CN114381488A - 一种活性肽、抗皮肤衰老用途和在化妆品方面的商品化应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活性肽、抗皮肤衰老用途和在化妆品方面的商品化应用。本发明提供了一种蓝花参活性肽，该活性肽从蓝花参种子总蛋白中酶解得到。高糖衰老模型是衰老研究常用的造模模型，衰老细胞增殖放缓，且可以通过试剂盒检测衰老水平。碧云天生产的细胞衰老β‑半乳糖苷酶染色试剂盒，以X‑Gal为底物，在衰老特异性的β‑半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物，染色阳性的细胞即为衰老细胞。本发明研究发现该蓝花参活性肽具有抗HDFs细胞衰老的活性，具有抗皮肤衰老的作用，可以用于开发制备抗皮肤衰老的化妆品。
Description
技术领域
本发明属于化妆品领域，涉及化妆品活性成分的开发，具体涉及一种活性肽、抗皮肤衰老用途和在化妆品方面的商品化应用。
背景技术
如何保持皮肤的年轻状态是所有爱美人士的共同需求，因此，延缓皮肤衰老也成为了现代化妆品研究的重点。皮肤衰老主要由内源性因素(遗传因素或其他不可抗因素)和外源性因素(紫外线辐射、吸烟、风吹、接触化学物、引力、营养、生活方式等影响)决定，皮肤衰老的外在特征表现主要是皮肤水分含量降低、肤色暗沉、色素沉着、表面干燥粗糙、皮肤松弛、弹性降低和皱纹形成等。内在原因则主要是因为细胞更新能力降低，胶原蛋白含量降低，衰老皮肤细胞占细胞的比重提升。
以植物提取物作为活性成分配制的化妆品与传统化妆品相比，具有很多优点，诸如：克服了传统化妆品依赖化学合成品的缺点，使产品的安全性能更高；天然组分更容易被皮肤吸收，使产品的作用效果更显著；功能性更突出等。因此，植物提取物应用于化妆品中是市场发展的必然趋势。另外，植物提取物具有许多明显的优势：来源广、作用机理针对性强。特别是随着现代提取技术和分析技术的进步，其功效成分及相关作用机理已逐渐被人们发现并证实，在防晒、美白、抗衰老、杀菌等方面有着广泛应用。
将植物蛋白酶解制备成活性肽用于化妆品是一个重要的研究方向，一方面这些活性肽的潜在活性广泛，另一方面分子量比蛋白明显降低，相对容易被吸收。
发明内容
本发明是为了提供一种活性肽、抗皮肤衰老用途和在化妆品方面的商品化应用。
本发明技术方案如下：
一种活性肽，通过如下方法制备：
取蓝花参种子，用沸程为60～90℃的石油醚热回流脱脂，收集脱脂后的种子，挥干溶剂，用pH＝8.4的去离子水加热提取，每15min测定并调节pH；收集去离子水提取液，静置过夜，取上清，第一次离心，收集上清液，调节pH＝5.8，pH＝5.8为蓝花参种子蛋白的等电点；将调至蛋白等电点的溶液第二次离心，收集沉淀，适量去离子水复溶，透析，冷冻干燥，即得到蓝花参种子中的总蛋白；
取适量总蛋白用去离子水溶解配制蛋白溶液，加入碱性蛋白酶，蛋白酶添加量为5000U/g底物，酶解条件为：pH值＝8.5，酶解温度＝50℃，酶解时间＝3小时，每15min测定并调节pH；酶解结束后立即置于沸水浴中加热灭酶；将灭酶后的酶解液冷却至常温，第三次离心，取上清液冷冻干燥；
将冻干粉用去离子水溶解，依次过截留分子量为5kDa、3kDa的超滤膜，保留3～5kDa的蓝花参活性肽，冷冻干燥，即得。
优选地，去离子水65℃加热提取温度为60～70℃。
优选地，pH调节试剂为1mol/L的氢氧化钠溶液和1mol/L的盐酸溶液。
优选地，第一次离心条件为12000r/min离心15min。
优选地，第二次离心条件为12000r/min离心15min。
优选地，第三次离心条件为5000r/min离心15min。
上述活性肽的抗皮肤衰老用途。
上述活性肽在制备抗皮肤衰老的化妆品中的应用。
有益技术效果：
1、本发明提供了一种蓝花参活性肽，该活性肽从蓝花参种子总蛋白中酶解得到；
2、高糖衰老模型是衰老研究常用的造模模型，衰老细胞增殖放缓，且可以通过试剂盒检测衰老水平。碧云天生产的细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物，染色阳性的细胞即为衰老细胞。本发明研究发现上述蓝花参活性肽具有抗HDFs细胞衰老的活性，具有抗皮肤衰老的作用。
附图说明
图1为各组细胞增殖曲线。
图2为β-半乳糖苷酶染色结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例详细介绍本发明实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。
一、材料
将桔梗科蓝花参属植物蓝花参(Wahlenbergia marginata)的种子干燥粉碎，过60目筛。
碱性蛋白酶购自索莱宝。人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblasts，HDF)购自ATCC。
胎牛血清、DMEM-HG培养基(葡萄糖浓度26mmol/L)、DMEM-LG培养基(葡萄糖浓度5.5mmol/L)购自美国Gibco公司。
双抗、β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自碧云天。CCK-8试剂购自诺唯赞。
二、方法
1、蓝花参活性肽的制备
取1kg蓝花参种子，加入8L沸程为60～90℃的石油醚，热回流提取3h，收集脱脂后的种子，挥干溶剂，加入8LpH＝8.4的去离子水65℃加热提取3h。每15min测定并调节pH。pH调节试剂为1mol/L的氢氧化钠溶液和1mol/L的盐酸溶液(下同)。收集去离子水提取液，静置过夜，取上清，以12000r/min离心15min，收集上清液，调节pH＝5.8。pH＝5.8为蓝花参种子蛋白的等电点。将调至蛋白等电点的溶液以12000r/min离心15min，收集沉淀，适量去离子水复溶，透析72h，冷冻干燥，即得到蓝花参种子中的总蛋白112.7g。
取10g总蛋白用200mL去离子水溶解配制蛋白溶液，加入碱性蛋白酶，蛋白酶添加量为5000U/g底物，酶解条件为：pH值＝8.5，酶解温度＝50℃，酶解时间＝3小时。每15min测定并调节pH。酶解结束后立即置于沸水浴中加热15min灭酶。将灭酶后的酶解液冷却至常温，以5000r/min离心15min，取上清液冷冻干燥，冻干粉4℃保存。
将冻干粉用去离子水溶解，1g冻干粉加50mL去离子水，依次过截留分子量为5kDa、3kDa的超滤膜，保留3～5kDa的蓝花参活性肽，冷冻干燥，4℃保存。
2、细胞培养、分组、造模和干预
将HDFs细胞用含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM-LG培养基于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养，2～3d换液。取对数生长期HDFs分为Blank组、Model组、Peptide-Low组和Peptide-High组。Blank组全程使用低糖培养基培养，其它组使用高糖培养基培养制造衰老模型，但Model组不给予活性肽干预，Peptide-Low组、Peptide-High组分别给予100μg/mL、200μg/mL蓝花参活性肽干预。
3、CCK-8检测细胞增殖活性
取对数生长期HDFs细胞，0.25％胰酶消化，用含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM-LG培养基重悬，显微镜下计数，按每孔5000个细胞/200μL培养液接种于96孔板中，按上述分组方法分组，每组5个复孔；于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24h后，Blank组更换为新鲜的含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM-LG培养基继续培养，Model组更换为含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM-HG培养基继续培养，Peptide-Low组、Peptide-High组分别更换为含有10％胎牛血清、1％双抗和100μg/mL、200μg/mL蓝花参活性肽的DMEM-HG培养基继续培养。继续培养24、48、72h后，每孔加10μLCCK-8溶液，继续孵育4h，置于酶标仪中在450nm波长下读取吸光度(OD)值，绘制增殖曲线。
4、β-半乳糖苷酶检测试剂盒检测细胞衰老水平
取对数生长期HDFs细胞，0.25％胰酶消化，用含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM-LG培养基重悬，按1×106个细胞/mL的培养密度接种于培养瓶中，按上述分组方法分组，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24h后，Blank组更换为新鲜的含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM-LG培养基继续培养，Model组更换为含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM-HG培养基继续培养，Peptide-Low组、Peptide-High组分别更换为含有10％胎牛血清、1％双抗和100μg/mL、200μg/mL蓝花参活性肽的DMEM-HG培养基继续培养，每48h更换一次对应的培养基并调节至培养密度为1×106个细胞/mL。继续培养12d，收集细胞，洗涤，各组取等量细胞使用β-半乳糖苷酶检测试剂盒检测细胞衰老水平。
5、统计学分析
数据以平均值±SD表示，组间比较采用t检验，P<0.05代表具有显著性差异。
三、结果
1、细胞增殖活性
各组OD值如表1所示，据此绘制的细胞增殖曲线如图1所示，与Blank组相比，Model组HDFs细胞的增殖活性明显减弱；与Model组相比，Peptide-Low组、Peptide-High组HDFs细胞的增殖活性明显增强，且Peptide-High组HDFs细胞的增殖活性更强。
表1各组OD值
2、细胞衰老水平
各组β-半乳糖苷酶染色阳性率如表2和图2所示，与Blank组相比，Model组HDFs细胞的染色阳性率明显升高；与Model组相比，Peptide-Low组、Peptide-High组HDFs细胞的染色阳性率明显降低，且Peptide-High组HDFs细胞的染色阳性率更低。
表2各组β-半乳糖苷酶染色阳性率
高糖衰老模型是衰老研究常用的造模模型，衰老细胞增殖放缓，且可以通过试剂盒检测衰老水平。碧云天生产的细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物，染色阳性的细胞即为衰老细胞。本发明研究发现上述蓝花参活性肽具有抗HDFs细胞衰老的活性，具有抗皮肤衰老的作用。
Claims (8)
1.一种活性肽，其特征在于，通过如下方法制备：
取蓝花参种子，用沸程为60～90℃的石油醚热回流脱脂，收集脱脂后的种子，挥干溶剂，用pH＝8.4的去离子水加热提取，每15min测定并调节pH；收集去离子水提取液，静置过夜，取上清，第一次离心，收集上清液，调节pH＝5.8，pH＝5.8为蓝花参种子蛋白的等电点；将调至蛋白等电点的溶液第二次离心，收集沉淀，适量去离子水复溶，透析，冷冻干燥，即得到蓝花参种子中的总蛋白；
取适量总蛋白用去离子水溶解配制蛋白溶液，加入碱性蛋白酶，蛋白酶添加量为5000U/g底物，酶解条件为：pH值＝8.5，酶解温度＝50℃，酶解时间＝3小时，每15min测定并调节pH；酶解结束后立即置于沸水浴中加热灭酶；将灭酶后的酶解液冷却至常温，第三次离心，取上清液冷冻干燥；
将冻干粉用去离子水溶解，依次过截留分子量为5kDa、3kDa的超滤膜，保留3～5kDa的蓝花参活性肽，冷冻干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的活性肽，其特征在于：去离子水65℃加热提取温度为60～70℃。
3.根据权利要求1所述的活性肽，其特征在于：pH调节试剂为1mol/L的氢氧化钠溶液和1mol/L的盐酸溶液。
4.根据权利要求1所述的活性肽，其特征在于：第一次离心条件为12000r/min离心15min。
5.根据权利要求1所述的活性肽，其特征在于：第二次离心条件为12000r/min离心15min。
6.根据权利要求1所述的活性肽，其特征在于：第三次离心条件为5000r/min离心15min。
7.权利要求1～6任一所述活性肽的抗皮肤衰老用途。
8.权利要求1～6任一所述活性肽在制备抗皮肤衰老的化妆品中的应用。
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