CN110734881A - 可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯及其中间体的食石油微杆菌 - Google Patents

可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯及其中间体的食石油微杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯及其中间体的食石油微杆菌，属于微生物技术领域。本发明提供了一株可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的食石油微杆菌JWG‑G2，将此食石油微杆菌JWG‑G2以1×108CFU/mL的接种量接种至含有2g/L聚对苯二甲酸乙二醇酯塑料颗粒的无机盐液体培养基中培养5d后，可使聚对苯二甲酸乙二醇酯塑料颗粒部分被降解为羟乙基对苯二甲酸酯和可直接回收利用的对苯二甲酸，可使聚对苯二甲酸乙二醇酯塑料颗粒表面的酯键官能团减少，且使聚对苯二甲酸乙二醇酯塑料颗粒的失重率达5.6％，因此，本发明的食石油微杆菌JWG‑G2在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯中具备极高的应用前景。

Description

可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯及其中间体的食石油微杆菌
技术领域
本发明涉及可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯及其中间体的食石油微杆菌，属于微生物技术领域。
背景技术
随着经济的高速发展，人们对塑料制品的消耗水平显著提高，全球每年的塑料消耗量超3.2亿吨，并且，此塑料消耗量每年以4～6％的速度增长。但是，由于塑料难以降解，因此，全球每年的塑料制品回收利用率仅有14％，这使得塑料垃圾在环境中持续积累，对生态构成了严重的威胁。
聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是乙二醇(Ethylene glycol,EG)和对苯二甲酸(Terephthalic acid,TPA)以酯键依次连接形成的线性大分子。目前，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料制品约占所有塑料制品的60％，相应的，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料垃圾在所有塑料垃圾中也占比较高。因此，降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)对治理塑料垃圾十分关键。
目前，人们依旧停留在使用传统的如酸解、碱解或醇解等的化学降解法或如热解等的物理降解法降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的阶段。但是，化学降解法需要使用大量的化学品，物理降解法则需要高温和高压的设备，这大大增加了聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的治理成本。并且，利用化学降解法降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的过程中会产生大量有毒有害物质，这些有毒有害物质会对生态环境产生较为严重的负面影响，使得聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的降解得不偿失。因此，世界各国仍在积极探索降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的新技术。
生物降解技术是直接通过可降解塑料的菌株降解塑料的技术，由于其具有绿色无污染以及成本低的优势，逐渐成为塑料降解领域的研究热点。例如，公开号为CN102639690A的专利申请文本中记载了一株可降解聚乳酸(PLA)的苍白杆菌属菌株；Zhou等人则发现一株可降解聚羟基脂肪酸酯(PHA)的青霉属菌株(具体可见参考文献：Polymer-plasticsTechnology and Engineering,2009,48(1):58-63)。
然而，相比于同样是C-O键连接的聚羟基脂肪酸酯(PHA)和聚乳酸(PLA)等生物基塑料，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)分子链中含有大量芳香基团，这导致聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)分子链空间位阻大且表面更加疏水，难以被微生物降解。因此，获得可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的菌株仍是一个难点。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯及其中间体的食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)。
[技术方案]
为解决上述技术问题，本发明提供了一株食石油微杆菌(Microbacteriumoleivorans)JWG-G2，其特征在于，所述食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019416，保藏日期为2019年06月03日。
所述食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2是从来源于无锡桃花山垃圾填埋场的土壤样本中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，结果显示与微杆菌属的核酸序列相似度高达99％，将与其相似度高的菌株构建系统进化树(具体可见图1)，结果显示菌株属于微杆菌属的食石油微杆菌，将其命名为食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2。
所述食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2在LB固体培养基上的菌落呈圆隆形凸起，淡金黄色，不透明，表面光滑，湿润有光泽，边缘整齐(具体可见图2)。
本发明还提供了上述食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体为羟乙基对苯二甲酸酯和/或苯二甲酸乙二醇酯。
本发明还提供了一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的方法，所述方法为将上述食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2接种至含有聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的培养基中进行培养。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基为液体培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体为羟乙基对苯二甲酸酯和/或苯二甲酸乙二醇酯。
在本发明的一种实施方式中，上述食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2在含有聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的培养基中的接种量不低于1×108CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的培养基中，聚对苯二甲酸乙二醇酯的含量不超过2g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述含有聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的培养基中，聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的含量不超过0.2g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述含有聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的培养基中，聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的总含量不超过2.2g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基为无机盐培养基。
本发明还提供了一种可用于降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的产品，所述产品中含有上述食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2。
[有益效果]
(1)本发明提供了一株可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2，将此食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2以1×108CFU/mL的接种量接种至含有2g/L聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒的无机盐液体培养基中培养5d后，可使聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒部分被降解为羟乙基对苯二甲酸酯(MHET)和可直接回收利用的对苯二甲酸(TPA)，可使聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒表面的酯键官能团减少，且使聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒的失重率达5.6％，因此，本发明的食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)中具备极高的应用前景。
(2)本发明提供了一株可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)中间体的食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2，将此食石油微杆菌(Microbacteriumoleivorans)JWG-G2以1×108CFU/mL的接种量接种至含有0.2g/L羟乙基对苯二甲酸酯(MHET)的无机盐液体培养基中培养5d后，可使羟乙基对苯二甲酸酯(MHET)部分被降解为可直接回收利用的对苯二甲酸(TPA)，且可使羟乙基对苯二甲酸酯(MHET)的失重率达4.5％，将此食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2以1×108CFU/mL的接种量接种至含有0.2g/L苯二甲酸乙二醇酯(BHET)的无机盐液体培养基中培养5d后，可使苯二甲酸乙二醇酯(BHET)部分被降解为羟乙基对苯二甲酸酯(MHET)和可直接回收利用的对苯二甲酸(TPA)，且可使苯二甲酸乙二醇酯(BHET)的失重率达11.2％，因此，本发明的食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)中间体中具备极高的应用前景。
(3)本发明提供了一株食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2，此食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2可降解淀粉、液化明胶，并且，此食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2具有优良的耐盐性能，可在含有1～9g/LNaCl的LB液体培养基中旺盛生长。
生物材料保藏
一株食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2，分类学命名为Microbacterium oleivorans，已于2019年06月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019416，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1：食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2的系统进化树。
图2：食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2的菌落。
图3：食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2以聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒为唯一营养源时的生长曲线。
图4：聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒表面经食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2处理后的酯键官能团变化情况。
图5：羟乙基对苯二甲酸酯(MHET)经食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2处理后的降解产物。
图6：苯二甲酸乙二醇酯(BHET)经食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2处理后的降解产物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的对苯二酸二甲酯(DET)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒、羟乙基对苯二甲酸酯(MHET)、苯二甲酸乙二醇酯(BHET)以及对苯二甲酸(TPA)购自Sigma公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、琼脂20g，pH 7.0。
LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，pH 7.0。
含有DET的无机盐液体培养基(g/L)：KH2PO40.7 g、K2HPO4·3H2O 0.5g、NH4Cl 2g、MgSO4·7H2O 0.6g、NaCl 0.005g、FeSO4·7H2O 0.001g、ZnSO4·7H2O 0.002g、MnSO4·H2O0.001g、DET 2g。
含有PET的无机盐固体培养基(g/L)：KH2PO40.7 g、K2HPO4·3H2O 0.5g、NH4Cl 2g、MgSO4·7H2O 0.6g、NaCl 0.005g、FeSO4·7H2O 0.001g、ZnSO4·7H2O 0.002g、MnSO4·H2O0.001g、PET塑料颗粒2g、琼脂粉20g。
含有PET的无机盐液体培养基(g/L)：KH2PO40.7 g、K2HPO4·3H2O 0.5g、NH4Cl 2g、MgSO4·7H2O 0.6g、NaCl 0.005g、FeSO4·7H2O 0.001g、ZnSO4·7H2O 0.002g、MnSO4·H2O0.001g、PET2g。
含有PET中间体的无机盐液体培养基(g/L)：KH2PO40.7 g、K2HPO4·3H2O 0.5g、NH4Cl 2g、MgSO4·7H2O 0.6g、NaCl 0.005g、FeSO4·7H2O 0.001g、ZnSO4·7H2O 0.002g、MnSO4·H2O 0.001g、PET中间体(BHET或MHET)0.2g。
无营养源的无机盐固体培养基(g/L)：KH2PO40.7 g、K2HPO4·3H2O 0.5g、NH4Cl 2g、MgSO4·7H2O 0.6g、NaCl 0.005g、FeSO4·7H2O 0.001g、ZnSO4·7H2O 0.002g、MnSO4·H2O0.001g、琼脂粉20g。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒表面官能团变化的检测方法：
将经菌株处理后的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒用去离子水反复清洗3～4次；将清洗完的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒于功率200W、频率58KHz的条件下超声15min；将超声后的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒放入烘箱60℃烘干6h；以未经处理的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒为对照，使用傅里叶变换红外光谱仪检测未经处理的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒表面以及经菌株处理后聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒表面官能团的变化。
降解产物及其含量的检测方法：
标准品处理：分别称取TPA、MHET、BHET的标准品溶于二甲亚砜(DMSO)中制成母液，利用无菌水将母液稀释成0.1mg/mL标准品溶液，用0.22μM的滤头过滤，用注射器注入液相瓶进行HPLC检测；
样品处理：将培养液静置10min，取上清5mL，12000rpm离心8min，用0.22μM的滤头过滤，用注射器注入液相瓶，进行HPLC检测。
失重率的检测方法：
PET塑料颗粒的失重率(％)＝[(m2-m1)÷m2]×100；
m1：经菌株处理后的PET塑料颗粒用去离子水反复清洗3～4次，将清洗完的PET塑料颗粒于功率200W、频率58KHz的条件下超声15min，放入烘箱60℃烘干6h后称重；
m2：经菌株处理前的PET塑料颗粒用去离子水反复清洗3～4次，将清洗完的PET塑料颗粒于功率200W、频率58KHz的条件下超声15min，放入烘箱60℃烘干6h后称重；
PET中间体的失重率(％)＝{[(c1-c2)×v2]÷(c1×v1)}×100；
c1：反应前反应体系中PET中间体的浓度，mg/L；
v1：反应前反应体系中PET中间体的浓度，L；
c1：反应后反应体系中PET中间体的浓度，mg/L；
v1：反应后反应体系中PET中间体的浓度，L。
实施例1：食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)的筛选及鉴定
具体步骤如下：
1、筛选
以来源于无锡市桃花山垃圾填埋场土壤为样本，取1g垃圾场土壤加入9mL含有2g/L DET的无机盐液体培养基，于35℃、180rpm的条件下振荡富集培养48h；接着吸取上述1mL富集液加入新的9mL含有2g/LDET的无机盐液体培养基，相同条件培养10个循环；将培养10个循环后获得的培养液静置15min，取上清1mL依次稀释至10-4、10-5、10-6，取200μL稀释至10-4、10-5、10-6的稀释液均匀涂布于含有2g/L PET的无机盐固体培养基上，置于35℃培养箱中恒温培养至长出菌落；以无营养源的无机盐固体培养基作为对照，挑取菌落于含有2g/LPET的无机盐固体培养基上划线并于35℃的条件下培养，反复几次划线，得到非自养型的纯化菌株，将长势最好的4株非自养型的纯化菌株分别命名为菌株JWG-G2、菌株JWG-G5、菌株JWG-HD2以及菌株JWG-YR2。
2、鉴定
提取菌株JWG-G2、菌株JWG-G5、菌株JWG-HD2以及菌株JWG-YR2的总DNA进行16SrDNA的扩增和测序(由无锡天霖生物科技有限公司完成)，测序结果显示上述4株非自养型的纯化菌株的16S rDNA相似率为100％，可见，上述4株非自养型的纯化菌株均是由同一个菌株的4个单菌落分化而来，因此，选择菌株JWG-G2作为鉴定对象进行下一步鉴定(JWG-G2的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示)；
将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，发现菌株JWG-G2与微杆菌属的16S rDNA序列同源性大于99％，其中，与食石油微杆菌MicrobacteriumoleivoransNBRC103075的16S rDNA序列相似率达99.5％，可见，菌株JWG-G2属于微杆菌属；
将菌株JWG-G2的16S rDNA序列与其相似度高的菌株构建系统进化树(菌株JWG-G2构建得到的系统进化树可见图1)，结果显示菌株JWG-G2与食石油微杆菌MicrobacteriumoleivoransNBRC103075同属于一个分支，可见，菌株JWG-G2属于食石油微杆菌，命名为食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2。
实施例2：食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)的培养
具体步骤如下：
刮取一环实施例1获得的食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2接种至LB固体培养基划线培养，35℃培养36h后，观察其菌落，发现其菌落呈圆隆形凸起，浅红色，不透明，表面光滑，湿润有光泽，边缘整齐(具体可见图2)。
将实施例1获得的食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2经革兰氏染色后于显微镜下观察，发现为革兰氏阳性菌。
刮取一环实施例1获得的食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2接种至pH分别为3～10的LB液体培养基中培养，于35℃培养36h后，通过酶标仪检测培养液中的OD600值，发现其适宜生长pH为6.5～8.5，最适生长pH为7。
刮取一环实施例1获得的食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2接种至pH为7的LB液体培养基中培养，分别于20～50℃培养36h后，通过酶标仪检测培养液中的OD600值，发现其适宜生长温度为25～40℃，最适生长温度为35℃。
刮取一环实施例1获得的食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2接种至pH为7的LB液体培养基中培养，于35℃培养36h，期间，通过酶标仪检测培养液中的OD600值，发现其繁殖速度快，培养14～16h即可进入生长稳定期。
实施例3：不同微杆菌及食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)对聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒的降解能力
具体步骤如下：
由于食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2属于微杆菌属，微杆菌属可能是潜在的PET塑料颗粒降解菌株来源属之一，故收集与食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2亲缘关系近的18株微杆菌与食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2共同作为测试菌株。
挑取实施例1获得的食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2以及18株微杆菌的单菌落，分别接入100mL的LB液体培养基中，于35℃、180rpm的条件下震荡培养24h，得到种子液A；将种子液A以10％(v/v)的接种量转接到100mL新鲜的LB液体培养基中，于35℃、180rpm的条件下震荡培养24h，得到培养液A；将培养液A于8000rpm的条件下离心10min，收集菌体；将菌体用无机盐培养基洗涤2次后制成OD600＝1.0的菌悬液作为种子液B；以未接种种子液B的含有2g/L PET的无机盐液体培养基为对照组，将种子液B以10％(v/v)的接种量接种至含有2g/L PET的无机盐液体培养基中，于35℃、180rpm的条件下震荡培养16d，期间，每隔1d取样一次，测定培养液B的OD600，得到食石油微杆菌(Microbacteriumoleivorans)JWG-G2以及18株微杆菌以聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒为唯一营养源时的生长曲线(食石油微杆菌JWG-G2以及18株微杆菌经含有2g/L PET的无机盐液体培养基培养前后的OD600变化可见表1，食石油微杆菌JWG-G2的生长曲线可见图3)，5d时，将培养液B中的PET塑料颗粒取出，检测其表面官能团结构的变化(食石油微杆菌JWG-G2以及18株微杆菌培养获得的培养液B中的PET塑料颗粒表面官能团结构的变化可见表2，食石油微杆菌JWG-G2培养获得的培养液B中的PET塑料颗粒表面官能团结构的变化可见图4)并检测其失重率(食石油微杆菌JWG-G2以及18株微杆菌培养获得的培养液B中的PET塑料颗粒的失重率可见表2)，同时，检测培养液B中PET塑料颗粒降解产物MHET和TPA的含量(食石油微杆菌JWG-G2以及18株微杆菌培养获得的培养液B中PET塑料颗粒降解产物MHET和TPA的含量可见表2)。
由表1和图3可以看出，以PET塑料颗粒为唯一营养源时，食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2在2～7d进入对数生长期，随后逐渐进入稳定期，缓慢增长直至平衡；而18株微杆菌的OD600无显著变化(误差范围内±0.04)。可见，仅有食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2可以PET塑料颗粒为唯一营养源生长繁殖。
由表2和图4可以看出，经食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2处理5d后，PET塑料颗粒部分被降解为羟乙基对苯二甲酸酯和可直接回收利用的对苯二甲酸，PET塑料颗粒表面的酯键官能团被破坏(在1000～1300cm-1之间有两个特征峰，在1700～1750cm-1之间有一个特征峰)，且PET塑料颗粒失重5.6％；而经18株微杆菌处理5d后，PET塑料颗粒未见明显变化。可见，仅有食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2能够降解PET塑料颗粒。
表1食石油微杆菌JWG-G2以及18株微杆菌经含有2g/L PET的无机盐液体培养基培养前后的OD600变化
Figure BDA0002282684220000081
Figure BDA0002282684220000091
其中，食石油微杆菌JWG-G2以及18株微杆菌经含有2g/L PET的无机盐液体培养基培养前后的OD600变化即食石油微杆菌JWG-G2以及18株微杆菌经含有2g/L PET的无机盐液体培养基培养后的OD600值减去食石油微杆菌JWG-G2以及18株微杆菌经含有2g/L PET的无机盐液体培养基培养前后的OD600值。
表2食石油微杆菌JWG-G2以及18株微杆菌培养获得的培养液B中PET塑料颗粒降解产物MHET和TPA的含量、PET塑料颗粒表面官能团结构的变化和PET塑料颗粒的失重率
Figure BDA0002282684220000092
Figure BDA0002282684220000101
其中，“+”：检测为阳性；“-”：检测为阴性。
实施例4：食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2对聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料颗粒中间体的降解能力
具体步骤如下：
挑取实施例1获得的食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2以及18株微杆菌的单菌落，分别接入100mL的LB液体培养基中，于35℃、180rpm的条件下震荡培养24h，得到种子液A；将种子液A以10％(v/v)的接种量转接到100mL新鲜的LB液体培养基中，于35℃、180rpm的条件下震荡培养24h，得到培养液A；将培养液A于8000rpm的条件下离心10min，收集菌体；将菌体用无机盐培养基洗涤2次后制成OD600＝1.0的菌悬液作为种子液B；将种子液B以10％(v/v)的接种量分别接种至含有0.2g/L MHET或0.2g/L BHET(MHET和BHET均为PET中间体)的无机盐液体培养基中，于35℃、180rpm的条件下震荡培养5d，获得培养液B。
将培养液B中的MHET或BHET取出并检测其失重率，同时，利用HPLC分析培养液B中成分变化(分析结果见图5-6)。
由失重率的检测结果可知，经食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2处理5d后，MHET的失重率达4.5％、BHET的失重率达11.2％，可见，食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2可降解MHET和BHET。
由图5可知，经食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2处理5d后，MHET部分被降解为可直接回收利用的对苯二甲酸(TPA)且培养液B中TPA的含量为8.25mg/L，这进一步证明了食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2可降解MHET。
由图6可知，经食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2处理5d后，BHET部分被降解为MHET和可直接回收利用的TPA且培养液B中MHET和TPA的含量分别为16.56mg/L、3.81mg/L，这进一步证明了食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2可降解BHET。
实施例5：食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2的耐盐能力
具体步骤如下：
挑取实施例1获得的食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2的单菌落接入100mL的LB液体培养基中，于35℃、180rpm条件下震荡培养24h，得到种子液A；将种子液A以10％(v/v)的接种量转接到100mL新鲜的LB液体培养基中，于35℃、180rpm的条件下震荡培养72h，得到培养液A；将培养液A于8000rpm的条件下离心10min，收集菌体；将菌体用无机盐培养基洗涤2次后制成OD600＝1.0的菌悬液作为种子液B；将种子液B以10％(v/v)的接种量分别接种至含有不同浓度NaCl(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10g/L)的LB液体培养基中，于35℃、180rpm的条件下震荡培养5d，获得培养液B。
由测定培养液B的OD600结果发现，食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2在含有1～9g/LNaCl的LB液体培养基中生长5d后获得的培养液B中的OD600增加量分别为0.11、0.12、0.18、0.2、0.23、0.18、0.15、0.1、0.1。可见，食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2具有优良的耐盐性能。
实施例6：食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2降解淀粉、液化明胶的能力
具体步骤如下：
依据参考文献“微生物学杂志,2014,34(01):28-32；唐妤,西南大学,2007”采用平板透明圈法检测食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2对淀粉降解、明胶液化的能力。
由检测结果可知，食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)在检测平板上生长5d后，平板表面出现明显的水解透明圈，其中，淀粉、明胶透明圈直径分别达到1.1cm、1.6cm。可见，食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)JWG-G2具备淀粉降解、明胶液化的能力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯及其中间体的食石油微杆菌
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1384
<212> DNA
<213> 食石油微杆菌（Microbacterium oleivorans）
<400> 1
agtcgaacgg tgaagcccag cttgctgggt ggatcagtgg cgaacgggtg agtaacacgt 60
gagcaatctg cccctgactc tgggataagc gctggaaacg gtgtctaata ctggatatga 120
gctgcgaccg catggtcagt agttggaaag atttttcggt cagggatgag ctcgcggcct 180
atcagcttgt tggtgaggta atggctcacc aaggcgtcga cgggtagccg gcctgagagg 240
gtgaccggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300
aatattgcac aatgggcgga agcctgatgc agcaacgccg cgtgagggat gacggccttc 360
gggttgtaaa cctcttttag cagggaagaa gcgaaagtga cggtacctgc agaaaaagcg 420
ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg cgcaagcgtt atccggaatt 480
attgggcgta aagagctcgt aggcggtttg tcgcgtctgc tgtgaaatcc cgaggctcaa 540
cctcgggcct gcagtgggta cgggcagact agagtgcggt aggggagatt ggaattcctg 600
gtgtagcggt ggaatgcgca gatatcagga ggaacaccga tggcgaaggc agatctctgg 660
gccgtaactg acgctgagga gcgaaagggt ggggagcaaa caggcttaga taccctggta 720
gtccaccccg taaacgttgg gaactagttg tggggtccat tccacggatt ccgtgacgca 780
gctaacgcat taagttcccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat 840
tgacggggac ccgcacaagc ggcggagcat gcggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc 900
ttaccaaggc ttgacatata cgagaacggg ccagaaatgg tcaactcttt ggacactcgt 960
aaacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1020
acgagcgcaa ccctcgttct atgttgccag cacgtaatgg tgggaactca tgggatactg 1080
ccggggtcaa ctcggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgtcttg 1140
ggcttcacgc atgctacaat ggccggtaca aagggctgca ataccgtgag gtggagcgaa 1200
tcccaaaaag ccggtcccag ttcggattga ggtctgcaac tcgacctcat gaagtcggag 1260
tcgctagtaa tcgcagatca gcaacgctgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac 1320
cgcccgtcaa gtcatgaaag tcggtaacac ctgaagccgg tggcctaacc cttgtggagg 1380
gagc 1384

Claims (10)

1.一株食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)，其特征在于，所述食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019416，保藏日期为2019年06月03日。
2.权利要求1所述食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体为羟乙基对苯二甲酸酯和/或苯二甲酸乙二醇酯。
4.一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)接种至含有聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的培养基中进行培养。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体为羟乙基对苯二甲酸酯和/或苯二甲酸乙二醇酯。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，权利要求1所述食石油微杆菌(Microbacterium oleivorans)在含有聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的培养基中的接种量不低于1×108CFU/mL。
7.如权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，所述含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的培养基中，聚对苯二甲酸乙二醇酯的含量不超过2g/L。
8.如权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，所述含有聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的培养基中，聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的含量不超过0.2g/L。
9.如权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，所述含有聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的培养基中，聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的总含量不超过2.2g/L。
10.一种可用于降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯中间体的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述食石油微杆菌(Microbacteriumoleivorans)。
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