并且也编码内皮生长因子(VEGF)的基因CRABP-II的表达，同时此提取物刺激角质形成细胞的分裂(增殖)。在另一方面，应强调此脂提取物抑制(-61％)编码通常在表皮分化中表达的蛋白例如谷氨酰胺转氨酶1(TGM1)的基因的表达。
发明内容
在此背景下，申请人完全令人吃惊地证明了，当永久花精油与永久花油性提取物(特别是从永久花蒸馏残留物获得的)组合时，以协同方式刺激调控表皮分化的基因，尤其是增加编码TGM1蛋白的基因的表达。
更特别地，申请人证明，永久花蒸馏残留物的油性提取物和永久花精油的组合导致由谷氨酰胺转氨酶1、细胞角蛋白10、外膜蛋白、丝聚合蛋白、组织蛋白酶L2和兜甲蛋白组成的分化标记物表达的协同增加。因此，在申请人看来，上述组合物使得有可能配制一种有效对抗皮肤上衰老迹象和/或皮肤干燥的化妆品组合物。
在此背景下，本发明的主题是一种包含永久花精油和永久花蒸馏残留物的油性提取物的化妆品组合物，所述永久花蒸馏残留物的油性提取物包含：固醇；饱和或不饱和的直链C7-C10羧酸，包括2-(Z)-癸烯酸和4-(Z)-癸烯酸；苯甲酸；以及饱和或不饱和的直链C8-C18脂肪酸的乙酯。
本发明的主题也为上述组合物的非治疗用途，用于延迟皮肤衰老迹象的开始、减慢皮肤衰老迹象的进程或降低皮肤衰老迹象的强度，所述衰老迹象特别是皱纹、皮肤下垂、皮肤柔韧性和/或弹性的丧失、皮肤变薄、皮肤粗糙和/或肤色失去光泽；或用于预防或治疗皮肤干燥。
本发明的主题也为一种化妆方法，所述方法包括将上述组合物局部施用至皮肤上，用于延迟皮肤衰老迹象的开始、减慢皮肤衰老迹象的进程或降低皮肤衰老迹象的强度，所述衰老迹象特别是皱纹、皮肤下垂、皮肤柔韧性和/或弹性的丧失、皮肤变薄、皮肤粗糙和/或肤色失去光泽，或用于预防或治疗皮肤干燥。
发明详述
本发明使用永久花精油和永久花蒸馏残留物的油性提取物。
在能够单独被用于制备精油和蒸馏残留物的油性提取物的永久花物种中，将提及所有属于蜡菊(Helichrysum)属的那些，尤其是名为咖喱草的意大利蜡菊(Helichrysumitallicum)(或白叶蜡菊Helichrysum angustifolium D.C)、名为沙地永久花的沙生蜡菊(Helichrysum arenarium)和法国蜡菊(Helichrysum stoechas)或常见的永久花，此清单并不是限制性的。优先使用意大利蜡菊的精油，无论是何亚种。
在本说明书中，术语“精油”意指存在于永久花任何部分或整株植物(且更特别地其地上部分，例如比如其花和花头)的挥发性有机化合物的水蒸馏或蒸汽蒸馏的产物。在这些方法中，包含于植物中的气味分子被释放，并被机械地夹带在蒸汽中，所述蒸汽通过被添加了植物的水的沸腾而形成(传统水蒸馏)，或通过将被包含在植物中的水沸腾而形成(微波水蒸馏，任选地在真空下)，或者通过锅炉提供并循环通过植物(蒸汽蒸馏)。所述馏出物随后被倾析以从纯露(花水)分离将根据本发明使用的精油。可回收并处理构成蒸馏残留物的固体残留物以制备也用于本发明的永久花蒸馏残留物的油性提取物。
相对于本发明的组合物的总重量，所述永久花精油有利地占0.001重量％至5重量％且优选地占0.001重量％至1重量％。
在此组合物中，结合了永久花蒸馏残留物的油性提取物。术语“蒸馏残留物”意指在水蒸馏或蒸汽蒸馏永久花的任何部分并分离精油和所产生的纯露后的剩余的固体残留。所述蒸馏残留物的油性提取物可通过任何提取油的方法获得，且更特别通过使用超临界液体提取蒸馏残留物获得，所述超临界液体例如二氧化碳、一氧化氮、二甲醚、丙烷、乙烯或甲醇，此清单并不是限制性的。优选地使用处在超临界态的二氧化碳。本领域技术人员会知道如何调整作为所需提取速率和产出的函数的提取参数，尤其是温度、压力和流体的流速。例如，用超临界CO2的提取可在250至300巴的压力和从40至80℃，优选地从50至70℃的温度下进行。提取后，超临界液体通过减压返回气态并通常被再利用。有利地，如此获得的所述植物提取物随后在例如从180至250℃，优选地从200至220℃的温度经过分子蒸馏步骤，以浓缩存在于提取物中的不可皂化的化合物。在此分子蒸馏步骤之前，所述植物提取物可以任选地在油溶剂中稀释，尤其是基于植物油例如葵花油的溶剂。此油性溶剂在分子蒸馏步骤中被清除。从而获得馏出物，所述馏出物包含尤其是30重量％至50重量％，更特别地35重量％至45重量％的不可皂化的化合物和1重量％至10重量％，更特别地3重量％至7重量％的基本上是β-谷固醇的固醇。
所述使用超临界液体获得的提取物或自分子蒸馏步骤得到的馏出物可以任选地在溶剂中，以1重量％至10重量％、例如尤其以3重量％至5重量％的浓度被稀释，以便于其处理。所有可用于化妆品的油性溶剂都可用于此目的，尤其是脂肪酸甘油三酯，例如辛酸/癸酸甘油三酯。
申请人通过与质谱偶联的气相色谱来表征所述永久花蒸馏残留物的油性提取物。由此，已证明所述的根据本发明使用的永久花蒸馏残留物的油性提取物，在其组成方面，不同于通过超临界CO2从永久花花头获得的提取物，因为它基本上不包含(也就是说，包含少于10重量％，或甚至少于5重量％或甚至少于2重量％)，或甚至绝对不包含棕榈烯酸、芳樟醇、2-癸烯醛、2-十三酮、十七烷、8-十七烯、异丁酸、异戊酸、十六烯醇、月桂酸、十五酸、癸酸和异硬脂酸。相反，根据本发明使用的永久花蒸馏残留物的油性提取物包含在通过超临界CO2从永久花花头获得的提取物中未被鉴定出的组分，即2-(Z)-癸烯酸甲酯和4-(Z)-癸烯酸甲酯。此外，与永久花精油相比，根据本发明使用的永久花蒸馏残留物的油性提取物包含基本上是β-谷固醇的固醇、饱和或不饱和直链C7-C10羧酸(尤其是庚酸、辛烯酸和癸烯酸)的甲酯、苯甲酸的甲酯、以及饱和或不饱和直链C8-C18脂肪酸(尤其是辛酸、癸酸和亚油酸)的乙酯。
这样的提取物尤其以INCI名称HELICHRYSUM ITALICUM FLOWER STEM EXTRACT(意大利蜡菊花茎提取物)被鉴别。
相对于本发明组合物的总重量，所述永久花蒸馏残留物的油性提取物有利地占0.001重量％至5重量％，优选占0.001重量％至1重量％。
如下述实施例所呈现的，已证明本发明的植物提取物的组合使得有可能协同地激活参与表皮分化调控的基因的表达。
在此说明书的背景下，术语“协同”意指通过使用根据本发明的提取物组合获得的效果显著大于使用两种提取物中的任一种获得的效果，且任选地大于由每种提取物产生的效果的总和。
上述组合被包括于一种化妆品组合物中，所述化妆品组合物包含生理学可接受的介质，尤其是化妆上可接受的介质，也就是说一种不产生不适应于化妆品使用的刺痛或发红的介质。此介质优选地包含水相和脂肪相(通常包含所述永久花精油和所述永久花的蒸馏残留物的油性提取物)。所述组合物优选地为“水包油”或“油包水”乳液的形式，或为“水包油”分散体的形式。
所述水相包含水和任选地至少一种选自多元醇和水性胶凝剂的组分。水有利地占所述组合物总重量的从40％至80％，例如从50％至70％。所述多元醇尤其可选自甘油、丙二醇、丁二醇、戊二醇及其混合物且可以占所述组合物总重量的从5％至30％，优选地从15％至25％。
术语“水性胶凝剂”指能够通过水合固定水分子并因此增加水相粘度的一种聚合化合物。这样的胶凝剂可选自：聚糖，例如纤维素及其衍生物、改性淀粉、卡拉胶、琼脂、黄原胶和例如瓜尔胶或刺槐豆胶的植物胶。合成聚合物且尤其是任选地交联的丙烯酸钠均聚物，以及丙烯酸共聚物，尤其是丙烯酸钠和/或烷基(甲基)丙烯酸酯和/或羟烷基(甲基)丙烯酸酯和/或(聚乙氧基)烷基(甲基)丙烯酸酯，任选地与至少一种其他单体、有利地为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)的共聚物，这些共聚物任选地被交联；或其混合物。
就其部分而言，所述脂肪相包含一种或多种挥发性的和/或非挥发性的油。挥发性油的实施例为例如异十二烷的支链C10-C13烷烃，和直链C10-C13烷烃。作为非挥发性油尤其可提及以下这些：
-酸和一元醇的酯，所述酯选自饱和直链C2-C10(优选地C6-C10)酸和饱和直链C10-C18(优选地C10-C14)一元醇的单酯和聚酯、饱和直链C10-C20酸和支链或不饱和C3-C20(优选地C3-C10)一元醇的单酯和聚酯；支链或不饱和C5-C20酸和支链或不饱和C5-C20一元醇的单酯和聚酯；支链或不饱和C5-C20酸和直链C2-C4一元醇的单酯和聚酯；
-C6-C12脂肪酸甘油三酯，例如辛酸和癸酸甘油三酯和三庚酸甘油酯；
-支链和/或不饱和C10-C20脂肪酸(例如亚油酸、月桂酸和肉豆蔻酸)；
-支链和/或不饱和C10-C20脂肪醇(例如辛基十二烷醇和油醇)；
-例如角鲨烷(C30)的烃化合物，尤其是提取自橄榄油的植物角鲨烷，和半角鲨烷(C15)；
-例如二辛基碳酸酯和二(乙基己基)碳酸酯的二烷基碳酸酯；
-例如二辛基醚的二烷基醚；及
-其混合物。
还可以提及包含一种或多种上述组分的植物油。
作为酸和一元醇的酯，尤其可以提及单酯，例如椰油醇辛酸酯和癸酸酯的混合物、澳洲坚果油酸乙酯、乳木果油乙酯、异硬脂酸异硬脂酯、异壬酸异壬酯、异壬酸乙基己酯、新戊酸己酯、新戊酸乙基己酯、新戊酸异硬脂酯、新戊酸异癸酯、肉豆蔻酸异丙酯、肉豆蔻酸辛基十二醇酯、棕榈酸异丙酯、棕榈酸乙基己酯、月桂酸己酯、月桂酸异戊酯、壬酸鲸蜡硬脂醇酯、辛酸丙基庚酯及其混合物。其他可用的酯为酸和一元醇的二酯，例如己二酸二异丙酯、己二酸二(乙基己基)酯、癸二酸二异丙酯和癸二酸二异戊酯。
植物油的实施例尤其为小麦胚芽、葵花、摩洛哥坚果、木槿、香菜、葡萄籽、芝麻、玉米、杏、蓖麻、乳木果、牛油果、橄榄和大豆的油、甜杏仁油、和棕榈、油菜籽、棉花籽、榛子、澳洲坚果、荷荷巴、苜蓿、罂粟、南瓜、芝麻、西葫芦、黑醋栗、月见草、薰衣草、玻璃苣、小米、大麦、藜麦、黑麦、红花、桐实、西番莲、麝香蔷薇、蓝蓟、亚麻荠或山茶油。
所述脂肪相可能还包含至少一种脂肪相结构剂。术语“脂肪相结构剂”意指能使所述组合物中所含的油增稠的化合物，尤其选自蜡、脂肪相胶凝剂和糊状脂肪物质及其混合物。
根据一个优选的实施方式，此组合物还包含至少一种不同于永久花提取物的抗老活性剂，尤其是适合于预防和/或治疗皱纹、皮肤下垂和/或色素斑形成的活性剂，尤其可选自：自由基清除剂、刺激角质形成细胞和/或成纤维细胞分化和/或增殖的药剂；刺激糖胺聚糖和/或胶原蛋白和/或真表皮锚定纤维和/或弹性纤维合成的药剂；阻止胶原蛋白和/或糖胺聚糖和/或真表皮锚定纤维和/或弹性纤维降解的药剂；抗糖基化剂；去色素剂和/或黑色素生成抑制剂及其混合物。
此类抗老活性剂的实例尤其为：抗坏血酸、其盐、其醚及其酯，尤其是抗坏血酸葡萄糖苷；腺苷；核糖；蜂蜜提取物；蛋白和糖蛋白，尤其提取自甜杏仁；水解植物蛋白，尤其来自大米、来自木槿籽或来自羽扇豆；多肽或假二肽，例如脱羧肌肽盐酸盐、棕榈酸五肽-4(Pal-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser)和棕榈酸三肽-38，尤其是由Sederma分别以商品名
Figure BDA0002684915090000091
3000和
Figure BDA0002684915090000092
Synthe’6销售，以商品参考
Figure BDA0002684915090000093
由Lucas Meyer公司销售的棕榈酸三肽-8、以商品名
Figure BDA0002684915090000094
Solution由Lipotec公司销售的五肽-18、以商品名
Figure BDA0002684915090000095
由Sandream公司销售的sh-十肽-9和以参考X50
Figure BDA0002684915090000096
Powder由Infinitec公司销售的棕榈酸六肽-52；硅烷类，例如甲基硅烷醇甘露糖醛酸酯；阿拉伯木聚糖，尤其提取自黑麦面粉，和半乳糖阿拉伯聚糖，尤其来自落叶松；透明质酸及其盐；多酚，尤其提取自含羞草；α-羟基酸，包括提取自柠檬的那些；植物提取物(通常为水性提取物)，例如睡菜、野生三色堇、野生问荆、天神草(Acmella oleracea)、苏格兰蓟(Onopordum acanthium)、蓍草(Achilleamillefolium，尤其是包含于来自BASF公司的产品
Figure BDA0002684915090000097
)、酸藤子(Embelia concinna，如Seppic公司所售)、梨果仙人掌(Opuntia ficus indica，尤其以商品名
Figure BDA0002684915090000098
由Mibelle AG Biochemistry销售)、鼠尾草(Salvia offocinalis，尤其是由Provital Group销售)、黄荆(Vitex negundo，尤其以商品参考
Figure BDA0002684915090000099
由Laboratoires Expanscience销售)、甜栗、木瓜、摩洛哥坚果树、燕麦、葵花、雏菊、牡丹或莳萝；藻类的水性提取物且尤其是珊瑚藻的、叉珊藻的、裙带菜(Ungaria pinnatifada)的、翅藻(Alaria esculenta)的、或微绿球藻(Nannochlorosis oculata)的；精油，尤其是桃金娘的；葡萄糖酸锌和/或葡萄糖酸铜；及其混合物。
作为一个变化形式或另外，根据本发明所用的组合物可包含至少一种张紧剂(tensioning agent)。它可以是一种张紧聚合物，能够通过机械作用张紧皮肤并由此减少皱纹和细纹的出现，尤其是聚糖，尤其是藻类或水生生物或植物胶的一种提取物。它也可以是一种生物上起作用的类肉毒杆菌素类型的张紧剂，例如以名称
Figure BDA0002684915090000101
Expression由Gattefosse公司销售的千日菊(Acmella oleracea)提取物；以名称
Figure BDA0002684915090000102
LS9736由BASFBCS公司销售的木槿籽提取物或以名称
Figure BDA0002684915090000103
由Lipotec公司销售的一种乙酰六肽-8类型的肽。
根据本发明的组合物还可包含可被分散于乳液的脂肪相中和/或水相中的不同组分，条件是它们适合于对皮肤的局部应用。
因此，也可包含至少一种“水包油”或“油包水”乳化剂，所述乳化剂通常是非离子的，例如聚氧乙烯酯，任选地聚氧乙烯化山梨醇酐酯，任选地脂肪酸和甘油的聚氧乙烯化酯，脂肪酸和糖的醚，例如烷基糖苷，及其混合物。所述乳化剂可以占组合物总重量的从2％至10％且优选地从4％至6％。
根据本发明的组合物还可包含一种或多种粉状填充剂，所述粉状填充剂有利地为多孔或空心的微颗粒的形式、优选多孔微颗粒的形式。这些微颗粒原则上基本上是球形的。这些填充剂尤其可选自：
-有机填充剂，例如：聚糖粉末且尤其是天然淀粉粉末、改性淀粉粉末或纤维素粉末；丙烯酸聚合物例如聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚酰胺或聚烯烃的粉末；干藻类例如水解珊瑚藻(Corallina officinalis)的粉末；
-无机填充剂，例如二氧化硅、黏土、珍珠岩和滑石；
-及其混合物。
优选地使用二氧化硅作为无机填充剂。
相对于组合物的总重量，这些填充剂可占1至5重量％。
根据本发明的组合物也可包含添加剂，所述添加剂尤其选自有机和/或无机的光防护剂，所述光防护剂在蓝光和/或UVA和/或UVB有活性；基于聚糖的成膜聚合物，所述成膜聚合物能够形成抗污染防护膜，例如以商品名
Figure BDA0002684915090000111
和
Figure BDA0002684915090000112
由Solabia销售的产品；例如α–和β-羟基酸的去皮剂；去角质颗粒；芳香剂；抗氧化剂；隔离剂；pH调节剂；防腐剂；色素；染料；及其混合物。
此组合物可以为任何适合于局部应用于皮肤的形式且尤其是以乳液、霜、露、凝胶、膏或膜的形式。所述组合物通常是免洗型组合物且尤其是护肤组合物、例如粉底的化妆组合物、或抗日光组合物。
根据本发明的组合物可被应用于在皮肤上显示出衰老和或皮肤干燥迹象的个体(例如至少30岁，或甚至至少40岁)的至少一个身体区域，且更特别地在脸、颈和/或领口。作为一种变化形式，可以将其应用于手。作为另一种变化形式，它可被应用于全身，尤其是胸、手臂、腿和腹部，出于对抗皮肤上的衰老迹象和/或皮肤干燥的目的。
此组合物可在一日内一次或多次，例如在早上和/或在晚上，应用于需要治疗的区域。
作为一种变化形式，根据本发明的组合物可以是用于护肤的洗去型组合物，尤其是用于脸且任选地用于身体。在此情况下，可以将其用作例如磨砂膏或面膜。
附图说明
图1说明了与未经处理的对照相比，用本发明的组合物处理的培养物中由角质形成细胞表达的编码谷氨酰胺转氨酶1(TGM1)、细胞角蛋白10(KRT10)、外膜蛋白(IVL)的基因的表达水平。
图2说明了与未经处理的对照相比，用本发明的组合物处理的培养物中由角质形成细胞表达的编码丝聚合蛋白(FLG)、组织蛋白酶L2(CSTL2)和兜甲蛋白(LOR)的基因的表达水平。
图3说明了与未经处理的对照相比，用本发明的组合物处理的培养物中由角质形成细胞表达的编码通过Ki-67单克隆抗体(MKI67)鉴定的抗原、β1整联蛋白(ITGB1)和α6整联蛋白(ITGA6)的基因的表达水平。
具体实施方式
参考以下实施例可以更加清楚地理解本发明，所述实施例纯粹是作为说明的方式给出的并不旨在限制由权利说明所定义的本发明的范围。
实施例1：人角质形成细胞原代培养的体外试验：本发明的组合对表皮分化的效果
1.材料和方法
在下面的试验中，使用了通过蒸汽蒸馏从植物的花头获得的意大利蜡菊(Helichrysum italicum)精油和从蒸汽蒸馏残留物获得的永久花蒸馏残留物的油性提取物。此提取物通过用超临界CO2在60℃温度和285巴压力下提取所述残留物(蒸馏残留物)制备。将由此获得的不可皂化的化合物在葵花油中稀释，然后使其在200℃经历分子蒸馏步骤，并将得到的馏出物通过在辛酸/癸酸甘油三酯中稀释至3-5重量％的量进行标准化。
a)细胞培养
来源于一个女性供体乳腺活检的原代培养物中的角质形成细胞以每孔12000个细胞的比例接种到96孔板(Nunc)内，在补充有50μg/ml的垂体提取物(Gibco)、5mg/ml EGF(表皮生长因子，Gibco)和100μg/ml normocin(Invivogen)的角质形成细胞无血浆培养基(Keratinocyte Serum-Free Medium(KSFM),Gibco)中。在用永久花蒸馏残留物的油性提取物、永久花精油及其组合处理前，将所述细胞在37℃和5％CO2维持培养3天。
b)永久花精油、永久花蒸馏残留物的油性提取物及其组合的细胞毒性
在培养72h后，将所述培养基更换成不存在或存在0.0005％的永久花精油、0.001％的永久花蒸馏残留物的油性提取物及其组合。对于每种浓度，在6个相同的孔中进行培养。
维持所述培养4天且在培养时间内更换包含研究化合物的培养基换3次(每天)。
在培养4天后，移除所述培养基并替换成包含XTT(2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑的钠盐)溶液的培养基。在37℃和5％CO2用此溶液孵育细胞2h。
在孵育时间结束时，用
Figure BDA0002684915090000131
微板读取器测量在450nm的吸光度。
通过以下方法计算细胞活力：
％活力＝(处理的OD平均值-空白)/(未经处理的OD平均值-空白)X100。
设定毒性阈值为未经处理的对照的值的85％。
c)RNA提取
在测量了表示细胞活力的吸光度之后，移除包含XTT溶液的培养基并替换成包含1％β-巯基乙醇(VWR)的缓冲液(RLT缓冲液，Qiagen)。在裂解后，将所述细胞于-80℃冷冻。为了有足够的RNA以进行实时PCR分析，每个条件聚集3孔并根据RNeasy mini kit(Qiagen)的规程进行2个不同的RNA提取，用DNase I孵育以移除基因组DNA。使用NanoView分光光度计测量RNA的量并使用Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)进行微毛细电泳以验证RNA的质量。
d)反转录PCR
使用“AffinityScript QPCR cDNA合成试剂盒”(Agilent technologies)将400ngRNA反转录成cDNA。使用MXP3005体系(Agilent technologies)以每种条件两次重复进行实时PCR。所使用的扩增试剂盒是Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix(Agilent technologies)。
所用的引物来自Bio-Rad：谷氨酰胺转氨酶1(TGM1,qHsaCED0056475)、角蛋白10(KRT10,qHsaCED0034304)、外膜蛋白(IVL,qHsaCED0046054)、丝聚合蛋白(FLG,qHsaCED0036604)、组织蛋白酶2(CSTL2,qHsaCED0044736)、兜甲蛋白(LOR,qHsaCED0048415)、β1整联蛋白(ITGB1,qHsaCED0005248)和α6整联蛋白(ITGA6,qHsaCED0042632)。
使用两个管家基因，TATA框结合蛋白(TBP,qHsaCID0007122)和核糖体蛋白L13a(RPL13A,qHsaCED0045063)，来标准化目标基因的表达。
2.结果
证明了分开试验的所述提取物及其混合物不呈现出细胞毒性(细胞活力>85％)。
此外证明了(图1和图2)，相比于每种提取物单独使用，使用两种提取物(永久花精油和永久蒸馏残留物的油性提取物)的组合，参与表皮分化和屏障功能的基因的表达(TGM1、KRT10、IVL、FLG、CSTL2和LOR)协同地增加。使用这种组合，这些基因的表达以3至24的因数倍增，而提取物各自不会使这些基因显著过表达。此效果对于编码兜甲蛋白的基因来说尤其显著，对于编码外膜蛋白的基因而言程度小一些，所述两种蛋白分别是不溶的和可溶的蛋白，其对参与表皮屏障功能的角质化包膜的形成是必需的，它们通过钙依赖酶TGM1相互联系。也观察到编码丝聚合蛋白的基因的强烈过表达，所述丝聚合蛋白构成了也组成角质化层的角质纤维之间的胶合剂，且是天然保湿因子(NMF)的前体。
此外，如图3呈现的，没有观察到未分化的角质形成细胞的标志物(ITGA6和ITGB1)的表达的改变，这尤其显示了本发明的组合保存了恒定的增殖细胞池，因此确保了表皮更新。
因此，此实施例证明了本发明的组合使得有效对抗皮肤衰老并巩固皮肤的屏障功能成为可能。
实施例2：化妆品组合物
以下组合物由本领域技术人员以传统方法将以下组分以所标注的重量比混合来制备。
Figure BDA0002684915090000151

Claims (9)

1.一种化妆品组合物，所述化妆品组合物在生理学可接受的介质中包含通过水蒸馏或蒸汽蒸馏意大利蜡菊(Helichrysum italicum)的地上部分获得的精油和意大利蜡菊的地上部分的蒸馏残留物的油性提取物，所述油性提取物通过使用处在超临界态的二氧化碳提取所述蒸馏残留物而获得并且包含：固醇；饱和或不饱和的直链C7-C10羧酸，包括2-(Z)-癸烯酸和4-(Z)-癸烯酸；苯甲酸；以及饱和或不饱和的直链C8-C18脂肪酸的乙酯。
2.如权利要求1所述的组合物，特征在于，所述意大利蜡菊精油从意大利蜡菊的花或花头获得。
3.如权利要求1所述的组合物，特征在于，所述意大利蜡菊蒸馏残留物的油性提取物进一步经历分子蒸馏步骤。
4.如权利要求1或3所述的组合物，特征在于，所述意大利蜡菊蒸馏残留物的油性提取物在辛酸/癸酸的甘油三酯的溶剂中进一步被稀释。
5.如权利要求1所述的组合物，特征在于，相对于组合物的总重量，所述意大利蜡菊精油占0.001重量％至5重量％。
6.如权利要求1所述的组合物，特征在于，所述固醇由β-谷固醇组成，所述饱和或不饱和的直链C7-C10羧酸包括庚酸、辛烯酸和癸烯酸，以及所述饱和或不饱和的直链C8-C18脂肪酸的乙酯包括辛酸乙酯、癸酸乙酯和亚油酸乙酯。
7.如权利要求1所述的组合物，特征在于，相对于组合物的总重量，所述意大利蜡菊蒸馏残留物的油性提取物占0.001重量％至5重量％。
8.如权利要求1至7任一项所述的组合物的非治疗用途，用于延迟皮肤衰老迹象的开始、减慢皮肤衰老迹象的进程或降低皮肤衰老迹象的强度，所述衰老迹象是皱纹、皮肤下垂、皮肤柔韧性和/或弹性的丧失、皮肤变薄、皮肤粗糙和/或肤色失去光泽；或用于对抗皮肤干燥。
9.一种用于非治疗用途的化妆方法，所述方法包括将权利要求1至7任一项所述的组合物局部施用至皮肤上，用于延迟皮肤衰老迹象的开始、减慢皮肤衰老迹象的进程或降低皮肤衰老迹象的强度，所述衰老迹象是皱纹、皮肤下垂、皮肤柔韧性和/或弹性的丧失、皮肤变薄、皮肤粗糙和/或肤色失去光泽；或用于对抗皮肤干燥。
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