CN111743922A - 一种提高益生菌在鼻腔中的定植和活性的组合物及在鼻腔护理中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高益生菌在鼻腔中的定植和活性的组合物及在鼻腔护理中的应用，该组合物包括以下成分：透明质酸或其盐0.1‑10份，β‑葡聚糖寡糖0.1‑5份，维生素C 1‑3份。该组合物进一步与益生菌等复配，可以得到鼻腔护理组合物。本发明通过透明质酸或其盐、β‑葡聚糖寡糖、维生素C的复配，能够很好的促进益生菌在鼻腔中的定植和存活，可以在保持鼻腔湿润的同时改善鼻腔中的微生态，有利于鼻腔健康和炎症缓解。

Description

一种提高益生菌在鼻腔中的定植和活性的组合物及在鼻腔护 理中的应用

技术领域

本发明涉及一种提高益生菌在鼻腔中的定植和活性的组合物及在鼻腔护理中的应用，属于鼻腔护理技术领域。

背景技术

鼻炎即鼻腔炎性疾病，是病毒、细菌、变应原、各种理化因子以及某些全身性疾病引起的鼻腔黏膜的炎症。鼻炎的治疗方法主要分为药物治疗、手术治疗以及洗鼻清洗治疗。目前的鼻腔护理液主要是生理盐水或生理海水等，用于清洗附着在鼻粘膜上的病菌、灰尘和过敏源物质，稀释鼻腔干燥分泌物，保持鼻粘膜湿润，提高鼻纤毛运动功能，提高鼻纤毛清除率。

最新研究表明，正常人群与鼻炎患者的鼻腔微生态菌群存在差别，这提示鼻腔微生态可能与鼻炎等的发生发展有关。而传统的鼻腔护理液仅能无差别的清除鼻黏膜上的细菌，既包括致病菌，也包括一些有益菌，这可能与鼻炎的治疗背道而驰。

专利CN109512854A公开了一种用于预防和治疗过敏性鼻炎的益生菌组合物及基于其的鼻用制剂和制备方法。该专利以益生菌作为有效成分，以复合稳定剂为基质，涂抹于鼻腔内壁，在鼻腔内能形成一层保护膜，有效阻断吸入性过敏原(如空气中的花粉等)通过鼻腔进入人体，从而消除或缓解过敏症状；同时，含有的益生菌组合物可更迅速、更直接的在鼻部粘膜发挥免疫调节的作用。

专利CN107582573A公开了一种益生菌滴剂及其制备方法。该方法制备的益生菌滴剂包括1-2.5% 的不饱和脂肪酸、85-90% 植物油、1-7% 磷脂油、以及2-8%益生菌悬浊液，所述益生菌悬浊液包括丙三醇、吐温80以及益生菌菌体，该益生菌滴剂可以改善吸烟人群口腔和鼻子中的微生态，提高吸烟人群的抵抗力。

上述含益生菌的鼻腔护理液虽然改善了鼻腔的微生态，然而却没能保持鼻黏膜的湿润，不利于缓解鼻炎的症状，并且这些专利中也没有提及益生菌的存活率或定植率，益生菌容易被鼻纤毛清除，在鼻腔内的定植率低，益生菌的存活率和定植率才是益生菌发挥作用的先行因素。

专利CN106890197A公开了一种定植益生菌制剂及其应用和药物，该专利通过表面活性剂的加入增加了益生菌的定植率，但是表面活性剂的存在对呼吸道不利，可能会扰乱下呼吸道表面活性物质的正常浓度，且使用不便，益生菌存活时间短。

因此，寻找一种安全、益生菌存活率和定植率高、能够保持鼻粘膜湿润的鼻腔护理产品具有较大的市场需求。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种提高益生菌在鼻腔中的定植和活性的组合物，该组合物通过透明质酸或其盐、β-葡聚糖寡糖和维生素C的复配，能提高益生菌在鼻腔中的定植率和存活率。

本发明提高益生菌在鼻腔中的定植和活性的组合物包括以下重量份的组分：透明质酸或其盐 0.1-10份，β-葡聚糖寡糖 0.1-5份，维生素C 1-3份。

优选的，上述组合物包括以下重量份的组分：透明质酸或其盐 0.3-1份，β-葡聚糖寡糖 1-2份，维生素C 1.5-2.5份。

透明质酸是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位通过糖苷键连接成的多糖，具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。透明质酸在鼻腔护理中也有应用的报道，但是有试验研究表明，透明质酸或其盐对细菌具有一定的抑制作用，因此不利于与益生菌同时存在在鼻腔护理产品中。

针对上述问题，发明人进行了大量的研究和实验，最终发现，当特定分子量的透明质酸或其盐与β-葡聚糖寡糖和维生素C进行复配使用时，不仅会消除对益生菌的抑制作用，并且还能提高益生菌的存活率和定植率，可以改善鼻腔中的微生态；同时因为透明质酸或其盐的保湿性能，提高了鼻腔的润湿性，可以很好的改善或缓解鼻腔干燥等不适症状，有利于鼻腔健康和炎症缓解。

进一步的，所述透明质酸或其盐的分子量为10wDa（wDa表示万Da，下同）-100wDa，优选为50wDa-80wDa。所述透明质酸盐是透明质酸医学上可接受的盐，例如钠盐、钾盐、钙盐、锌盐等。

本发明还提供了一种含透明质酸和益生菌的鼻腔护理组合物，该鼻腔护理组合物含有透明质酸或其盐、益生菌、β-葡聚糖寡糖和维生素C等成分，透明质酸或其盐、β-葡聚糖寡糖和维生素C的复配解决了透明质酸或其盐对益生菌的抑制作用，对益生菌在鼻腔的定植和活性保持有一定的保护作用，能维持鼻腔的微生态稳定。同时透明质酸或其盐等成分对鼻腔有很好的润湿作用，能有效缓解鼻腔干燥等不适症状，有利于鼻腔炎症的缓解和治疗。

进一步的，上述含透明质酸和益生菌的鼻腔护理组合物包括以下质量百分含量的有效组分：透明质酸或其盐 0.1-10%，β-葡聚糖寡糖 0.1-5%，益生菌 10⁷-10⁹CFU/mL，维生素C 1-3%。在该组合物中，透明质酸或其盐 、β-葡聚糖寡糖、维生素C三者的组合对益生菌的存活率和定植率有明显的促进作用，有利于鼻炎症状的消除或缓解。

进一步的，上述鼻腔护理组合物中，除了上述有效组分外，还可以含有一些其他的对鼻腔护理有作用的组分，还可以含有一些对使用、成型有利的其他辅助组分，例如氯化钠、pH调节剂、水等。氯化钠、pH调节剂的用量可以根据实际情况进行调整，例如氯化钠作为渗透调节剂，其用量能够使鼻腔护理组合物比较好的渗透入鼻腔皮肤中，pH调节剂的用量使鼻腔护理组合物的pH符合鼻腔的最佳pH要求。

进一步的，所述氯化钠在鼻腔护理组合物中的含量为0.9-1wt%，所述鼻腔护理组合物的pH为5.5-7.5，优选为6.0-7.0。

在本发明某一具体实施方式中，所述鼻腔护理组合物由以下质量百分含量的有效组分：透明质酸或其盐 0.1-10%，β-葡聚糖寡糖 0.1-5%，益生菌 10⁷-10⁹CFU/mL，维生素C1-3%，NaCl 0.9-1%，pH调节剂调整pH为5.5-7.5，优选调整pH为6.0-7.0，水补足100%。

进一步的，上述鼻腔护理组合物中，所述透明质酸或其盐的分子量为10wDa-100wDa，优选为50wDa-80wDa。所述透明质酸盐是透明质酸医学上可接受的盐，例如钠盐、钾盐、钙盐、锌盐等。

进一步的，鼻腔的有益菌群有乳杆菌、链球菌、假白喉棒状杆菌等，主要是乳杆菌。鼻黏膜上的乳杆菌可以通过拮抗、占位、分泌抗菌素等手段抑制有害菌，防止致病菌在鼻腔的过度增长。部分乳杆菌（如嗜酸乳杆菌）还可以与鼻黏膜交互作用，形成合理的黏膜免疫应答，从而防治病毒、细菌、真菌等有害微生物引起的各种疾病以及过敏。本发明选择的益生菌为鼻腔的有益菌，例如乳杆菌、链球菌、假白喉棒状杆菌等，优选为乳杆菌。其中，乳杆菌可以包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、发酵乳杆菌等类型，优选为嗜酸乳杆菌。

进一步的，上述鼻腔护理组合物中，益生菌以静止状态或芽孢状态的形式加入，优选为静止状态。

进一步的，本发明还提供了上述含透明质酸和益生菌的鼻腔护理组合物的制备方法，该方法包括以下步骤：

（1）将透明质酸溶于水中，然后加入β-葡聚糖寡糖、氯化钠、维生素C，搅拌溶解，调节溶液pH；

（2）向上述溶液中加入益生菌，得到含透明质酸和益生菌的鼻腔护理组合物。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过透明质酸或其盐、β-葡聚糖寡糖、维生素C 的复配，能够很好的促进益生菌在鼻腔中的定植和存活。

2、将透明质酸或其盐、β-葡聚糖寡糖、维生素C、益生菌进行复配用于鼻腔护理，益生菌定植率和存活率高，能维持鼻腔的微生态稳定；此外，透明质酸或其盐能有效保持鼻腔湿润，有效缓解鼻腔干燥等不适症状，有利于鼻腔健康和炎症的缓解和治疗。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述说明仅是示例性的，并不对本发明保护范围进行限制。

下述实施例中，所用材料、试剂、菌种如无特别说明，均为市购产品。

实验例1 研究不同成分的组合物对益生菌的定植和存活促进作用

配制不同的提高益生菌在鼻腔中的定植和活性的组合物。

各有效成分、用量如下表1所示，制备方法如下：

将透明质酸溶解于100ml双蒸水中，加入β-葡聚糖寡糖、维生素C，搅拌溶解，用0.22um的滤膜过滤除菌，冻干得到提高益生菌在鼻腔中的定植和活性的组合物。

对上述组合物对益生菌的存活和定植影响进行验证。

、益生菌存活率

将低温保存的嗜酸乳杆菌取出，连续传代两次进行菌种活化。将活化好的菌种接到MRS培养基中，接种量为4%，作为对照组；实验组将活化好的菌种接种到分别含有0.1%实施例1-5和对比例1-6的样品的MRS培养基中，接种量为4%。将所有培养基置于恒温培养箱中，在37℃下培养，分别于0h、4h、8h、12h、16h、20h、28h、36h取样测定600nm处的OD值，OD值越大说明培养基中的活菌数量越多，结果如表2所示。

、益生菌定植率（粘附性）

采用RPMI2650细胞作为鼻腔上皮细胞模型，进行嗜酸乳杆菌的粘附性试验。RPMI2650细胞采用DMEM（Dulbecco’smodified Eagle’s minimal essential medium）培养液培养，并添加10% (V/V)热灭活（30 min, 56℃）的胎牛血清，1% (V/V)青链霉素。细胞于CO₂ 培养箱（5% CO₂和95%空气）中，37℃培养，1-2 d 换液一次。用胰酶将培养瓶中的细胞消化转移到12 孔细胞培养板中，37℃条件下于CO₂ 培养箱恒温培养至长成单层细胞。

将嗜酸乳杆菌活化两代，离心收集菌体，用无菌PBS 洗2次。对照组将菌体重悬在不含胎牛血清、不含抗生素的DMEM 培养液中，得对照组菌悬液。实验组将菌体重悬在分别含0.1%实施例1-5和对比例1-6的样品的DMEM 培养液中，得实验组菌悬液。同时，用无菌PBS洗RPMI2650细胞培养板2 次，然后加入1 mL 菌悬液，培养1 h后用无菌PBS洗涤4 次，洗去未粘附的菌体，加入1mL 1%（V/V）Triton×100，使粘附的菌体同细胞分离，吹打混匀，梯度稀释平板计数法计粘附细菌数，结果如下表3所示。

从上述实验结果可以看出，实施例1-5的组合物对益生菌的存活率以及益生菌在鼻腔上皮细胞上的定植均有很好的促进作用，而对比例的组合物对益生菌定植率的提高作用明显低于实施例，对益生菌存活率的提高几乎没有作用甚至有反作用。

实验例2 研究不同的鼻腔护理液对鼻腔的护理效果

将上述实验例1中提到的提高益生菌在鼻腔中的定植和活性的组合物与益生菌及其他成分混合，配成鼻腔护理液，方法如下：

1、将透明质酸溶解于100ml双蒸水中，加入β-葡聚糖寡糖、维生素C和NaCl，搅拌溶解，用0.22um的滤膜过滤除菌，调节溶液pH为6.0-7.0；

2、将嗜酸乳杆菌培养至静止期，计算活菌数量，离心得到益生菌菌体；

3、将益生菌菌体用上述步骤1的溶液溶解，使益生菌含量为10⁸CFU/mL，最终保证溶液pH为6.0-7.0，得不同的鼻腔护理液。鼻腔护理液中各成分用量如下表4所示：

通过下述小鼠实验验证各鼻腔护理液对鼻炎的治疗效果

鼻炎的治愈率

1、鼻炎小鼠造模

将120只小鼠随机分成12组，在无菌条件下，用卵清蛋白构建过敏性鼻炎小鼠模型。将1mg卵清蛋白+10mg氢氧化铝溶于1mL生理盐水中，首先在1、5、14、21天通过腹膜内注射到小鼠中，再从第22天开始直到第35天，用5mg/mL的卵清蛋白溶液滴鼻，建立鼻炎小鼠模型。

、鼻炎小鼠干预治疗

12组小鼠分为11组实验组和1组对照组。11组实验组分别于造模完成后给予上述11种鼻腔护理液滴鼻，对照组给予生理盐水滴鼻，每隔6h给药一次，7d后进行效果分析。

、试验结果

3.1鼻部症状评分

干预治疗前，记录下20分钟内实验小鼠打喷嚏和鼻摩擦的次数，评估致敏小鼠早期过敏反应。实施干预治疗后，记录各组小鼠20分钟内打喷嚏和鼻摩擦的次数，根据表5的计分标准进行鼻炎症状评分，结果见表6。

3.2 鼻黏膜组织免疫组织化学分析

切断小鼠头部，在室温中用10%中性福尔马林固定24h。固定结束后，在8.8%甲酸中脱钙6天后再用石蜡包埋，厚度为4μm进行石蜡切片，之后使用苏木精和伊红染色。用400倍显微镜计算从颌骨鼻甲骨延伸到外侧壁的鼻黏膜下层的嗜伊红细胞的数量，结果如下表7所示。

从上述实验结果可以看出，实施例1-5的鼻腔护理液对鼻炎症状以及鼻腔炎症有很好的治疗缓解效果，效果明显优于各对比例的鼻腔护理液。

实验例3 益生菌类型筛选

1、样品制备：

1.1、将0.5g分子量70wDa的透明质酸溶解于100ml双蒸水中，加入1.5gβ-葡聚糖寡糖、2g维生素C和0.9gNaCl，搅拌溶解，用0.22um的滤膜过滤除菌，调节溶液pH为6.0-7.0；

1.2、将链球菌和假白喉棒状杆菌分别培养至静止期，计算活菌数量，离心得到益生菌菌体；

1.3、将链球菌菌体和假白喉棒状杆菌菌体分别用上述步骤1.1的溶液溶解，使益生菌含量为10⁸CFU/mL，最终保证溶液pH为6.0-7.0，得不同的鼻腔护理液。

2、实验方法：

按照实验例2中的方法进行小鼠造模和干预治疗，7d后对小鼠的鼻炎症状进行评分，结果如下表8所示。

从上表结果可以看出，链球菌和假白喉棒状杆菌作为益生菌用于本发明的鼻腔护理液中也可以很好地缓解鼻炎症状。与链球菌和假白喉棒状杆菌相比，嗜酸乳杆菌表现出更优异的对鼻炎症状的缓解作用。

实验例4 菌种状态筛选

按照实验例2中实施例5的配方配制鼻腔护理液，不同的是：将静止期的嗜酸乳杆菌替换成芽孢状态的嗜酸乳杆菌。

按照实验例2中的方法进行小鼠造模和干预治疗，7d后对小鼠的鼻炎症状进行评分，结果显示，造模完成后小鼠的鼻炎症状评分为8分，干预治疗7d后，鼻炎症状评分为2分。

从该实验结果可以看出，芽孢状态的嗜酸乳杆菌作为益生菌用于本发明的鼻腔护理液中，也能很好的缓解鼻炎症状。与芽孢状态的乳杆菌相比，静止期嗜酸乳杆菌表现出更优异的对鼻炎症状的缓解作用。

Claims (10)

1.一种提高益生菌在鼻腔中的定植和活性的组合物，其特征是包括以下重量份的组分：透明质酸或其盐 0.1-10份，β-葡聚糖寡糖 0.1-5份，维生素C 1-3份。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征是：所述透明质酸或其盐的分子量为10wDa-100wDa，优选为50wDa-80wDa。

3.一种含透明质酸和益生菌的鼻腔护理组合物，其特征是包括以下质量百分含量的有效组分：透明质酸或其盐 0.1-10%，β-葡聚糖寡糖 0.1-5%，益生菌 10⁷-10⁹CFU/mL，维生素C1-3%。

4.根据权利要求3所述的鼻腔护理组合物，其特征是：还包括氯化钠、pH调节剂和水；优选的，氯化钠的含量为0.9-1wt%。

5.根据权利要求3或4所述的鼻腔护理组合物，其特征是：所述透明质酸或其盐的分子量为10wDa-100wDa，优选为50wDa-80wDa。

6.根据权利要求3所述的鼻腔护理组合物，其特征是：所述益生菌包括乳杆菌、链球菌或假白喉棒状杆菌，优选为乳杆菌。

7.根据权利要求6所述的鼻腔护理组合物，其特征是：所述乳杆菌包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、唾液乳杆菌或发酵乳杆菌，优选为嗜酸乳杆菌。

8.根据权利要求3、6或7所述的鼻腔护理组合物，其特征是：所述益生菌为静止状态或芽孢状态，优选为静止状态。

9.根据权利要求3、4、6或7所述的鼻腔护理组合物，其特征是：其pH为5.5-7.5，优选为6.0-7.0。

10.一种权利要求3-9中任一项所述的含透明质酸和益生菌的鼻腔护理组合物的制备方法，其特征是包括以下步骤：

（1）将透明质酸溶于水中，然后加入β-葡聚糖寡糖、氯化钠、维生素C，搅拌溶解，调整pH；

（2）向上述溶液中加入益生菌，得到含透明质酸和益生菌的鼻腔护理组合物。