CN111607534A - 植物乳杆菌及其在具有缓解便秘功效的果蔬酵素中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开的属于食品加工技术领域，具体为植物乳杆菌及其在具有缓解便秘功效的果蔬酵素中的应用，其包括：植物乳杆菌及其在具有缓解便秘功效的果蔬酵素中的应用。该植物乳杆菌具有产酸性强、耐酸性强、可抑制病原菌的特性，命名为植物乳杆菌JYL008，其保藏号为CGMCC NO.18968。该菌在具有缓解便秘功效的果蔬酵素中的应用，包括以下步骤：S1原料预处理；S2一次加料；S3二次加料；S4研磨；S5植菌；S6发酵；S7罐装保藏。本发明的特点在于应用益生菌发酵，具有改善胃肠道功能、降低胆固醇、降解亚硝酸盐等生理功能，同时发酵基质为不同种果蔬，富含膳食纤维，添加辅料为功能性糖醇，证实对缓解便秘有较好的功效且见效快。

Description

植物乳杆菌及其在具有缓解便秘功效的果蔬酵素中的应用

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，具体为植物乳杆菌及其在具有缓解便秘功效的果蔬酵素中的应用。

背景技术

生物发酵饮料是新型的保健饮料，采用发酵技术使物料在发酵过程中形成某些新营养成分，以增加一些新的功效。发酵果蔬汁是指以或多种新鲜果蔬为原料，经多种或单一乳酸菌发酵而成的果蔬汁类饮料。其利用微生物发酵萃取天然果蔬原料精华，浓缩了微生物代谢生成的有机酸、功能性低聚糖、多肽等功能成分。发酵果蔬汁为具有特殊风味的乳酸发酵制品，不添加任何防腐剂，有良好的感官品质，其成本低廉、原料多样、食用方便。

乳酸菌是人和动物肠道内重要的生理性有益菌。乳酸菌进入宿主肠道后，可特异性的黏附定植于肠粘膜表面形成生物膜。一方面通过空间占位作用抑制病原菌的粘附和侵入，另一方面可通过代谢产生细菌素或有机酸等物质抑制致病菌的生长和繁殖，发挥其有益的生理促进作用。但大多数乳酸菌对外界环境耐受能力差，作为有效的益生菌菌株必须能够通过低pH值的胃液、且具有一定的胆盐的耐受性。当到达肠道的乳酸菌具有一定数量及活性时，才能产生人体生长发育必须的维生素、氨基酸等营养物质；才能调节肠道内环境，减少病理性菌群数量，增加肠动力。

发酵果蔬汁对缓解便秘难题具有一定功效。一方面是因为发酵果蔬汁富含有机酸、低聚糖、膳食纤维等，功能性便秘和肥胖都被证明与膳食纤维摄入较少有关。膳食纤维作为不能被人体消化的碳水化合物，可以分成两个基本类型：不溶性膳食纤维(IDF)和可溶性膳食纤维(SDF)。水溶性膳食纤维能增加粪便持水能力，水不溶性膳食纤维能促进肠道蠕动，二者均能起到润肠通便的作用，进而改善便秘。另一方面是益生菌的作用，乳酸菌在肠道内定植后，代谢产生有机酸，能够使肠腔的pH降低，具有润肠通便功效，促进肠道正常功能恢复；同时，乳酸菌定植在肠道上皮细胞，与其他致病菌竞争肠道位点，抑制肠道内病原菌的滋生，改善肠道菌群微环境，促进排便。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

本发明的目的是提供产酸、耐酸能力强，可有效抑制多种致病菌的乳杆菌，同时，还提供了利用该乳杆菌在具有缓解便秘功效的果蔬酵素中的应用。解决了果蔬汁容易变质、有青臭味等缺点，也避免了传统果蔬发酵中含盐量高以及杂菌污染而导致食物中毒的风险，并发现了缓解便秘问题的配方、发酵菌种以及发酵条件，达到了发酵时间短、发酵风味好，对调节肠道微环境、缓解便秘起到很好的效果。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：

本发明公开了产酸、耐酸能力强的乳酸菌，其菌落形态特征：将菌种划线接种于MRS培养基上，37℃培养36h，菌落直径2-3mm，菌落圆形隆起，颜色为乳白色，不透明，菌落边缘光滑，无不规则，显微镜检菌体呈现短杆状，过氧化氢酶试验阴性，发酵液有明显乳酸风味。

进一步，本发明提供的乳酸菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。于2019年11月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏编号为CGMCC No.18968，名称为植物乳杆菌JYL008。

对该株菌进行16S rRNA测序，测序结果有如SEQ.ID.NO1所示的核苷酸序列。

进一步，本发明中，该植物乳杆菌的产酸能力较强，2％(v/v)接种量接种于MRS液体培养基(pH调至6.2)中培养24h，每2h检测一次pH，实验结果表明培养6-16h内，pH呈现急速下降，pH＝3.7-3.8趋于平稳。产酸能力强，使发酵环境呈酸性，能够有效抑制腐败微生物的生长，从而使发酵更利于防腐。

进一步，本发明该植物乳杆菌的耐酸能力较强。用0.1mol/L的盐酸将生理盐水的初始pH调整至1.5；2.5和3.5，2％(v/v)接种量接种JYL008于三种pH的生理盐水中开始计时，取0h、1h、2h、3h的待测液进行平板活菌计数，结果表明，在pH为2.5和3.5的培养基中，JYL008存活率维持在较高水平，当pH＝1.5时，JYL008存活率明显下降，3h后存活率为54.3％。从整体看来，该植物乳杆菌JYL008的酸适应能力强，饮用后可保障进入肠道的数量以及活力，进一步定植肠道，可调节肠道内环境，产生短链脂肪酸，γ-氨基丁酸等营养成分，提升肠动力。

进一步，本发明对该植物乳杆菌的抑菌能力进行研究。用牛津杯法检测该菌发酵液对于致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌)的抑菌圈，实验结果表明JYL008对这三种致病菌有明显的抑制作用，抑菌圈直径均大于10mm。饮用后可调节肠道菌群，从而改善胃肠道功能，增强免疫力。

本发明还提供该植物乳杆菌在具有缓解便秘功效的果蔬酵素中的应用，主要包括以下步骤：

将果蔬按照配方进行清洗、消毒、破碎，一次加料为固体辅料糖醇，二次加料为水果发酵原液，研磨两次，植入活化的植物乳杆菌JYL008进行搅拌，倒入已灭菌的发酵罐中，进行无氧发酵，制得活菌型果蔬酵素，对其缓解便秘的功效进行验证。

(1)进一步，本发明的优选方案：所述的果蔬原料均为有机果蔬，种类及比例为：胡萝卜30-50％、地瓜5％-15％、番茄10％-20％、花椰菜5％-15％、红根甜菜5％-25％、丝瓜10％-15％。果蔬优选为新鲜脆嫩、无腐烂、无病虫害的果蔬。切成长10cm左右的块状，方便清洗破碎。

(2)进一步，本发明的优选方案：所述果蔬预处理是指果蔬按配比称取，用臭氧水进行清洗两次，臭氧熏蒸30min，尽可能多的消除果蔬表面杂菌，避免致病菌残留。用破碎机将果蔬破碎，加入1.6倍重量无菌水。

(3)进一步，本发明的优选方案：所述辅料是指优选纯度＞99％的木糖醇、麦芽糖醇作为辅料。按果蔬汁总重的5％加入木糖醇，15％加入麦芽糖醇，添加前紫外熏蒸30-60min，目的是将辅料杀菌消毒，防止添加过程带入杂菌。

(4)进一步，本发明的优选方案：所述水果发酵原液是指利用乳酸菌、醋酸菌、酵母菌混合菌剂发酵水果，水果原料优选以菠萝为主，还包括木瓜、苹果、猕猴桃、葡萄等水果中的或几种，发酵至pH＝3.0-3.5停止。

(5)进一步，本发明的优选方案：所述水果发酵原液预处理是指水果发酵原液进行巴氏灭菌，冷却后按果蔬汁和辅料总重的10％加入，目的是调节果蔬汁酸碱度，控制初始发酵pH＝4.1-4.6，可抑制果蔬汁残留的不耐酸杂菌生长，确保发酵全过程无致病菌干扰。

(6)进一步，本发明的优选方案：所述研磨是指果蔬基质二次加料后，需要进行2次研磨，优选消毒处理过的研磨机进行研磨，最终得到粒径小于2mm的果蔬匀浆，利于乳酸菌充分发酵获得营养成分高的果蔬酵素。

(7)进一步，本发明的优选方案：所述乳酸菌是指用单一菌株植物乳杆菌JYL008，活化乳酸菌的方法为：将-80℃保藏的JYL008接种于MRS液体培养基中，于37℃培养18-24h，得到的菌液再转接于MRS液体培养基中，如此反复2-3次，得到活化的乳酸菌。

(8)进一步，本发明的优选方案：所述发酵罐是指密封效果好的微生物发酵装置，防止外来微生物入侵，确保接入容器内具有良好的厌氧环境，供乳酸菌充分生长代谢。

(9)进一步，本发明的优选方案：所述发酵温度优选26-30℃，发酵时间优选72-96h。该发酵条件下果蔬酵素的活菌数量较高，酸度适中、口感最佳。

与现有技术相比：

1、利用植物乳杆菌JYL008作为发酵菌种，该菌种具有产酸能力强，耐酸性能强，且可抑制病原菌的特性，有利于通过胃液，顺利在肠道定植发挥功效。乳酸菌利用原料的可溶性物质代谢产生多种氨基酸、维生素和酶；提高了果蔬汁的营养价值。

2、发酵前在果蔬汁中添加水果发酵原液，将初始发酵pH控制在4.1-4.6之间，有效控制杂菌滋生，使产品质量稳定。

3、乳酸菌发酵果蔬汁产生大量的乳酸，对发酵果蔬汁风味形成有重要意义。因为乳酸本身就是较好的调味剂，其酸味较醋酸柔和、爽口，可使果蔬汁独具风味，相比纯果蔬汁更能被大众接受。

4、本产品为低糖产品，选用糖醇来增加果蔬汁甜度，糖醇热量低且对人体血糖值上升基本无影响，作为安全的甜味剂、营养补充剂，被大众接受。

附图说明

图1为YL008显微镜检(10*100)示意图；

图2为JYL008菌落形态图；

图3为JYL008产酸能力曲线图；

图4为JYL008耐酸能力曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：植物乳杆菌JYL008的分离、鉴定、保藏；

1、乳酸菌的分离

从市售的有机花椰菜汁取10mL，低温带回实验室，用稀释涂布法涂布于MRS固体培养基中，37℃恒温培养2d，挑选出疑似乳酸菌的菌落，用革兰氏染色法判断为革兰氏阳性菌，显微镜观察菌体为杆状菌。将筛选得到的菌命名为JYL008，保藏于-80℃冰箱中。

2、乳酸菌的鉴定保藏

通过生理生化鉴定结果表明：JYL008菌株革兰氏染色为阳性菌、短杆状(图1)，在MRS固体培养基上菌落呈乳白色、圆形、边缘整齐(图2)；发酵液具典型的乳酸风味，过氧化氢酶试验阴性。

通过对新鲜菌液的16S rRNA区域进行PCR扩增、纯化、测序，测序结果用NCBI在线BLAST，同源性达到99％以上的多个菌株为植物乳杆菌，结合生理生化结果，确定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2019年11月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏编号为CGMCCNo.18968，名称为植物乳杆菌JYL008。

实施例2：乳酸菌的产酸能力、耐酸能力、发酵液抑菌能力检测；

1、乳酸菌的产酸能力

植物乳杆菌JYL008经活化后，按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基(pH调至6.2)中，37℃恒温培养箱中培养24h，期间每隔2h取样，测定其pH，将JYL008产酸能力随时间变化用曲线(图3)表示。明显看出JYL008的产酸速度快，产酸的能力强。培养16h以后pH值基本维持在3.80上下。该菌产酸能力强，使得应用于工业发酵时，在发酵液中可抑制其他不耐酸杂菌的生长，消除腐败菌产生的毒素，避免发酵液污染、腐败。

2、乳酸菌的耐酸能力

用0.1mol/L的盐酸将生理盐水的初始pH调整至1.5、2.5和3.5，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。将活化后的植物乳杆菌JYL008以2％(v/v)的接种量分别接种到不同pH值的生理盐水中，37℃恒温放置，分别于0、1、2、3h取样，采用平板计数法测定活菌数。按下列公式计算存活率，并用曲线图(图4)表示。通过对JYL008的耐酸性能力进行实验，pH＝3.5和pH＝2.5的酸性条件下，该菌在0-3h的存活率均大于95％，pH＝1.5的酸性条件下，3h存活率在54.3％。总体来看，植物乳杆菌JYL008的耐酸能力强，通过胃液进入肠道的乳酸菌数量多，而且能够保持菌种的活力，从而改善人体肠道功能，定植在肠道中形成抗菌生物屏障，维护人体健康。

存活率(％)＝不同作用时间下的乳酸菌活菌数/初始乳酸菌活菌数×100

3、乳酸菌发酵液抑菌能力

植物乳杆菌发酵可以代谢产生抑菌物质，使发酵液具有抑菌活性。具体步骤如下：

(1)将指示病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌甘油管接种于LB液体培养基(蛋白胨2％；酵母粉1％；NaCl 2％)中，37℃，150rpm/min培养14-16h。

(2)植物乳杆菌JYL008以2％(v/v)的接种量接种到灭菌冷却后的MRS液体培养基，37℃恒温培养36-40h。

(3)利用牛津杯法进行抑菌圈的检测。取直径90mm的平板，距离中心点2cm处等距离放置4个牛津杯。取灭菌后的LB半固体培养基20-30mL，冷却致45-52℃，取大肠杆菌菌液50-80uL，加入培养基中，混匀后立即缓慢倒入放置牛津杯的平板上，均匀摊布。待培养基冷却凝固后，用无菌镊子将牛津杯取出，留下四个直径均等的孔洞。每个孔洞加入JYL008发酵液200uL。另外金黄色葡萄球菌和沙门氏菌致病菌的抑菌圈实验同上，每种致病菌做3个平板的平行。结束后，轻取培养皿放入37℃培养箱，培养24h后检测抑菌圈直径。记录每种致病菌抑菌圈的平均直径，如下表所示。

致病菌	大肠杆菌	沙门氏菌	金黄色葡萄球菌
				抑菌圈直径(mm)	12.2±0.5	11.3±0.5	13.3±0.3

如上表所示，植物乳杆菌发酵液对于大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。作为常用的益生菌，一方面能够产生乳酸等物质降低肠道内的pH值，从而使适宜碱性环境生长的腐败菌无法增值。另一方面，乳酸菌在代谢过程中产生乳酸菌素等代谢产物，具有抑制和杀死多数革兰氏阳性致病菌和腐败菌的作用，实现保护肠粘膜、改善肠道微环境的功能。

实施例3：植物乳杆菌JYL008在具有缓解便秘功效的果蔬酵素中应用，主要包括以下步骤：

S1：果蔬原料预处理：选择新鲜清脆、无虫害、无腐烂、无农药的有机果蔬按照配比称取作为发酵的基质，切成长10cm左右的块状，利用臭氧水冲洗2次，置于密闭室内臭氧熏蒸30min，完成清洗消毒，将消毒后的果蔬利用破碎机破碎，以1∶1.6比例加入果蔬汁和无菌水；

S2：一次加料：加入的固体辅料为麦芽糖醇和木糖醇，按照果蔬汁重量比例添加，添加前进行臭氧熏蒸30-60min；

S3：二次加料：水果发酵原液经过巴氏灭菌后，按照果蔬汁和糖醇总重计，加入量为10％，搅拌后取样测pH值为4.1-4.6；

S4：研磨，加料后的基质投入消毒后的研磨机中，进行两次研磨，最终得到粒径小于2mm的果蔬匀浆，一方面有纤维颗粒便于增进肠道蠕动，另一方面纤维粒径小，有利于乳酸菌充分发酵；

S5：植菌，加入活化植物乳杆菌JYL008，将活菌数控制在10⁹CFU/mL，接种比例0.8-1.2％；

S6：发酵，温度控制26-30℃，于发酵罐中密封发酵，发酵72-96h，发酵结束pH值为3.2-3.7，发酵液活菌数＞10⁷CFU/mL；

S7：灌装保藏，活菌型果蔬酵素需保藏于4℃，1个月内为最佳饮用期，其益生菌CFU＞10⁶。

根据发酵果蔬的色泽、香气、口感进行感官评价，评定小组为专业的评价人员所构成(即由受过专业感官评价培训的人员组成)，共10人，采用描述性的方法对样品的色泽、香气、口感进行描述，以感官评价的结果作为发酵果蔬的一项指标，依据评分，本发明的实施例1已经对原料配比、发酵工艺进行了不断的修正和完善，使产品的感官评价结果达到8分-10分。

以下为感官评价项目和评分标准表

本发明实施例3发酵得到的果蔬酵素可以缓解便秘症状，通过以下具体实例来评价其效果。

具体实例：

(1)陈某，男，42岁，公司职员，便秘史6年，平均4-5天排便一次，秋冬季更为严重，排便有圆粒状。平时有使用开塞露治疗，治疗期间情况好转，停药就复发。饮用本产品两周，排便次数增加，第一天饮用4h内大便两次，之后平均一天排泄一次，大便较为顺畅，大便量多，排便不尽的感觉基本消除。之后连续饮用1个月后间断性饮用，排便已正常，便秘无复发。

(2)王某，女，36岁，事业单位工作人员，间断性大便干结，排便困难，肛门疼痛。偶尔出现便血的情况，多次就医未能痊愈。饮用本产品第一天，排便三次，大便成形，没有腹痛感，伴随肠道蠕动感，放屁增多。连续饮用本产品一周，排便频率增加，大便不费力，排便平均时间也缩短至3分钟以内，腹胀感消失。之后坚持饮用三周，已解决便秘难题。

本发明中利用的果蔬及配比为胡萝卜30-50％、地瓜5％-15％、番茄10％-20％、花椰菜5％-15％、红根甜菜5％-25％、丝瓜10％-15％。但是不限于这几种果蔬和配比，可以根据实际情况，选择不同种果蔬、不同比例混合在一起，只要达到果蔬配方中含有较多量的膳食纤维以起到缓解便秘功效。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.植物乳杆菌及其在具有缓解便秘功效的果蔬酵素中的应用，其特征在于，该菌为植物乳杆菌JYL008，其保藏号为CGMCC NO.18968。

2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于，该菌的16S rRNA序列为SEQ.ID.NO1。

3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌能够缓解便秘功效的果蔬酵素中应用。

4.根据权利要求3所述植物乳杆菌在具有缓解便秘功效的果蔬酵素中的应用，其特征在于该应用包含以下步骤：

S1：果蔬原料预处理：选择新鲜清脆、无虫害、无腐烂、无农药的有机果蔬按照配比称取作为发酵的基质，切成长10cm左右的块状，利用臭氧水冲洗2次，置于密闭室内臭氧熏蒸30min，完成清洗消毒，将消毒后的果蔬利用破碎机破碎，以1∶1.6比例加入果蔬汁和无菌水；

S2：一次加料：加入的固体辅料为麦芽糖醇和木糖醇，按照果蔬汁重量比例添加，添加前进行臭氧熏蒸30-60min；

S3：二次加料：水果发酵原液经过巴氏灭菌后，按照果蔬汁和糖醇总重计，加入量为10％，搅拌后取样测pH值为4.1-4.6；

S4：研磨，加料后的基质投入消毒后的研磨机中，进行两次研磨，最终得到粒径小于2mm的果蔬匀浆，一方面有纤维颗粒便于增进肠道蠕动，另一方面纤维粒径小，有利于乳酸菌充分发酵；

S5：植菌，加入活化植物乳杆菌JYL008，将活菌数控制在10⁹CFU/mL，接种比例0.8-1.2％；

S6：发酵，温度控制26-30℃，于发酵罐中密封发酵，发酵72-96h，发酵结束pH值为3.2-3.7，发酵液活菌数＞10⁷CFU/mL；

S7：灌装保藏，活菌型果蔬酵素需保藏于4℃，1个月内为最佳饮用期，其益生菌CFU＞10⁶。

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