CN111718430A - 一种艾蒿多糖及其制备方法和美白、增加皮肤弹性用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种艾蒿多糖及其制备方法和美白、增加皮肤弹性用途。本发明提供了一种艾蒿多糖EH‑2，SEM显示其规则度较高，均一性较好；活性测试显示该多糖具有如下活性：艾蒿多糖EH‑2为一种有效的酪氨酸酶抑制剂，可以抑制酪氨酸酶活性，进而抑制黑色素合成，具有美白活性；艾蒿多糖EH‑2可以有效提高人皮肤成纤维细胞中Elasticin蛋白含量，具有提高人皮肤弹性的作用。因此，艾蒿多糖EH‑2可以用于制备美白和/或增加皮肤弹性的化妆品。

Description

一种艾蒿多糖及其制备方法和美白、增加皮肤弹性用途
技术领域
本发明属于化妆品领域，涉及植物多糖及在化妆品中的应用，具体涉及一种艾蒿多糖及其制备方法和美白、增加皮肤弹性用途。
背景技术
成分作为化妆品中有利的“武器”，受到了消费者和品牌的重视。在当下的化妆品市场，凡是被消费者喜爱的产品，配方中几乎都有时下最热门成分的踪影。比如，美白化妆品中都含有具有美白效果的成分。
据全球市场研究咨询公司英敏特发布的“2018护肤品四大趋势”显示，“纯净、安全、天然”的护肤品日益受到消费者的关注。不少消费者认为，天然有机的美容、个护产品比主流产品更安全，所以天然成分将会受到消费者的热捧。
艾蒿Artemisia argyi Lévl.etVant.又名艾草、苦艾、蕲艾、灸草等，为菊科蒿属多年生草本或半灌木状植物，主要分布于朝鲜半岛、日本、蒙古、俄罗斯以及我国的东北、西北、华北、华东等地，为我国传统中药，具有多种活性。
市面上已经有多种以艾蒿中天然成分作为活性添加剂的化妆品，并且开发价值高。
发明内容
本发明是为了提供一种艾蒿多糖及其制备方法和美白、增加皮肤弹性用途。
本发明技术方案如下：
一种艾蒿多糖，由如下步骤制备：
步骤S1，脱脂：将干燥的艾蒿叶粉碎后用石油醚热回流脱脂；
步骤S2，提取：将脱脂并挥干溶剂的艾蒿叶用蒸馏水加热提取，过滤，收集滤液减压浓缩，离心取上清液；
步骤S3，脱色：取离心后的上清液加入活性炭搅拌脱色，离心收集上清液；
步骤S4，醇沉：向脱色离心后的上清液中加入3倍体积无水乙醇，混合并于4℃过夜，离心收集醇沉物，蒸馏水复溶后浓缩至原体积的1/2；
步骤S5，脱蛋白：向浓缩液中加入1/2体积的Sevage试剂，剧烈震荡，移入分液漏斗中静置，弃去中间与下层物质，多次重复上述工艺至观察到无明显的中间蛋白层；
步骤S6，除杂：脱除蛋白的多糖溶液浓缩并去除有机试剂后，透析，再浓缩、冻干，得粗多糖；
步骤S7，阴离子交换柱层析：将经预处理的50g DEAE-Sepharose Fast Flow用玻璃棒引流入层析柱(1.6cm×30cm)，去离子水以12mL/min流速冲柱5min，再调流速至8mL/min，平衡10h以上；将10mL 5mg/mL粗多糖过0.45μm水系一次性针头滤器；上样后，先用去离子水洗脱除杂，流速2mL/min，洗脱200mL，再用0.5mol/LNaCl溶液洗脱，流速2mL/min，收集0.5mol/LNaCl溶液洗脱液200mL，透析、浓缩、冻干，即得艾蒿多糖EH-2。
优选地，步骤S3中，活性炭用量为0.2％w/v，脱色温度为75℃，脱色时间为30min。
优选地，步骤S5中，Sevage试剂由氯仿和正丁醇按体积比4:1混合而成。
优选地，步骤S6中透析48h，并间隔12h更换一次蒸馏水。
上述艾蒿多糖的美白用途。
上述艾蒿多糖的增加皮肤弹性用途。
上述艾蒿多糖用于制备美白和/或增加皮肤弹性的化妆品的用途。
优选地，所述化妆品包括洗面奶、面霜、手霜、乳液、面膜等。
有益技术效果：
本发明提供了一种艾蒿多糖EH-2，SEM显示其规则度较高，均一性较好；活性测试显示该多糖具有如下活性：1、艾蒿多糖EH-2为一种有效的酪氨酸酶抑制剂，可以抑制酪氨酸酶活性，进而抑制黑色素合成，具有美白活性；2、艾蒿多糖EH-2可以有效提高人皮肤成纤维细胞中Elasticin蛋白含量，具有提高人皮肤弹性的作用。因此，艾蒿多糖EH-2可以用于制备美白和/或增加皮肤弹性的化妆品。
附图说明
图1为艾蒿多糖EH-2的SEM图；
图2为不同浓度艾蒿多糖EH-2和阳性对照对酪氨酸酶的抑制率；
图3为人皮肤成纤维细胞中Elasticin蛋白的Western blot测定结果；
具体实施方式
下面通过具体的实施例详细介绍本发明实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1：艾蒿多糖的制备
一、试验材料
原料为干燥的艾蒿叶，艾蒿叶为菊科蒿属艾蒿Artemisia argyi Lévl.etVant.的叶。
活性炭为常规的脱色用活性炭粉，化学试剂均为常规试剂。
二、方法和结果
制备步骤如下：
步骤S1，脱脂：将干燥的艾蒿叶粉碎后用石油醚热回流脱脂，每公斤艾蒿叶使用10L石油醚脱脂2次，每次1.5h；
步骤S2，提取：将脱脂并挥干溶剂的艾蒿叶用蒸馏水照液料质量比20:1于80℃提取2次，每次3h；收集滤液并在60℃减压浓缩，以3000r/min的转速离心15min后取上清液；
步骤S3，脱色：取离心后的上清液加入活性炭搅拌脱色，离心收集上清液；其中，活性炭用量为0.2％w/v，脱色温度为75℃，脱色时间为30min；
步骤S4，醇沉：向脱色离心后的上清液中加入3倍体积无水乙醇，混合并于4℃过夜，离心收集醇沉物，蒸馏水复溶后浓缩至原体积的1/2；
步骤S5，脱蛋白：向浓缩液中加入1/2体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1，v/v)，剧烈震荡20min，移入分液漏斗中静置20min，弃去中间与下层物质，多次重复上述工艺至观察到无明显的中间蛋白层；
步骤S6，除杂：脱除蛋白的多糖溶液浓缩并去除有机试剂后，透析48h，并间隔12h更换一次蒸馏水，从而除去样液中的盐类及小分子物质，再浓缩、冻干，得粗多糖；
步骤S7，阴离子交换柱层析：将经预处理的50g DEAE-Sepharose Fast Flow用玻璃棒引流入层析柱(1.6cm×30cm)，去离子水以12mL/min流速冲柱5min，再调流速至8mL/min，平衡10h以上；将10mL 5mg/mL粗多糖过0.45μm水系一次性针头滤器；上样后，先用去离子水洗脱除杂，流速2mL/min，洗脱200mL，再用0.5mol/LNaCl溶液洗脱，流速2mL/min，收集0.5mol/LNaCl溶液洗脱液200mL，透析、浓缩、冻干，即得艾蒿多糖EH-2。
SEM显示艾蒿多糖EH-2的微观形貌如图1所示，规则度较高，均一性较好。
实施例2：美白活性
一、试验材料
艾蒿多糖EH-2按照实施例1方法制备，-20℃冻存。
阳性对照β-熊果苷的纯度不低于98％。
实验过程中使用的水为哇哈哈纯净水，化学试剂均为常规试剂。
二、试验方法
参考文献方法(肉桂酸-香豆素酯类似物的合成及抑制酪氨酸酶活性研究，有机化学，Chin.J.Org.Chem.2020,40)测定艾蒿多糖EH-2和阳性对照对酪氨酸酶的抑制率：
将艾蒿多糖EH-2和阳性对照分别用50％DMSO水溶液溶解，并稀释成不同浓度的溶液。将130μL磷酸缓冲溶液(50mM，pH＝6.8)、10μL酪氨酸酶溶液(终浓度33.3U/mL)和10μL待测多糖或阳性对照混匀后，加入50μL L-Dopa(终浓度0.5mM)混匀，10min后于490nm波长下测定OD值。同时设置对照组，对照组加入10μL溶媒代替多糖或阳性对照溶液。各设5个复孔，计算均值，根据如下公式计算不同浓度多糖或阳性对照对酪氨酸酶的抑制率：
抑制率(％)＝(OD对照-OD药物)/OD对照×100％。
三、试验结果
不同浓度艾蒿多糖EH-2和阳性对照对酪氨酸酶的抑制率如表1和图2所示，艾蒿多糖EH-2具有较强的酪氨酸酶抑制活性，且明显强于阳性对照β-熊果苷。
表1不同浓度艾蒿多糖EH-2和阳性对照对酪氨酸酶的抑制率
Figure BDA0002606634110000041
酪氨酸酶是一种氧化酶，且是调控黑色素生成的限速酶，直接影响黑色素的合成。抑制酪氨酸酶的活性可以有效抑制黑色素的合成。目前市面上大多数美白化妆品中均含有抑制酪氨酸酶活性的成分。上述试验结果说明，艾蒿多糖EH-2为一种有效的酪氨酸酶抑制剂，可以抑制酪氨酸酶活性，进而抑制黑色素合成，具有美白活性。
实施例3：增加皮肤弹性活性
一、试验材料
艾蒿多糖EH-2按照实施例1方法制备，-20℃冻存。
人皮肤成纤维细胞(HDF)购自赛默飞，为冻存的HDF-a细胞，来自成人皮肤的正常人皮肤成纤维细胞，于原代培养结束时冻存。
小牛血清、DMEM培养基、青霉素和链霉素购自美国Gibco公司。
二、试验方法
1、细胞培养
将HDF细胞用含10％小牛血清、1％青霉素和1％链霉素的DMEM培养基于37℃、5％CO2、相对饱和湿度条件培养，2～3d传代，取对数生长期细胞进行试验。
2、Western blot法测定弹性蛋白(Elasticin)的含量
取对数生长期HDF细胞，消化制成细胞悬液，接种于6孔板中，每孔2×105个细胞，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养；24h后，多糖组更换为含有25、50μg/mL艾蒿多糖EH-2的完全培养基，对照组更换为含有等体积溶媒的完全培养基，各设3个复孔，继续培养72h后，弃去上清液，PBS洗涤收集细胞，裂解，BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶80V、30min，分离胶90min，将凝胶湿转到PVDF膜，5％脱脂牛奶常温封闭2h，4℃下一抗Elasticin、GAPDH孵育过夜，PBST洗膜3次，每次约15min，取相应的二抗常温孵育1.5h，PBST洗膜3次，每次15min，PVDF膜采用碧云天ECL发光液，用发光仪进行显影，拍照分析。
三、试验结果
Western blot结果如图3所示，与对照组相比，多糖组弹性蛋白含量显著升高，且具有明显的剂量效应，说明艾蒿多糖EH-2可以有效提高HDF细胞中弹性蛋白的含量。
Elasticin是一种直接关系到皮肤弹性的蛋白，人皮肤成纤维细胞中Elasticin蛋白含量的高低直接关系到人皮肤的弹性，Elasticin蛋白含量高的皮肤不易产生皱纹、不易松弛。上述试验结果说明，艾蒿多糖EH-2可以有效提高人皮肤成纤维细胞中Elasticin蛋白含量，具有提高人皮肤弹性的作用。

Claims (8)

1.一种艾蒿多糖，其特征在于，由如下步骤制备：
步骤S1，脱脂：将干燥的艾蒿叶粉碎后用石油醚热回流脱脂；
步骤S2，提取：将脱脂并挥干溶剂的艾蒿叶用蒸馏水加热提取，过滤，收集滤液减压浓缩，离心取上清液；
步骤S3，脱色：取离心后的上清液加入活性炭搅拌脱色，离心收集上清液；
步骤S4，醇沉：向脱色离心后的上清液中加入3倍体积无水乙醇，混合并于4℃过夜，离心收集醇沉物，蒸馏水复溶后浓缩至原体积的1/2；
步骤S5，脱蛋白：向浓缩液中加入1/2体积的Sevage试剂，剧烈震荡，移入分液漏斗中静置，弃去中间与下层物质，多次重复上述工艺至观察到无明显的中间蛋白层；
步骤S6，除杂：脱除蛋白的多糖溶液浓缩并去除有机试剂后，透析，再浓缩、冻干，得粗多糖；
步骤S7，阴离子交换柱层析：将经预处理的50gDEAE-SepharoseFastFlow用玻璃棒引流入层析柱(1.6cm×30cm)，去离子水以12mL/min流速冲柱5min，再调流速至8mL/min，平衡10h以上；将10mL5mg/mL粗多糖过0.45μm水系一次性针头滤器；上样后，先用去离子水洗脱除杂，流速2mL/min，洗脱200mL，再用0.5mol/LNaCl溶液洗脱，流速2mL/min，收集0.5mol/LNaCl溶液洗脱液200mL，透析、浓缩、冻干，即得艾蒿多糖EH-2。
2.根据权利要求1所述的艾蒿多糖，其特征在于：步骤S3中，活性炭用量为0.2％w/v，脱色温度为75℃，脱色时间为30min。
3.根据权利要求1所述的艾蒿多糖，其特征在于：步骤S5中，Sevage试剂由氯仿和正丁醇按体积比4:1混合而成。
4.根据权利要求1所述的艾蒿多糖，其特征在于：步骤S6中透析48h，并间隔12h更换一次蒸馏水。
5.权利要求1～4任一所述艾蒿多糖的美白用途。
6.权利要求1～4任一所述艾蒿多糖的增加皮肤弹性用途。
7.权利要求1～4任一所述艾蒿多糖用于制备美白和/或增加皮肤弹性的化妆品的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，所述化妆品包括洗面奶、面霜、手霜、乳液、面膜等。
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