CN111718430A - 一种艾蒿多糖及其制备方法和美白、增加皮肤弹性用途 - Google Patents

一种艾蒿多糖及其制备方法和美白、增加皮肤弹性用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种艾蒿多糖及其制备方法和美白、增加皮肤弹性用途。本发明提供了一种艾蒿多糖EH‑2,SEM显示其规则度较高,均一性较好;活性测试显示该多糖具有如下活性:艾蒿多糖EH‑2为一种有效的酪氨酸酶抑制剂,可以抑制酪氨酸酶活性,进而抑制黑色素合成,具有美白活性;艾蒿多糖EH‑2可以有效提高人皮肤成纤维细胞中Elasticin蛋白含量,具有提高人皮肤弹性的作用。因此,艾蒿多糖EH‑2可以用于制备美白和/或增加皮肤弹性的化妆品。

Description

一种艾蒿多糖及其制备方法和美白、增加皮肤弹性用途
技术领域
本发明属于化妆品领域,涉及植物多糖及在化妆品中的应用,具体涉及一种艾蒿多糖及其制备方法和美白、增加皮肤弹性用途。
背景技术
成分作为化妆品中有利的“武器”,受到了消费者和品牌的重视。在当下的化妆品市场,凡是被消费者喜爱的产品,配方中几乎都有时下最热门成分的踪影。比如,美白化妆品中都含有具有美白效果的成分。
据全球市场研究咨询公司英敏特发布的“2018护肤品四大趋势”显示,“纯净、安全、天然”的护肤品日益受到消费者的关注。不少消费者认为,天然有机的美容、个护产品比主流产品更安全,所以天然成分将会受到消费者的热捧。
艾蒿Artemisia argyi Lévl.etVant.又名艾草、苦艾、蕲艾、灸草等,为菊科蒿属多年生草本或半灌木状植物,主要分布于朝鲜半岛、日本、蒙古、俄罗斯以及我国的东北、西北、华北、华东等地,为我国传统中药,具有多种活性。
市面上已经有多种以艾蒿中天然成分作为活性添加剂的化妆品,并且开发价值高。
发明内容
本发明是为了提供一种艾蒿多糖及其制备方法和美白、增加皮肤弹性用途。
本发明技术方案如下:
一种艾蒿多糖,由如下步骤制备:
步骤S1,脱脂:将干燥的艾蒿叶粉碎后用石油醚热回流脱脂;
步骤S2,提取:将脱脂并挥干溶剂的艾蒿叶用蒸馏水加热提取,过滤,收集滤液减压浓缩,离心取上清液;
步骤S3,脱色:取离心后的上清液加入活性炭搅拌脱色,离心收集上清液;
步骤S4,醇沉:向脱色离心后的上清液中加入3倍体积无水乙醇,混合并于4℃过夜,离心收集醇沉物,蒸馏水复溶后浓缩至原体积的1/2;
步骤S5,脱蛋白:向浓缩液中加入1/2体积的Sevage试剂,剧烈震荡,移入分液漏斗中静置,弃去中间与下层物质,多次重复上述工艺至观察到无明显的中间蛋白层;
步骤S6,除杂:脱除蛋白的多糖溶液浓缩并去除有机试剂后,透析,再浓缩、冻干,得粗多糖;
步骤S7,阴离子交换柱层析:将经预处理的50g DEAE-Sepharose Fast Flow用玻璃棒引流入层析柱(1.6cm×30cm),去离子水以12mL/min流速冲柱5min,再调流速至8mL/min,平衡10h以上;将10mL 5mg/mL粗多糖过0.45μm水系一次性针头滤器;上样后,先用去离子水洗脱除杂,流速2mL/min,洗脱200mL,再用0.5mol/LNaCl溶液洗脱,流速2mL/min,收集0.5mol/LNaCl溶液洗脱液200mL,透析、浓缩、冻干,即得艾蒿多糖EH-2。
优选地,步骤S3中,活性炭用量为0.2%w/v,脱色温度为75℃,脱色时间为30min。
优选地,步骤S5中,Sevage试剂由氯仿和正丁醇按体积比4:1混合而成。
优选地,步骤S6中透析48h,并间隔12h更换一次蒸馏水。
上述艾蒿多糖的美白用途。
上述艾蒿多糖的增加皮肤弹性用途。
上述艾蒿多糖用于制备美白和/或增加皮肤弹性的化妆品的用途。
优选地,所述化妆品包括洗面奶、面霜、手霜、乳液、面膜等。
有益技术效果:
本发明提供了一种艾蒿多糖EH-2,SEM显示其规则度较高,均一性较好;活性测试显示该多糖具有如下活性:1、艾蒿多糖EH-2为一种有效的酪氨酸酶抑制剂,可以抑制酪氨酸酶活性,进而抑制黑色素合成,具有美白活性;2、艾蒿多糖EH-2可以有效提高人皮肤成纤维细胞中Elasticin蛋白含量,具有提高人皮肤弹性的作用。因此,艾蒿多糖EH-2可以用于制备美白和/或增加皮肤弹性的化妆品。
附图说明
图1为艾蒿多糖EH-2的SEM图;
图2为不同浓度艾蒿多糖EH-2和阳性对照对酪氨酸酶的抑制率;
图3为人皮肤成纤维细胞中Elasticin蛋白的Western blot测定结果;
具体实施方式
下面通过具体的实施例详细介绍本发明实质性内容,但不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1:艾蒿多糖的制备
一、试验材料
原料为干燥的艾蒿叶,艾蒿叶为菊科蒿属艾蒿Artemisia argyi Lévl.etVant.的叶。
活性炭为常规的脱色用活性炭粉,化学试剂均为常规试剂。
二、方法和结果
制备步骤如下:
步骤S1,脱脂:将干燥的艾蒿叶粉碎后用石油醚热回流脱脂,每公斤艾蒿叶使用10L石油醚脱脂2次,每次1.5h;
步骤S2,提取:将脱脂并挥干溶剂的艾蒿叶用蒸馏水照液料质量比20:1于80℃提取2次,每次3h;收集滤液并在60℃减压浓缩,以3000r/min的转速离心15min后取上清液;
步骤S3,脱色:取离心后的上清液加入活性炭搅拌脱色,离心收集上清液;其中,活性炭用量为0.2%w/v,脱色温度为75℃,脱色时间为30min;
步骤S4,醇沉:向脱色离心后的上清液中加入3倍体积无水乙醇,混合并于4℃过夜,离心收集醇沉物,蒸馏水复溶后浓缩至原体积的1/2;
步骤S5,脱蛋白:向浓缩液中加入1/2体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇=4:1,v/v),剧烈震荡20min,移入分液漏斗中静置20min,弃去中间与下层物质,多次重复上述工艺至观察到无明显的中间蛋白层;
步骤S6,除杂:脱除蛋白的多糖溶液浓缩并去除有机试剂后,透析48h,并间隔12h更换一次蒸馏水,从而除去样液中的盐类及小分子物质,再浓缩、冻干,得粗多糖;
步骤S7,阴离子交换柱层析:将经预处理的50g DEAE-Sepharose Fast Flow用玻璃棒引流入层析柱(1.6cm×30cm),去离子水以12mL/min流速冲柱5min,再调流速至8mL/min,平衡10h以上;将10mL 5mg/mL粗多糖过0.45μm水系一次性针头滤器;上样后,先用去离子水洗脱除杂,流速2mL/min,洗脱200mL,再用0.5mol/LNaCl溶液洗脱,流速2mL/min,收集0.5mol/LNaCl溶液洗脱液200mL,透析、浓缩、冻干,即得艾蒿多糖EH-2。
SEM显示艾蒿多糖EH-2的微观形貌如图1所示,规则度较高,均一性较好。
实施例2:美白活性
一、试验材料
艾蒿多糖EH-2按照实施例1方法制备,-20℃冻存。
阳性对照β-熊果苷的纯度不低于98%。
实验过程中使用的水为哇哈哈纯净水,化学试剂均为常规试剂。
二、试验方法
参考文献方法(肉桂酸-香豆素酯类似物的合成及抑制酪氨酸酶活性研究,有机化学,Chin.J.Org.Chem.2020,40)测定艾蒿多糖EH-2和阳性对照对酪氨酸酶的抑制率:
将艾蒿多糖EH-2和阳性对照分别用50%DMSO水溶液溶解,并稀释成不同浓度的溶液。将130μL磷酸缓冲溶液(50mM,pH=6.8)、10μL酪氨酸酶溶液(终浓度33.3U/mL)和10μL待测多糖或阳性对照混匀后,加入50μL L-Dopa(终浓度0.5mM)混匀,10min后于490nm波长下测定OD值。同时设置对照组,对照组加入10μL溶媒代替多糖或阳性对照溶液。各设5个复孔,计算均值,根据如下公式计算不同浓度多糖或阳性对照对酪氨酸酶的抑制率:
抑制率(%)=(OD对照-OD药物)/OD对照×100%。
三、试验结果
不同浓度艾蒿多糖EH-2和阳性对照对酪氨酸酶的抑制率如表1和图2所示,艾蒿多糖EH-2具有较强的酪氨酸酶抑制活性,且明显强于阳性对照β-熊果苷。
表1不同浓度艾蒿多糖EH-2和阳性对照对酪氨酸酶的抑制率
Figure BDA0002606634110000041
酪氨酸酶是一种氧化酶,且是调控黑色素生成的限速酶,直接影响黑色素的合成。抑制酪氨酸酶的活性可以有效抑制黑色素的合成。目前市面上大多数美白化妆品中均含有抑制酪氨酸酶活性的成分。上述试验结果说明,艾蒿多糖EH-2为一种有效的酪氨酸酶抑制剂,可以抑制酪氨酸酶活性,进而抑制黑色素合成,具有美白活性。
实施例3:增加皮肤弹性活性
一、试验材料
艾蒿多糖EH-2按照实施例1方法制备,-20℃冻存。
人皮肤成纤维细胞(HDF)购自赛默飞,为冻存的HDF-a细胞,来自成人皮肤的正常人皮肤成纤维细胞,于原代培养结束时冻存。
小牛血清、DMEM培养基、青霉素和链霉素购自美国Gibco公司。
二、试验方法
1、细胞培养
将HDF细胞用含10%小牛血清、1%青霉素和1%链霉素的DMEM培养基于37℃、5%CO2、相对饱和湿度条件培养,2~3d传代,取对数生长期细胞进行试验。
2、Western blot法测定弹性蛋白(Elasticin)的含量
取对数生长期HDF细胞,消化制成细胞悬液,接种于6孔板中,每孔2×105个细胞,在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养;24h后,多糖组更换为含有25、50μg/mL艾蒿多糖EH-2的完全培养基,对照组更换为含有等体积溶媒的完全培养基,各设3个复孔,继续培养72h后,弃去上清液,PBS洗涤收集细胞,裂解,BCA法测定蛋白浓度,取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳,浓缩胶80V、30min,分离胶90min,将凝胶湿转到PVDF膜,5%脱脂牛奶常温封闭2h,4℃下一抗Elasticin、GAPDH孵育过夜,PBST洗膜3次,每次约15min,取相应的二抗常温孵育1.5h,PBST洗膜3次,每次15min,PVDF膜采用碧云天ECL发光液,用发光仪进行显影,拍照分析。
三、试验结果
Western blot结果如图3所示,与对照组相比,多糖组弹性蛋白含量显著升高,且具有明显的剂量效应,说明艾蒿多糖EH-2可以有效提高HDF细胞中弹性蛋白的含量。
Elasticin是一种直接关系到皮肤弹性的蛋白,人皮肤成纤维细胞中Elasticin蛋白含量的高低直接关系到人皮肤的弹性,Elasticin蛋白含量高的皮肤不易产生皱纹、不易松弛。上述试验结果说明,艾蒿多糖EH-2可以有效提高人皮肤成纤维细胞中Elasticin蛋白含量,具有提高人皮肤弹性的作用。

Claims (8)

1.一种艾蒿多糖,其特征在于,由如下步骤制备:
步骤S1,脱脂:将干燥的艾蒿叶粉碎后用石油醚热回流脱脂;
步骤S2,提取:将脱脂并挥干溶剂的艾蒿叶用蒸馏水加热提取,过滤,收集滤液减压浓缩,离心取上清液;
步骤S3,脱色:取离心后的上清液加入活性炭搅拌脱色,离心收集上清液;
步骤S4,醇沉:向脱色离心后的上清液中加入3倍体积无水乙醇,混合并于4℃过夜,离心收集醇沉物,蒸馏水复溶后浓缩至原体积的1/2;
步骤S5,脱蛋白:向浓缩液中加入1/2体积的Sevage试剂,剧烈震荡,移入分液漏斗中静置,弃去中间与下层物质,多次重复上述工艺至观察到无明显的中间蛋白层;
步骤S6,除杂:脱除蛋白的多糖溶液浓缩并去除有机试剂后,透析,再浓缩、冻干,得粗多糖;
步骤S7,阴离子交换柱层析:将经预处理的50gDEAE-SepharoseFastFlow用玻璃棒引流入层析柱(1.6cm×30cm),去离子水以12mL/min流速冲柱5min,再调流速至8mL/min,平衡10h以上;将10mL5mg/mL粗多糖过0.45μm水系一次性针头滤器;上样后,先用去离子水洗脱除杂,流速2mL/min,洗脱200mL,再用0.5mol/LNaCl溶液洗脱,流速2mL/min,收集0.5mol/LNaCl溶液洗脱液200mL,透析、浓缩、冻干,即得艾蒿多糖EH-2。
2.根据权利要求1所述的艾蒿多糖,其特征在于:步骤S3中,活性炭用量为0.2%w/v,脱色温度为75℃,脱色时间为30min。
3.根据权利要求1所述的艾蒿多糖,其特征在于:步骤S5中,Sevage试剂由氯仿和正丁醇按体积比4:1混合而成。
4.根据权利要求1所述的艾蒿多糖,其特征在于:步骤S6中透析48h,并间隔12h更换一次蒸馏水。
5.权利要求1~4任一所述艾蒿多糖的美白用途。
6.权利要求1~4任一所述艾蒿多糖的增加皮肤弹性用途。
7.权利要求1~4任一所述艾蒿多糖用于制备美白和/或增加皮肤弹性的化妆品的用途。
8.根据权利要求7所述的用途,所述化妆品包括洗面奶、面霜、手霜、乳液、面膜等。
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