CN111826310A

CN111826310A - 一种含有嗜麦芽寡养单胞菌的菌酶混合制剂及其应用

Info

Publication number: CN111826310A
Application number: CN202010635189.7A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 颜正飞; 陈晓倩; 黄青松; 顾冷涛
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2040-07-03
Also published as: CN111826310B

Abstract

本发明涉及一种含有嗜麦芽寡养单胞菌的菌酶混合制剂及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一种全新的降解聚对苯二甲酸乙二醇酯及聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的方法，通过将特定菌株和特定生物酶类组合，制备了具有特定降解用途的菌酶混合制剂，该混合制剂为嗜麦芽寡养单胞菌与角质酶的复配物；采用本发明提供的菌酶混合制剂降解聚对苯二甲酸乙二醇酯及聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体，其降解能力远优于采用菌或酶单独处理，所述菌酶混合制剂在高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)及其中间体苯二甲酸乙二醇酯(BHET)降解过程中具有显著的协同作用，在塑料降解技术领域具有较好地推广应用价值。

Description

一种含有嗜麦芽寡养单胞菌的菌酶混合制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种含有嗜麦芽寡养单胞菌的菌酶混合制剂及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

随着经济的高速发展，塑料垃圾的积累量超3.2亿吨/年，其中60％的塑料垃圾则是聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料制品。由于塑料难以降解，因此，全球每年的塑料制品回收利用率仅有14％，这使得塑料垃圾在环境中持续积累，对生态构成了严重的威胁。因此，降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)对治理塑料垃圾十分关键。

相对传统物理化学降解技术，生物降解技术是直接通过可降解塑料的菌株降解塑料的技术，由于其具有绿色无污染以及成本低的优势，逐渐成为塑料降解领域的研究热点。例如，菌株Ideonella sakaiensis，能够以聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)为唯一营养源，降解速率为0.13mg/d(Science,2016,351:1196-1199)。同时，大量研究发现生物酶也具有降解PET的活性，如脂肪酶、角质酶、酯酶、PETase、LCC、HiC等(Appl.Microbiol.Biotechnol.2019,103:4253-4268)，但均集中在降解经处理后的低结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜，针对高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜降解研究较少。

在单酶降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的过程中，伴随着小分量的降解产物产生，对苯二甲酸(TPA)、羟乙基对苯二甲酸酯(MHET)、苯二甲酸乙二醇酯(BHET)。然而这些降解中间产物会与酶竞争性结合，产生产物竞争性抑制作用，从而削弱酶对聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的降解(Biochem.Eng.J.2015,93,222-228；J Ind MicrobiolBiotechnol(2017)44:835-844)。较单酶而言，多酶复配能够显著降解PET效率，其根本原因在于其中一个酶能够降解一些小分子产物，解除其余酶的产物竞争性抑制作用，有效保持其余酶对聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的活性。比如角质酶就是一类能够降解小分量降解中间产物，有效解除聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解酶的产物竞争性抑制作用(Biotechnol.J.2016,11,1082-1087)。故多酶在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)方面比单菌降解更具有优势。目前多酶降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)研究较多，而菌酶(混合制剂)协同降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的研究较少。相对于微生物而言，外界环境(温度、pH、缓冲液等)更容易影响酶的稳定性，微生物在外界环境中的稳定性远高于酶，与此同时，微生物和酶混合，能够明显提升酶的稳定性。故菌酶混合制剂在PET降解方面具有很大的发展空间。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种含有嗜麦芽寡养单胞菌的菌酶混合制剂所述菌酶混合制剂含有嗜麦芽寡养单胞菌和角质酶；

或者，所述菌酶混合制剂含有嗜麦芽寡养单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌菌株发酵液和角质酶；

或者，所述菌酶混合制剂含有嗜麦芽寡养单胞菌菌株培养液和角质酶。

在本发明的一种实施方式中，所述嗜麦芽寡养单胞菌为StenotrophomonaspavaniiJWG-G1是从来源于无锡桃花山垃圾填埋场的土壤样本中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示，将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，结果显示与寡养单胞菌属的核酸序列相似度高达99％，将与其相似度高的菌株构建系统进化树(具体可见图1)，结果显示菌株属于寡养单胞菌属的嗜麦芽寡养单胞菌，将其命名为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)JWG-G1；

所述嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)JWG-G1在LB固体培养基上的菌落呈圆隆形凸起，淡黄色，不透明，湿润有光泽，边缘有鞭毛(具体可见图1-图2)；

在本发明的一种实施方式中，所述菌酶混合制剂中，角质酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述菌酶混合制剂中，角质酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述嗜麦芽寡养单胞菌菌体活菌数1-2×10⁹CFU/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述角质酶的酶活为20-50U/mL。

本发明还提供了上述菌酶混合制剂的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)活化菌种，将嗜麦芽寡养单胞菌置于LB平板上，37℃、150rpm条件下培养1-2d；

(2)制备种子液，刮取步骤(1)中所培养的菌体，接种于液体LB培养基中，30℃、150rpm条件下培养12h；

(3)扩大培养，将步骤(2)中种子液按1％的体积比转接液体LB培养基，30℃、150rpm条件下培养至OD₆₀₀＝1.0；

(4)制备菌剂，将步骤(3)中发酵液3600rpm离心l0min，弃上清夜，然后加入无机盐液体将嗜麦芽寡养单胞菌菌体进行充分悬浮，调整菌体活菌数为1-2×10⁹CFU/mL；

(5)制备菌酶混合制剂，将角质酶加入(4)中的菌剂中，调节角质酶的酶活为20-50U/mL，混合均匀。

在本发明的一种实施方式中，上述步骤(4)中调整菌体活菌数为2×10⁹CFU/mL。

在本发明的一种实施方式中，上述步骤(5)中调节角质酶的酶活为50U/mL

本发明还提供了一种上述菌酶混合制剂在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体为苯二甲酸乙二醇酯。

本发明还提供了一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的方法，所述方法为将上述的菌酶混合制剂添加至含有聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的无机盐液体中进行降解。

在本发明的一种实施方式中，在聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体降解过程中，将制备好的菌酶混合制剂按0.5-20.0％体积比的添加量，添加到含有聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的无机盐液体中，反应体系：pH 7.0、35℃、150rpm条件下作用15h。

本发明还提供了一种可用于降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的产品，所述产品中含上述菌酶混合制剂。

本发明还提供了上述的协同降解聚对苯二甲酸乙二醇酯及聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的菌酶混合制剂在塑料垃圾污染的生物修复中的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种全新的降解聚对苯二甲酸乙二醇酯及聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的方法，本发明通过将特定菌株和特定生物酶类组合，制备了具有特定降解用途的菌酶混合制剂。采用本发明提供的菌酶混合制剂降解聚对苯二甲酸乙二醇酯及聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体，其降解能力远优于采用菌或酶单独处理，该菌酶混合制剂表现出很好的协同降解效应。

(2)采用本发明提供的菌酶混合制剂降解聚对苯二甲酸乙二醇酯及聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体，菌酶混合制剂添加量≥10.0％时，15h内对BHET的降解率达到90％以上；菌酶混合制剂添加量≥30.0％时，处理高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜15h，失重率达到50％以上。

(3)本发明通过将麦芽寡养单胞菌菌株培养液与角质酶的复配得到菌酶混合制剂，设计了较为简便的菌酶混合制剂降解PET的技术方案，使得本发明具有工艺简单、处理成本低的优势，在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)方面具有极高的应用前景。

生物材料保藏

一株嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)JWG-G1，分类学命名为Stenotrophomonas pavanii JWG-G1，已于2019年06月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019415，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

附图说明

图1为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)JWG-G1的菌落。

图2为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)JWG-G1的形态图。

图3为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)JWG-G1的进化树。

图4为菌酶混合制剂降解聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体苯二甲酸乙二醇酯(BHET)的示意图。

图5为菌酶混合制剂降解高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜、对苯二甲酸(TPA)、羟乙基对苯二甲酸酯(MHET)、苯二甲酸乙二醇酯(BHET)标准品购自Sigma公司。角质酶实验室自制(按照ZL200910260984.6的中国专利中所述方法制备)；低结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜购自Goodfellow GmbH公司；高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜来自于可口可乐瓶。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、氯化钠10、琼脂13，pH 7.0。

LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、氯化钠10，pH 7.0。

无机盐液体(g/L)：KH₂PO₄ 0.7、K₂HPO₄·3H₂O 0.5、NH₄Cl 2、MgSO₄·7H₂O 0.6、NaCl0.005、FeSO₄·7H₂O 0.001、ZnSO₄·7H₂O 0.002、MnSO₄·H₂O 0.001。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

降解产物及其含量的检测方法：

标准品处理：分别称取TPA、MHET、BHET的标准品溶于二甲亚砜(DMSO)中制成母液，利用无菌水将母液稀释成0.1mg/mL标准品溶液，用0.22μM的滤头过滤，用注射器注入液相瓶进行HPLC检测；

样品处理：将降解液静置10min，取上清5mL，12000rpm离心8min，用0.22μM的滤头过滤，用注射器注入液相瓶，进行HPLC检测。

BHET降解率：

降解率(％)＝[(A-B)/A]×100

式中：

A：反应前BHET浓度；

B：反应后BHET浓度；

PET薄膜失重率：

失重率(％)＝[(m₂-m₁)/m₂]×100；

式中：

m₁：经处理后的PET薄膜用去离子水反复清洗3～4次，将清洗完的PET薄膜于功率200W、频率58KHz的条件下超声15min，放入烘箱60℃烘干6h后称重；

m₂：经菌株处理前的PET薄膜用去离子水反复清洗3～4次，将清洗完的PET薄膜于功率200W、频率58KHz的条件下超声15min，放入烘箱60℃烘干6h后称重；

实施例1：嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)的筛选及鉴定

一、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)的筛选

具体步骤如下：

1、普通筛选

以来源于无锡市桃花山垃圾填埋场土壤为样本，取1g土壤加入9mL生理盐水，于35℃、180rpm的条件下振荡富集培养30min；随后取1mL上清液依次稀释至10^-4、10^-5、10^-6，分别取200μL稀释至10^-4、10^-5、10^-6的稀释液均匀涂布于含有2g/L聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的无机盐固体培养基上，置于35℃培养箱中恒温培养至长出菌落；实验结果显示经多日培养，分离平板未出现菌落，该方法并不能有效分离出具有降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)能力的菌株。

2、“PET诱导培养”筛选

(1)以来源于无锡市桃花山垃圾填埋场土壤为样本，取1g土壤加入9mL含有2g/L聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的无机盐液体培养基，于35℃、180rpm的条件下振荡富集培养48h；接着吸取上述1mL富集液加入新的9mL2g/L聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的无机盐液体培养基，相同条件培养10个循环；

(2)随后取步骤(1)培养10个循环后获得的培养液上清1mL依次稀释至10^-4、10^-5、10^-6，取200μL稀释至10^-4、10^-5、10^-6的稀释液均匀涂布于含有2g/L聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的无机盐固体培养基上，置于35℃培养箱中恒温培养至长出菌落；实验结果显示经多日培养，分离平板出现的菌落稀疏(5-6个/板)；

(3)作为对照，取步骤(1)培养10个循环后获得的培养液上清1mL依次稀释至10^-4、10^-5、10^-6，取200μL稀释至10^-4、10^-5、10^-6的稀释液转接到不含聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的无机盐固体培养基，35℃下进行培养，上述菌落均能够在不含聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的无机盐固体培养基上生长；

可见，上述菌落均为自养型的纯化菌株，并非是以PET为唯一营养源的非自养型的菌株。该方法并不能有效分离出具有降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)能力的菌株。

3、“逐级筛选”策略

(1)以来源于无锡市桃花山垃圾填埋场土壤为样本，取1g土壤加入9mL含有10g/L对苯二甲酸二乙酯(DET)的无机盐液体培养基，于35℃、180rpm的条件下振荡富集培养48h，接着吸取上述1mL富集液加入新的9mL含有10g/L对苯二甲酸二乙酯(DET)的无机盐液体培养基，相同条件培养10个循环；

(2)吸取上述步骤(1)培养10个循环后获得的培养液上清1mL加入新的9mL含有对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)的无机盐液体培养基，相同条件培养10个循环；

(3)吸取上述步骤(2)培养10个循环后获得的培养液上清1mL加入新的9mL含有2g/L聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的无机盐液体培养基，相同条件培养10个循环；

(4)吸取上述步骤(3)培养10个循环后获得的培养液上清1mL依次稀释至10^-4、10^-5、10^-6，取200μL稀释至10^-4、10^-5、10^-6的稀释液均匀涂布于含有2g/L聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的无机盐固体培养基上，置于35℃培养箱中恒温培养至长出菌落(180-200个/板)；以无营养源的无机盐固体培养基作为对照，得到非自养型的纯化菌株10个，将长势最好的纯化菌株分别命名为菌株JWG-G1。

基于上述的3中不同的分离筛选方法的结果，可发现需要对苯二甲酸二乙酯(DET)和对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)等可溶、结构简单的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)中间体作为初步底物，对聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解菌株进行富集，使其菌株适应聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)中间体为唯一营养物。随后就以聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)为唯一底物再次进行降解菌株富集，使其聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)中间体降解菌株中衍生出能够降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的菌株，并使其浓度进一步提升。故“逐级筛选”策略能够有效筛选出具有PET降解能力的菌株。

二、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)鉴定

提取菌株JWG-G1的总DNA进行16S rDNA的扩增和测序(由无锡天霖生物科技有限公司完成)，将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，发现菌株JWG-G1与寡养单胞菌属的16S rDNA序列同源性大于99％，其中，与嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonaspavanii)DSM 25135的16S rDNA序列相似率达99.5％。可见，菌株JWG-G1属于寡养单胞菌属。

将菌株JWG-G1的16S rDNA序列(序列如SEQ ID NO.3所示)与其相似度高的菌株构建系统进化树(菌株JWG-G1构建得到的系统进化树可见图3)，结果显示菌株JWG-G1与Stenotrophomonas pavanii DSM 25135同属于一个分支，可见，菌株JWG-G1属于寡养单胞菌属，命名为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)JWG-G1。

实施例2：菌酶混合制剂的制备

具体步骤如下：

(1)活化菌种：将嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1涂布于LB固体培养基平板上，在37℃、150rpm条件下培养1d，得到单菌落；

(2)制备种子液：刮取步骤(1)中培养得到的单菌落接种于5mL液体LB培养基的玻璃试管中，30℃、150rpm条件下培养12h，得到种子液；

(3)扩大培养：将步骤(2)中所得到的种子液(活菌数1×10⁸CFU/mL)按1％的体积比转接LB液体培养基，30℃、150rpm条件下培养至OD₆₀₀＝1.0，得到发酵液；

(4)制备菌剂：将步骤(3)中所得到的发酵液3600rpm离心10min，弃上清液，然后加入无机盐液体培养基至菌体活菌数为2×10⁹CFU/mL，得到菌剂；

(5)制备菌酶混合制剂：将角质酶加入(4)中的菌剂中至角质酶的酶活为50U/mL，混合均匀后即可获得菌酶混合制剂。

实施例3：不同添加量的嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1对聚对苯二甲酸乙二醇酯的中间体苯二甲酸乙二醇酯(BHET)的降解能力

将将实施例2中步骤(4)获得的菌剂嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1(活菌数2×10⁹CFU/mL)分别以0.5％、1.0％、3.0％、5.0％、8.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％和40％体积比的添加量加入到含有2mg BHET的无机盐液体中，得到反应体系；将反应体系放置于37℃，150rpm条件下反应15h，利用HPLC测定MHET、TPA生成量和BHET剩余量。

分析结果见表1，随着嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1的添加量增加，其BHET的降解率也逐步升高；嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1为20％添加量时，BHET的降解率达到最大值(37％)；之后随着嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1添加量的增加，BHET的降解率保持不变。

降解产物主要为MHET和TPA，且MHET的含量高于TPA，随嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1的添加量上升，MHET含量并未有显著下降；而且文献(Biochem.Eng.J.2015,93,222-228；JInd Microbiol Biotechnol(2017)44:835-844)证实MHET多为抑制剂，能够抑制嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1对BHET的降解活性，而且嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1对MHET的降解活性较弱，亦无法将MHET进一步降解成单体TPA。

表1嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1单独处理BHET

实施例4：不同添加量的角质酶对聚对苯二甲酸乙二醇酯的中间体苯二甲酸乙二醇酯(BHET)的降解能力

将角质酶(50U/mL)分别以0.5％、1.0％、3.0％、5.0％、8.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％和40％体积比的添加量加入到含有2mg BHET的无机盐液体中，得到反应体系；将反应体系放置于37℃，150rpm条件下反应15h，利用HPLC测定MHET、TPA生成量和BHET剩余量。

分析结果见表2，随着角质酶加酶量的增加，BHET降解率逐步上升。当角质酶加酶量为30％时，BHET降解率达到最大(46％)，之后随着角质酶加酶量的增加，BHET的降解率保持不变(46％)。降解产物当中，TPA的含量越高，降解能力就越强。由表2所示，降解产物主要为MHET、TPA，但MHET的含量远低于TPA，证实角质酶对BHET有较高的降解活性，首先将BHET降解成MHET和TPA。随角质酶的添加量上升，MHET含量显著下降，角质酶对MHET有较好的降解活性，能够将MHET进一步降解成单体TPA。文献(J Ind Microbiol Biotechnol(2017)44:835-844)也证实角质酶能够有效降解小分子中间产物MHET，故MHET对角质酶的活性未有显著的影响。

表2角质酶单独处理BHET

实施例5：菌酶混合制剂对聚对苯二甲酸乙二醇酯的中间体苯二甲酸乙二醇酯(BHET)的降解能力

将实施例2获得的含嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1的菌酶混合制剂分别以0.5％、1.0％、3.0％、5.0％、8.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％和40％体积比的添加量加入到含有2mg BHET的无机盐液体中，得到反应体系；将反应体系放置于37℃，150rpm条件下反应15h，利用HPLC测定MHET、TPA生成量和BHET剩余量。

分析结果见表3，随着菌酶混合制剂的添加量增加，其BHET的降解率升高。菌酶混合制剂对BHET降解效率明显高于单菌、单酶处理之和。菌酶混合制剂添加量≥10.0％时，BHET降解效率达到90％以上。菌酶混合制剂能够协同降解BHET生成MHET、TPA(如图4所示)，且MHET的含量远低于TPA。由实施例3、4得，角质酶对MHET降解活性高，角质酶通过降解MHET来解除MHET对嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1的抑制作用，从而提高菌酶混合制剂降解BHET的效率。

表3菌酶混合制剂处理BHET

实施例6：嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1对高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的降解能力

将实施例2中步骤(4)获得的菌剂嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1(活菌数2×10⁹CFU/mL)分别以0.5％、1.0％、3.0％、5.0％、8.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％和40％体积比的添加量加入到含有1片2×2cm²(2mg)高结晶度PET薄膜的无机盐液体中，得到反应体系；将反应体系放置于37℃，150rpm条件下反应15h，利用HPLC分析PET薄膜降解产物生成量及薄膜失重率。

分析结果见表4，其降解产物主要为BHET、MHET和TPA，降解产物生成量随着嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1的添加量增加而增加，其中MHET的生成量高于BHET和TPA。由实施例3可得，MHET对嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1降解活性具有一定的抑制作用，从而导致PET的降解效率低；当嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1添加量为30％时，失重率达到最大值(23.3％)，之后随着添加量增加，失重率保持不变。

表4嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1单独处理PET薄膜

实施例7：角质酶对高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的降解能力

将角质酶(50U/mL)分别以0.5％、1.0％、3.0％、5.0％、8.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％和40％体积比的添加量加入到含有1片2×2cm²(2mg)PET薄膜的无机盐液体中，得到反应体系；将反应体系放置于37℃，150rpm条件下反应15h，利用HPLC分析反应液中PET降解产物生成量及薄膜失重率。

分析结果见表5，角质酶能够将聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解成MHET和TPA(无BHET)，且降解产物生成量随着角质酶的加酶量增加而增加，并在角质酶加酶量为30％时，失重率达到最大值(19.6％)，当角质酶加酶量＞30％时，失重率并无显著变化，保持不变。与实施例6中嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1降解高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜相比，角质酶降解高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的产物仅有TPA和MHET；可知，角质酶可将高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜降解成MHET、TPA；TPA生成量远高于MHET生成量，也证实了角质酶可以将MHET降解成单体TPA。

表5角质酶单独处理PET薄膜

实施例8：菌酶混合制剂对高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的降解能力

将实施例2获得的含嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1的菌酶混合制剂分别以0.5％、1.0％、3.0％、5.0％、8.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％和40％体积比的添加量加入到含有1片2×2cm²(2mg)PET薄膜的无机盐液体中，得到反应体系；将反应体系放置于37℃，150rpm条件下反应15h，利用HPLC测定降解产物生成量及薄膜失重率。

分析结果见表6，菌酶混合制剂对聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜降解效率明显高于单菌、单酶处理之和，随着菌酶混合制剂的添加量增加，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的失重率升高；菌酶混合制剂添加量为30.0％时，PET薄膜失重率达到最大值(50.1％)，当添加量＞30.0％时，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜失重率并无显著变化；嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1与角质酶的混合制剂能够协同降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜生成MHET、TPA(如图5所示)，且MHET的含量远低于TPA；由实施例6、7得，角质酶对MHET降解活性高，角质酶通过降解MHET来解除MHET对嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1的抑制作用，从而提高菌酶混合制剂降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜效率。

表6菌酶混合制剂处理高结晶度PET薄膜

对比例1：菌酶混合制剂对低结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的降解能力

分别将嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1(活菌数2×10⁹CFU/mL)以30％添加量、角质酶(50U/mL)以30％体积比、实施例2获得的菌酶混合制剂以30％的添加量加入到1片2×2cm²(2mg)低结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的无机盐液体中；放置于37℃，150rpm条件下反应15h，利用HPLC测定降解产物生成量及薄膜失重率。

分析结果见表7，菌酶混合制剂对低结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜降解效率与单菌、单酶的降解效率相比较，并没有显著的变化，故低结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜降解过程中，菌酶混合制剂不存在显著的协同降解效果；对比实施例7，菌酶混合制剂表现出显著的协同降解高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜效，故菌酶混合制剂，菌酶混合制剂更有利于降解高结晶度PET薄膜。

表7菌酶混合制剂处理低结晶度PET薄膜

对比例2：

分别将实施例2的步骤(4)获得的菌剂嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1(活菌数2×10⁹CFU/mL)以20％添加量、角质酶(50U/mL)以20％体积比、实施例2获得的菌酶混合制剂以20％的添加量加入到含有2mg BHET的无机盐液体中，得到反应体系；将反应体系放置于37℃，150rpm条件下反应15h，利用HPLC测定BHET剩余量。

结果显示单菌处理BHET后，降解率为37％；单酶处理BHET后，降解率为40％；菌酶混合制剂对BHET的降解效率达到100％，故15h内，菌酶混合制剂能够完全降解BHET，且降解效率远高于单菌和单酶处理效果之和(77％)。

对比例3：

分别将实施例2的步骤(4)获得的菌剂嗜麦芽寡养单胞菌JWG-G1(活菌数2×10⁹CFU/mL)以30％添加量、角质酶(50U/mL)以30％体积比、实施例2获得的菌酶混合制剂以30％的添加量加入到含有1片2×2cm²(2mg)高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的无机盐液体中，得到反应体系；将反应体系放置于37℃，150rpm条件下反应15h，利用HPLC测定降解产物生成量及薄膜失重率。

结果显示单菌处理高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜后，降解率为23.3％；单酶处理高结晶度PET薄膜后，降解率为19.6％；菌酶混合制剂对高结晶度PET薄膜的降解效率达到50.1％，故15h内，菌酶混合制剂对高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的降解效率远高于单菌和单酶处理效果之和(42.9％)，菌酶混合制剂表现出显著的协同降解作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种含有嗜麦芽寡养单胞菌的菌酶混合制剂及其应用

<130> BAA200554A

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Asn Pro Tyr Glu Arg Gly Pro Asn Pro Thr Asp Ala Leu Leu

1 5 10 15

Glu Ala Ser Ser Gly Pro Phe Ser Val Ser Glu Glu Asn Val Ser Arg

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Gly Phe Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Tyr Pro Arg Glu

35 40 45

Asn Asn Thr Tyr Gly Ala Val Ala Ile Ser Pro Gly Tyr Thr Gly Thr

50 55 60

Glu Ala Ser Ile Ala Trp Leu Gly Glu Arg Ile Ala Ser His Gly Phe

65 70 75 80

Val Val Ile Thr Ile Asp Thr Ile Thr Thr Leu Asp Gln Pro Asp Ser

85 90 95

Arg Ala Glu Gln Leu Asn Ala Ala Leu Asn His Met Ile Asn Arg Ala

100 105 110

Ser Ser Thr Val Arg Ser Arg Ile Asp Ser Ser Arg Leu Ala Val Met

115 120 125

Gly His Ser Met Gly Gly Gly Gly Thr Leu Arg Leu Ala Ser Gln Arg

130 135 140

Pro Asp Leu Lys Ala Ala Ile Pro Leu Thr Pro Trp His Leu Asn Lys

145 150 155 160

Asn Trp Ser Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Ile Gly Ala Asp Leu

165 170 175

Asp Thr Ile Ala Pro Val Ala Thr His Ala Lys Pro Phe Tyr Asn Ser

180 185 190

Leu Pro Ser Ser Ile Ser Lys Ala Tyr Leu Glu Leu Asp Gly Ala Thr

195 200 205

His Phe Ala Pro Asn Ile Pro Asn Lys Ile Ile Gly Lys Tyr Ser Val

210 215 220

Ala Trp Leu Lys Arg Phe Val Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Phe

225 230 235 240

Leu Cys Pro Gly Pro Arg Asp Gly Leu Phe Gly Glu Val Glu Glu Tyr

245 250 255

Arg Ser Thr Cys Pro Phe

260

<210> 2

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggccaacc cctacgagcg cggccccaac ccgaccgacg ccctgctcga agccagcagc 60

ggccccttct ccgtcagcga ggagaacgtc tcccggttga gcgccagcgg cttcggcggc 120

ggcaccatct actacccgcg ggagaacaac acctacggtg cggtggcgat ctcccccggc 180

tacaccggca ctgaggcttc catcgcctgg ctgggcgagc gcatcgcctc ccacggcttc 240

gtcgtcatca ccatcgacac catcaccacc ctcgaccagc cggacagccg ggcagagcag 300

ctcaacgccg cgctgaacca catgatcaac cgggcgtcct ccacggtgcg cagccggatc 360

gacagcagcc gactggcggt catgggccac tccatgggcg gcggcggcac cctgcgtctg 420

gcctcccagc gtcccgacct gaaggccgcc atcccgctca ccccgtggca cctcaacaag 480

aactggagca gcgtcaccgt gccgacgctg atcatcgggg ccgacctcga cacaatcgcg 540

ccggtcgcca cgcacgcgaa accgttctac aacagcctgc cgagctccat cagcaaggcc 600

tacctggagc tggacggcgc aacccacttc gccccgaaca tccccaacaa gatcatcggc 660

aagtacagcg tcgcctggct caagcggttc gtcgacaacg acacccgcta cacccagttc 720

ctctgccccg gaccgcgcga cggactcttc ggcgaggtcg aagagtaccg ctccacctgc 780

ccgttctga 789

<210> 3

<211> 1416

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcagcgccc tcccgaaggt taagctacct gcttctggtg caacaaactc ccatggtgtg 60

acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgca gcaatgctga tctgcgatta 120

ctagcgattc cgacttcatg gagtcgagtt gcagactcca atccggactg agatagggtt 180

tctgggattg gcttaccgtc gccggcttgc agccctctgt ccctaccatt gtagtacgtg 240

tgtagccctg gccgtaaggg ccatgatgac ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 300

tcaccggcgg tctccttaga gttcccacca ttacgtgctg gcaactaagg acaagggttg 360

cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccatgcagca 420

cctgtgttcg agttcccgaa ggcaccgatc catctctgga aagttctcga catgtcaagg 480

ccaggtaagg ttcttcgcgt tgcatcgaat taaaccacat actccaccgc ttgtgcgggc 540

ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg cgaacttaac 600

gcgttagctt cgatactgcg tgccaaattg cacccaacat ccagttcgca tcgtttaggg 660

cgtggactac cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgtgcc tcagtgtcag 720

tgttggtcca ggtagctgcc ttcgccatgg atgttcctcc tgatctctac gcatttcact 780

gctacaccag gaattccgct accctctacc acactctagt cgcccagtat ccactgcagt 840

tcccaggttg agcccagggc tttcacaacg gacttaaacg accacctacg cacgctttac 900

gcccagtaat tccgagtaac gcttgcaccc ttcgtattac cgcggctgct ggcacgaagt 960

tagccggtgc ttattctttg ggtaccgtca tcccaaccgg gtattagcca gctggatttc 1020

tttcccaaca aaagggcttt acaacccgaa ggccttcttc acccacgcgg tatggctgga 1080

tcaggcttgc gcccattgtc caatattccc cactgctgcc tcccgtagga gtctggaccg 1140

tgtctcagtt ccagtgtggc tgatcatcct ctcagaccag ctacggatcg tcgccttggt 1200

gggcctttac cccgccaact agctaatccg acatcggctc attcaatcgc gcaaggtccg 1260

aagatcccct gctttcaccc gtaggtcgta tgcggtatta gcgtaagttt ccctacgtta 1320

tcccccacga cagagtagat tccgatgtat tcctcacccg tccgccactc gccacccaga 1380

gagcaagctc tcctgtgctg ccgttcgact gcatgt 1416

Claims

1.一种含有嗜麦芽寡养单胞菌的菌酶混合制剂，其特征在于，所述菌酶混合制剂含有嗜麦芽寡养单胞菌和角质酶；或者，所述菌酶混合制剂含有嗜麦芽寡养单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌菌株发酵液和角质酶；或者，所述菌酶混合制剂含有嗜麦芽寡养单胞菌菌株培养液和角质酶。

2.如权利要求1所述的菌酶混合制剂，其特征在于，所述嗜麦芽寡养单胞菌保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2019415。

3.如权利要求1或2所述的菌酶混合制剂，其特征在于，所述菌酶混合制剂中，角质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求1-3任一所述的菌酶混合制剂，其特征在于，所述菌酶混合制剂中，嗜麦芽寡养单胞菌菌体活菌数为1-2×10⁹CFU/mL。

5.如权利要求1-4任一所述的菌酶混合制剂，其特征在于，所述菌酶混合制剂中，所述角质酶的酶活为20-50U/mL。

6.权利要求1-5任一所述的菌酶混合制剂在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体为苯二甲酸乙二醇酯。

8.一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1-4任一所述的菌酶混合制剂添加至含有聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的无机盐液体中进行降解。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体为苯二甲酸乙二醇酯。

10.一种可用于降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1-4任一所述菌酶混合制剂。