CN115448990A - 一种天然来源的多糖以及将其应用于美白保湿化妆品的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天然来源的多糖以及将其应用于美白保湿化妆品的用途。本发明从蒺藜果中制备得到一种微观形貌规则性强、均一度高的多糖，含量可达95％。该多糖具有优异的酪氨酸酶抑制活性，美白价值高；同时，该多糖具有优异的保湿活性，保湿价值高。而且，本发明制备的多糖对人皮肤安全无刺激，不会引起过敏，符合定位天然多糖开发方向的研究开发初衷和预期。
Description
技术领域
本发明属于化学领域，涉及多糖及其应用，具体涉及一种天然来源的多糖以及将其应用于美白保湿化妆品的用途。
背景技术
随着我国人民生活水平的提高，大家对于美的追求也不断提升，皮肤美白和保湿一直是我们亚洲人最为重视的皮肤健康美丽的需求方向之一，而具有美白保湿功效的护肤品也成为消费者关注的焦点和市场销售的热点。
蒺藜果为蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实，富含多糖、皂苷和黄酮等成分。蒺藜果因具有广泛功效，在我国被广泛使用。2019年时，有一款韩国生产的美白保湿面霜曾经一直排在化妆品代购榜的前十名，其中活性成分就有蒺藜果多肽。
可见，蒺藜果中已有成分被开发用于美白保湿类化妆品。但是，蒺藜果中比多肽含量更高的多糖研究还较少，也没有相关活性报道。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种天然来源的多糖以及将其应用于美白保湿化妆品的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种天然来源的多糖，通过如下步骤制备：
第一步，水提醇沉法提取蒺藜果总多糖：
在洗净、晒干后粉碎的蒺藜果中加入去离子水，加热提取一至多次，提取液过滤，收集滤液，离心取上清液；上清液旋转蒸发至原体积的1/4，加入4倍体积无水乙醇，低温静置，离心取沉淀；沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，Sevag法脱蛋白，透析，冷冻干燥至恒重，得蒺藜果总多糖；
第二步，DEAE-52阴离子交换柱分离
在蒺藜果总多糖中加入去离子水，溶解、离心，取适量上清液上样于DEAE-52阴离子交换柱，依次用浓度为0、0.1、0.3、0.5mol/L NaCl溶液进行洗脱，洗脱流速为2mL/min，收集0.5mol/L NaCl溶液的洗脱液，透析，冷冻干燥至恒重。
上述技术方案中，加热提取的水浴温度为85℃。
上述技术方案中，低温静置的条件为4℃静置12h。
上述技术方案中，透析采用的透析袋的截留分子量为3500Da。
上述技术方案制备的多糖用于制备美白保湿化妆品的用途。
有益技术效果：
1、本发明从蒺藜果中制备得到一种微观形貌规则性强、均一度高的多糖，含量可达95％。
2、本发明制备的多糖具有优异的酪氨酸酶抑制活性，美白价值高。
3、本发明制备的多糖具有优异的保湿活性，保湿价值高。
4、本发明制备的多糖对人皮肤安全无刺激，不会引起过敏，符合定位天然多糖开发方向的研究开发初衷和预期。
附图说明
图1为JLF-4组分多糖在扫描电子显微镜观察的微观形态(400×)。
具体实施方式
实施例1：多糖分离
蒺藜果采自安徽亳州，为蒺藜Tribulus terrestris L.的成熟果实，洗净晒干后粉碎。
第一步，水提醇沉法提取蒺藜果总多糖
在蒺藜果中加入去离子水(蒺藜果：去离子水＝1kg：5L)，85℃水浴提取5h，过滤，收集滤液；在滤渣中加入与前次相同体积的去离子水，85℃水浴提取3h，过滤，收集滤液；合并两次滤液，以3500r/min离心15min，取上清液。上清液旋转蒸发至原体积的1/4，加入4倍体积无水乙醇，4℃静置12h，3500r/min离心15min，取沉淀。沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，Sevag法脱蛋白，用截留分子量为3500Da的透析袋透析，冷冻干燥至恒重。
第二步，DEAE-52阴离子交换柱分离
在蒺藜果总多糖中加入去离子水，搅拌溶解(20mg/mL)，3500r/min离心15min，取上清液20mL上样于DEAE-52阴离子交换柱(3cm×50cm)，依次用浓度为0、0.1、0.3、0.5、1.0mol/L NaCl溶液进行洗脱，每种浓度洗脱250mL，洗脱流速为2mL/min，收集每种浓度洗脱液后用截留分子量为3500Da的透析袋透析，冷冻干燥至恒重，各组分分别命名为JLF-1、JLF-2、JLF-3、JLF-4、JLF-5。
第三步，多糖含量测定、回收率计算和微观表征
多糖含量测定采用苯酚-浓硫酸法。回收率根据各组分重量占上样总多糖质量的百分比计算。各组分多糖含量和回收率如表1所示。
表1多糖含量和回收率
除去分离基质的死吸附，以及回收率低于5％的三种组分，JLF-2、JLF-4回收率较高，但是JLF-2多糖含量较低，可能含有较高含量的糖蛋白(Sevag法无法脱除这种结合蛋白)。因此，选定JLF-4进行后续试验，其微观形态如图1所示，整体规则性强、均一度高。
实施例2：美白试验
参考CN112062870A方法测定JLF-4的美白活性。具体方法如下。
第一步，溶液配制
磷酸钠缓冲液(1/15M，pH＝6.8)：精确称取1.0002g磷酸二氢钠，1.1865g磷酸氢二钠，加入少量去离子水溶解后，定容至500mL，4℃冰箱保存备用。
L-酪氨酸溶液(7.5mmol/L)：精确称取L-酪氨酸0.2725g，先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50mL，微热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调pH至7.0，加去离子水定容至200mL。
受试液：精确称取JLF-4组分多糖0.1g，分别溶于20mL去离子水，得到5mg/mL的待测液，再对倍稀释到2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL和0.15625mg/mL。
阳性对照：精确称取0.1g熊果苷，溶于20mL的去离子水中，得到5mg/mL的阳性对照母液，再对倍稀释到2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL和0.15625mg/mL。
酪氨酸酶液的制备：将马铃薯(优选新鲜质硬)洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1×1×1cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。称重，按1:1(w:v)的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000r/min离心10min，上清即为酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2h内用完。
第二步，构建反应体系
将上述各溶液按照表2体积构建反应体系，总反应体系为5mL。其中，用分光光度计测量吸光值时，“受试液”、“标准对照”、“阳性对照”分别以“阴性对照1”、“阴性对照2”和“阴性对照3”调零。
表2反应体系
在此体系中，受试液(包括阳性对照熊果苷)的终浓度(mg/mL)梯度为0.015625、0.03125、0.0625、0.125、0.25和0.5。
实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液(包括阳性对照)和酶液，于30℃水浴10min。然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。测定反应20min时475nm波长下的吸光值。测定时以相应的阴性对照为参比，用下列公式计算受试液(包括阳性对照)对酪氨酸酶的抑制率，并依据浓度-抑制率曲线确定半数抑制浓度(IC50)。
抑制率(％)＝(A-B)÷A×100％
其中，“A”为标准对照的吸光值，“B”为受试液(或阳性对照)的吸光值。每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。
结果如表3所示，JLF-4组分多糖对酪氨酸酶的抑制强度显著优于阳性对照。
表3对酪氨酸酶抑制作用的IC50值
酪氨酸酶是一种含铜的金属氧化还原酶，能催化L-酪氨酸羟基转化成L-多巴，再氧化形成多巴醌，经一系列的酶促和非酶促反应最终形成黑色素。在人体中，过多黑色素的积累会导致皮肤形成各类色斑等问题，只有通过抑制酪氨酸酶活性，才能减少黑色素的形成，达到美白效果。目前，常用的酪氨酸酶活性抑制剂大多是通过化学方法合成，存在着一定的副作用，而从植物中提取分离的天然多糖则被认为是理想的酪氨酸酶抑制剂之一。上述试验证明JLF-4组分多糖具有优异的酪氨酸酶抑制活性，美白价值高。
实施例3：保湿试验
参考CN112062870A方法测定JLF-4的保湿活性，略作修改。具体方法如下。
称取0.5g JLF-4组分多糖、阳性对照海藻酸钠各3份于称量瓶中，加入0.2g的蒸馏水，待样品充分吸水后，置于装有硅胶的干燥器内，常温放置，并分别于6、12、18、24h后称重，计算3次平均值，按下式计算保湿率：
保湿率＝不同时间点所含水分重量÷初始水分重量×100％。
结果如表4所示，JLF-4组分多糖的保湿性能显著优于阳性对照海藻酸钠。
表4保湿率(％)
实施例4：过敏性刺激测试
采用化妆品领域常用的斑贴试验测试JLF-4组分多糖是否会导致人皮肤刺激过敏。
参照《化妆品安全技术规范》(2015版)选取30名健康志愿者作为受试者，其中男15名，女15名。待沐浴后，取受试物(JLF-4组分多糖)0.025g置于斑试器小室，将加有受试物的斑试器用低致敏胶带贴敷于受试者的背部或前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。分别于去除受试物斑试器后30min(待压痕消失后)、24h和48h按表5标准观察皮肤反应，并记录观察结果并参考表5进行评价。
表5皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准
结果30名健康志愿者测试结果均为阴性反应，阴性率100％，符合定位天然多糖开发方向的研究开发初衷和预期。
Claims (5)
1.一种天然来源的多糖，其特征在于，通过如下步骤制备：
第一步，水提醇沉法提取蒺藜果总多糖：
在洗净、晒干后粉碎的蒺藜果中加入去离子水，加热提取一至多次，提取液过滤，收集滤液，离心取上清液；上清液旋转蒸发至原体积的1/4，加入4倍体积无水乙醇，低温静置，离心取沉淀；沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，Sevag法脱蛋白，透析，冷冻干燥至恒重，得蒺藜果总多糖；
第二步，DEAE-52阴离子交换柱分离
在蒺藜果总多糖中加入去离子水，溶解、离心，取适量上清液上样于DEAE-52阴离子交换柱，依次用浓度为0、0.1、0.3、0.5mol/LNaCl溶液进行洗脱，洗脱流速为2mL/min，收集0.5mol/LNaCl溶液的洗脱液，透析，冷冻干燥至恒重。
2.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：加热提取的水浴温度为85℃。
3.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：低温静置的条件为4℃静置12h。
4.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：透析采用的透析袋的截留分子量为3500Da。
5.权利要求1～4任一所述多糖用于制备美白保湿化妆品的用途。
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