CN1962698A - 艾叶多糖提取物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种艾(Artemisia argyi)叶多糖提取物的用途。所说的艾叶多糖提取物对小鼠移植性Heps肿瘤和Eac肿瘤均有明显的抑制作用，且可以提高荷瘤小鼠NK细胞的活性。这就预示着：本发明所提取得艾叶多糖提取物具有抗肿瘤活性和明显的增强免疫功能作用，并且有明显的剂量依赖性，可用于抗肿瘤和增强免疫功能药品的制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种艾叶提取物的用途，具体地说，涉及一种艾叶多糖提取物的用途。
背景技术
艾(学名：Artemisia argyi)，菊科，多年生草本植物。其叶(艾叶)入药，主要功能：散寒止痛，温经止血。
艾叶中包含有挥发油、腺嘌呤、胆碱、鞣质、黄酮、甾醇、萜类、多糖和微量元素等组分。Seo等从艾叶中提取获得黄酮类化合物，并发现其具有抗肿瘤活性(Planta Med，2003，69，3；J.ofEthno.2005，3，26；Jour.OfAgri.And Food Chem.2000，42，8)；Lee和Ha等人发现艾叶的水提物及甲醇提取物具有能抑制某些肿瘤细胞增生的作用(Jour.OfBiochem.And Mole.Biol.，1999，6，23；Natural Product Sciences，1997，3，1)。然迄今为止，对艾叶多糖提取物的用途未见报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种艾叶多糖提取物的用途。
本发明采用适合于艾叶多糖提取的提取方法，对生药艾叶(未经煎煮的艾叶)进行提取后获得艾叶多糖提取物。首次发现所得艾叶多糖提取物对小鼠移植性Heps肿瘤和Eac肿瘤均有明显的抑制作用，且可以提高荷瘤小鼠NK细胞的活性。这就预示着：本发明所提取得艾叶多糖提取物具有抗肿瘤活性和明显的增强免疫功能作用，并且有明显的剂量依赖性，可用于抗肿瘤和增强免疫功能药品的制备。
本发明所说的艾叶多糖提取物的提取方法，包括如下步骤：
(1)将生药艾叶用水煎煮0.5～2小时，过滤，保留滤液；
(2)向由步骤(1)所得的滤液中加入沉淀剂，使沉淀剂在滤液中的浓度为65v/v％～80v/v％，得沉淀物，过滤，保留沉淀物；
(3)将由步骤(2)所得的沉淀物与水混合，离心，保留上清液；
(4)将由步骤(3)所得的上清液进行脱蛋白(脱蛋白的方法可采用Sevag法、三氯醋酸法或表面活性剂法，具体参见张惟杰编《复合多糖生化研究技术》，上海科学技术出版社，1987)后获得上清液，向该上清液中加入沉淀剂后得沉淀物，过滤，所得沉淀物经洗涤和干燥后即为目标物。
在本发明的一个优选技术方案中，步骤(1)中艾叶与水的重量比为1∶(5～15)，更优选为1∶(9～12)；
在本发明的另一个优选技术方案中，步骤(1)中所说滤液的pH值控制在5.0～8.0为宜；
在本发明的又一个优选技术方案中，其中所说的沉淀剂为甲醇、乙醇或丙酮，最佳的沉淀剂为乙醇；
在本发明的又一个优选技术方案中，步骤(4)中所说的洗涤是：依次用无水乙醇、丙酮和乙醚进行洗涤；
在本发明的又一个优选技术方案中，步骤(4)中所说的干燥为真空干燥、干燥温度为50℃。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1
取生药艾叶2.0kg，煎煮提取两次，每次1小时，每次加10倍量水，合并2次滤液。滤液于50℃减压浓缩至500mL，加入乙醇，使其浓度为65v/v％，静置12小时后，离心20分钟，弃上清液，沉淀物于50℃下减压干燥。干燥后的沉淀物与400mL的去离子水混合，再加入200mL10wt％的三氯醋酸溶液，充分搅拌，放置4小时后离心20分钟，弃沉淀，向清液中加入乙醇，使其浓度为75v/v％，醇沉(静置)24小时后离心得取沉淀物，将所得沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、和乙醚进行洗涤，再经50℃下真空干燥得艾叶多糖提取物24g。
实施例2
取生药艾叶2.0kg，煎煮提取两次，每次1小时，每次加10倍量水，合并2次滤液。滤液于50℃减压浓缩至500mL，加入乙醇，使其浓度为80v/v％，静置12小时后，离心20分钟，弃上清液，沉淀物于50℃下减压干燥。干燥后的沉淀物与400mL的去离子水混合，采用Sevag法脱蛋白，共处理7次。向经Sevag法脱蛋白后所得的清液中加入乙醇，使其浓度为75v/v％，醇沉(静置)24小时后离心得取沉淀物，将所得沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、和乙醚进行洗涤，再经50℃下真空干燥得艾叶多糖提取物38g。
对实施例1或实施例2所提取的艾叶多糖提取物进行有关抗肿瘤药效学及毒理学研究，具体如下：
实施例3
按实施例1所述的提取方法提取的艾叶多糖提取物(简称：AYTP)静脉注射对小鼠移植性肿瘤Heps的抑制作用：
取ICR小白鼠(18-22g，雌雄各半；由中国科学院上海试验动物中心提供)40只，按移植性肿瘤研究法接种Heps实体型，接种24小时后称鼠重，随机分为4组，每组10只，雌雄各半，空白对照组与环磷酰胺(CTX，30mg/kg)组分别为阴、阳生对照组。AYTP组设高、低二个剂量组(100、50mg/kg)。接种24小时后静脉注射给药，隔天一次，共给药4次，于停药后第2天小鼠称重，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤重，计算各组平均瘤重，按下列公式求出肿瘤抑制率(抑瘤率)，并将所得数据进行统计学处理(t检验)。结果见表1。
表1
| 组别 | 剂量 | 体重(g) | 瘤重 | 抑瘤率 | |
| (mg/kg) | 给药前 | 给药后 | (g) | (％) | |
| 对照组AYTPCTX | -1005030 | 19.8±1.4819.9±1.8520.2±1.4020.1±1.66 | 26.4±2.0722.4±2.50**23.9±2.08*22.9±2.08** | 1.50±0.220.64±0.19**0.83±0.21**0.46±0.19** | -57.4944.4569.45 |
* P＜0.05 **P＜0.01 与空白对照组比较
由表1可知：与空白对照组相比，多糖AYTP各剂量组、CTX组均有显著抑制Heps的肿瘤生长作用(P＜0.01)，其中多糖AYTP各剂量组对动物体重影响较大(P＜0.01)。阳性药CTX对移植瘤的抑制作用也很明显(P＜0.01)，对小鼠体重影响也较大。
实施例4
AYTP静脉注射对小鼠移植性肿瘤Eac的抑制作用：
取ICR小白鼠(18-22g，雌雄各半；由中国科学院上海试验动物中心提供)40只，按移植性肿瘤研究法接种Eac实体型；接种24小时后称鼠重，随机分为4组：空白对照组(生理盐水)、AYTP：100mg/kg、AYTP：50mg/kg、CTX：30mg/kg，每组10只，雌雄各半；接种24小时后尾静脉注射给药，给药体积0.4ml/20g；隔天一次，共给药4次，于停药后第2天小鼠称重，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤重，所得数据进行统计学处理，结果见表2
表2
| 组别 | 剂量 | 体重(g) | 瘤重 | 抑瘤率 | |
| (mg/kg) | 给药前 | 给药后 | (g) | (％) | |
| 对照组AYTPCTX | -1005030 | 19.9±1.6019.6±1.4319.8±1.8120.1±0.99 | 27.2±2.5321.6±3.10**22.8±1.87**24.1±1.91** | 1.43±0.340.70±0.18**0.78±0.22**0.46±0.11** | -50.9145.8168.02 |
**P＜0.01 与空白对照组比较
由表2可知：与空白对照组相比，AYTP各剂量组均可显著抑制小鼠移植瘤Eac的生长(P＜0.01)，但100，50mg/kg剂量组对动物体重影响较大(P＜0.01)。阳性药CTX对移植瘤的抑制作用也很明显(P＜0.01)，对小鼠体重影响也较大。
实施例5
AYTP的急性毒性实验：
急性毒性实验设六个剂量组，每剂量组10只小鼠(18-22g，雌雄各半；由中国科学院上海试验动物中心提供)，药物剂量按等比递增，比值0.8，分别为245.76、307.2、384、480、600、750mg/kg，尾静脉注射，给药体积0.4ml/只，一次注射后，在24小时后多次观察，连续观察7天。记录动物的毒性反应情况和死亡动物的分布，死亡动物及时进行尸检，并记录病变情况，若有肉眼可见病变组织时，需进行该组织的病理形态学检查。结果用Bliss统计方法计算LD50值，结果见表3。
表3
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数 | 死亡动物数 | 死亡率(％) | 对数剂量 | P+5 |
| 123456 | 245.76307.2384480600750 | 101010101010 | 124599 | 10.020.040.050.090.090.0 | 2.3912.4872.5842.6812.7782.875 | 3.7204.1604.4505.0006.2806.280 |
由表3可知：小鼠静脉注射给药后中毒症状为茸毛卷卧，步履蹒跚，活动减少，嗜睡，呼吸减慢。死亡动物解剖，各脏器未见明显异常。结果表明艾叶多糖毒性较小，安全范围大。
实施例6
AYTP诱导脾脏淋巴细胞增殖试验：
首先将制备好的脾细胞(来源于ICR小白鼠)悬液加入96孔细胞培养板，100μl/孔。然后加入样品，100μl/孔，每份样品的每一浓度(终浓度分别为100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL)复3孔；同时，设立阳性对照和阴性对照，其中阳性对照香菇多糖终浓度为50μg/mL，阴性对照仅加RPMI-1640完全培养基(GIBCO生命技术公司产品)。将加好样品的细胞板置5％C02细胞培养箱中，37℃培养44小时。取出细胞板，加MTT，20μl/孔，继续培养4小时。取出细胞板，离心(3,000rpm×5min)，弃上清液；加DMSO，100μl/孔，37℃振荡裂解细胞10min；用酶联免疫检测仪测定OD492值，结果见表4。
表4
平均值±标准偏差(SD)
由见表4可知：AYTP对小鼠脾淋巴细胞有明显的诱导增殖作用，且有显著的剂量依赖性。
实施例7
AYTP对ConA、LPS诱导淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的影响：
采用酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒对细胞因子含量进行测定(ELISA试剂盒专门用于测定IFN-γ、IL-2和TNF-α的含量变化)，研究AYTP各部位对细胞因子的诱生作用，结果见表5～7。
表5艾叶多糖对ConA、LPS诱导淋巴细胞分泌IFN-γ的影响结果
表6艾叶多糖对ConA、LPS诱导淋巴细胞分泌IL-2的影响结果
表7艾叶多糖对ConA、LPS诱导巨噬细胞分泌TNF-α的影响结果
实验结果见表5～7。艾叶多糖各部位对ConA、LPS诱导的淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α有明显的促进作用，并且有明显的剂量依赖性。
以实施例2所述的提取方法提取的艾叶多糖提取物重复实施例3～7的实验可得相同的结论，在此不再赘述。
Claims (10)
1、一种艾(Artemisia argyi)叶多糖提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
2、一种艾(Artemisia argyi)叶多糖提取物在制备增强免疫功能的药物中的应用。
3、如权利要求1或2所说的应用，其特征在于，其中所说的艾叶多糖提取物的提取方法包括如下步骤：
(1)将生药艾叶用水煎煮0.5～2小时，过滤，保留滤液；
(2)向由步骤(1)所得的滤液中加入沉淀剂，使沉淀剂在滤液中的浓度为65v/v％～80v/v％，得沉淀物，过滤，保留沉淀物；
(3)将由步骤(2)所得的沉淀物与水混合，离心，保留上清液；
(4)将由步骤(3)所得的上清液进行脱蛋白后获得上清液，向该上清液中加入沉淀剂后得沉淀物，过滤，所得沉淀物经洗涤和干燥后即为目标物。
4、如权利要求3所说的应用，其特征在于，步骤(1)中生药艾叶与水的重量比为1∶(5～15)。
5、如权利要求4所说的应用，其特征在于，其中生药艾叶与水的重量比为1∶(9～12)。
6、如权利要求3所说的应用，其特征在于，步骤(1)中所说滤液的pH值控制在5.0～8.0。
7、如权利要求3所说的应用，其特征在于，其中所说的沉淀剂为甲醇、乙醇或丙酮。
8、如权利要求7所说的应用，其特征在于，其中所说的沉淀剂为乙醇。
9、如权利要求3所说的应用，其特征在于，步骤(4)中所说的洗涤是：依次用无水乙醇、丙酮和乙醚进行洗涤。
10、如权利要求3所说的应用，其特征在于，步骤(4)中所说的干燥为真空干燥，干燥温度为50℃。
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