CN111574607B - 一种基于微生物发酵从非洲竹芋中提取索马甜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于微生物发酵从非洲竹芋中提取索马甜的方法。由于竹芋果实中索马甜蛋白与纤维素等多糖交联在一起严重影响索马甜的提取效果，本发明利用黑曲霉和枯草芽孢杆菌在适宜的发酵环境下能合成降解纤维素和多糖的纤维素酶和淀粉酶来解除多糖类物质对索马甜提取的影响，而且本发明竹芋的核与果肉中含有的索马甜同时被提取。因此，提取步骤少，提取成本低，环境污染小，索马甜的甜度损失率能控制在16%‑28%。同时还提高了提取产量，相比于传统单纯果肉中索马甜的提取，索马甜的产量增加了22%‑31%。

Description

一种基于微生物发酵从非洲竹芋中提取索马甜的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于微生物发酵从非洲竹芋中清洁提取索马甜的生产技术。
背景技术
索马甜是非洲竹芋中提取的一种天然甜味蛋白，具有高甜度、低热量、安全无毒等特点，是一种高甜度而又不含糖的新型甜味剂。索马甜可用作香烟、酒水、饮料和糖果等食品中，能够满足高血压、糖尿病和肥胖患者对甜味的需求。索马甜也可用作饲料添加剂，改良饲料的适口性，增加牲畜的食欲，提高牲畜的生产效率。索马甜还可用作药物的辅料，降低药品的苦味，方便用药，尤其在婴幼儿和儿童药品方面效果显著。因此，索马甜在食品加工、饲料和医药等领域都具有良好的应用前景，并展现出很高的商业价值。
目前，从非洲竹芋中提取高品质索马甜报道很少。已报到的从竹芋中提取索马甜的技术主要包括以下步骤：洗净、去核、打浆、离子交换、膜过滤、凝胶层析、醇沉、离心、过滤、调pH、降温和结晶等步骤。通过比较研究发现，已报道的方法步骤复杂，索马甜的甜度损失率高达55％以上，提取成本高，环境污染显著，并且传统提取方法中竹芋果实都除去核籽，而竹芋果实核籽中也含有丰富的索马甜，目前现有的从非洲竹芋中提取索马甜的技术对竹芋果实中的索马甜未能得到充分提取。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明提供一种从非洲竹芋中清洁高效提取索马甜的方法。本发明减少了提取步骤，降低了提取成本，避免了传统提取方法中核籽原料的损失，一次性将竹芋果实的果肉和核中的索马甜都充分提取，所述清洁即为环境污染较小。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种基于微生物发酵从非洲竹芋中提取索马甜的方法，包括以下步骤：
(1)将竹芋洗净，切分，加冰，加0.5-1％的甘油水溶液，果肉和核一起打浆；
(2)在浆液中同时接种黑曲霉ATCC 16404、ATCC 6275和枯草芽孢杆菌ATCC6051、ATCC 9327，发酵温度25-40℃，发酵12-24小时；
(3)离心去除微生物及杂质；
(4)调节上清液的pH至10-13，离心得到索马甜粗品；
(5)用4-8℃的0.1-0.8％的甘油水溶液溶解索马甜粗品，然后用葡聚糖凝胶(Sephadex G50)过滤得到索马甜溶液；
(6)调节步骤(5)获得的索马甜溶液的pH至10-13(最佳为11-12)，温度降至1-4℃，离心获得纯度为55-65％的索马甜样品；
(7)索马甜保存于0.5％的甘油溶液中。
优选地，上述方法步骤(1)中，所述加冰质量为非洲竹芋鲜果质量的1-2倍，加0.5％-1％的甘油水溶液质量为非洲竹芋鲜果质量的2-3倍。
进一步地，上述方法步骤(1)中，甘油水溶液的浓度为0.6-0.8％。
优选地，上述方法步骤(2)中，黑曲霉ATCC 16404和ATCC 6275的种子培养基组分为0.1-0.2％碳酸钙，0.05-0.1％氯化镁，0.05-0.1％氯化亚铁，0.1-0.3％氯化钠，0.2-0.3％牛肉膏，0.1-0.2％蛋白胨，0.1-0.2％酵母粉，2-3％果糖，甘油1-2％，培养温度30-32℃；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的种子培养基组分为0.3-0.5％牛肉膏，0.5-0.7％蛋白胨，0.3-0.6％酵母粉，甘油0.5-1％，0.2-0.3％碳酸钙，0.1-0.15％氯化镁，0.5-0.8％氯化钠，培养温度为35-37℃。
优选地，上述方法步骤(2)中，发酵温度为28-35℃，发酵时间为15-18小时。
优选地，上述方法步骤(2)中，黑曲霉ATCC 16404和ATCC 6275的接种量分别为3-5％和2-3％；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的接种量分别为1-2％和2-3％。
优选地，上述方法步骤(4)中，调节上清液的pH至11-12。
优选地，上述方法步骤(5)中，用5-6℃的0.5％的甘油水溶液溶解索马甜粗品。
优选地，上述方法步骤(6)中，调节上清液的pH至11-12，温度降至1-2℃。
与现有技术相比，本发明的方法的有益效果如下：
由于竹芋果实中索马甜蛋白与纤维素等多糖交联在一起严重影响索马甜的提取效果，降低提取收率。本发明中黑曲霉和枯草芽孢杆菌在适宜的发酵环境下能合成降解纤维素和多糖的纤维素酶和淀粉酶，用以解除多糖类物质对索马甜提取的影响，降低索马甜提取难度，增加提取产量。本发明提取步骤少，提取成本低，清洁高效，索马甜的甜度损失率能控制在16％-28％。与此同时，竹芋核中含有的索马甜在本发明中也与果肉同时被提取，增加了提取产量，相比于传统单纯果肉中索马甜的提取，索马甜的产量增加了22％-31％。
具体实施方式
通过以下详细说明可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本发明实施例中索马甜含量的检测采用已报道的专利“一种饮料中索马甜的检测方法(申请号：201811529088.0)”的检测方法。黑曲霉ATCC 16404、ATCC6275和枯草芽孢杆菌ATCC 6051、ATCC 9327可从中国典型培养物保藏中心(武汉大学)购买。
索马甜的甜度用感官评价的方法进行评定，具体评定方法如下：用0.5％的甘油水溶液配置相同质量浓度的索马甜标准品和索马甜提取物溶液，组织20人进行索马甜甜度评价，规定索马甜标准品的甜度为100分，从而计算索马甜提取物的甜度损失率。
索马甜样品甜度评分表
实施例1
(1)将竹芋洗净，切分，加1倍非洲竹芋鲜果质量的冰，加2倍非洲竹芋鲜果质量的0.5％的甘油水溶液，果肉和核一起打浆；
(2)在浆液中同时接种黑曲霉ATCC 16404、ATCC 6275和枯草芽孢杆菌ATCC6051、ATCC 9327，发酵温度40℃，发酵12小时；黑曲霉ATCC 16404和ATCC 6275的种子培养基组分为0.1％碳酸钙，0.05％氯化镁，0.05％氯化亚铁，0.1％氯化钠，0.2％牛肉膏，0.1％蛋白胨，0.1％酵母粉，2％果糖，甘油1％，培养温度30℃；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的种子培养基组分为0.3％牛肉膏，0.5％蛋白胨，0.3％酵母粉，甘油0.5％，0.2％碳酸钙，0.1％氯化镁，0.5％氯化钠，培养温度为35℃。黑曲霉ATCC 16404和ATCC 6275的接种量分别为3％和2％；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的接种量分别为1％和2％。
(3)离心去除微生物及杂质；
(4)调节上清液的pH至10，离心得到索马甜粗品；
(5)用4℃的0.1％的甘油水溶液溶解索马甜粗品，然后用葡聚糖凝胶(SephadexG50)过滤得到索马甜溶液；
(6)调节上清液的pH至10，温度降至4℃，离心获得纯度高达55％的索马甜样品；
(7)索马甜保存于0.5％的甘油溶液中，索马甜结构稳定。
运用本实施例方法，增加了竹芋核中索马甜的提取，相比于单纯果肉中索马甜的提取，索马甜的产量增加了22％，甜度损失率为28％。
实施例2
(1)将竹芋洗净，切分，加2倍非洲竹芋鲜果质量的冰，加3倍非洲竹芋鲜果质量的1％的甘油水溶液，果肉和核一起打浆；
(2)在浆液中同时接种黑曲霉ATCC 16404、ATCC 6275和枯草芽孢杆菌ATCC6051、ATCC 9327，发酵温度25℃，发酵24小时；黑曲霉ATCC 16404和ATCC 6275的种子培养基组分为0.15％碳酸钙，0.08％氯化镁，0.08％氯化亚铁，0.2％氯化钠，0.25％牛肉膏，0.15％蛋白胨，0.15％酵母粉，2.5％果糖，甘油1.5％，培养温度31℃；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的种子培养基组分为0.4％牛肉膏，0.6％蛋白胨，0.5％酵母粉，甘油0.7％，0.25％碳酸钙，0.12％氯化镁，0.6％氯化钠，培养温度为36℃。黑曲霉ATCC16404和ATCC6275的接种量分别为4％和2.5％；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的接种量分别为1.5％和2.5％。
(3)离心去除微生物及杂质；
(4)调节上清液的pH13，离心得到沉淀，得到索马甜粗品；
(5)用8℃的0.8％的甘油水溶液溶解索马甜粗品，然后用葡聚糖凝胶(SephadexG50)过滤得到索马甜溶液；
(6)调节上清液的pH13，温度降至4℃，离心获得纯度高达57％的索马甜样品；
(7)索马甜保存于0.5％的甘油溶液中，索马甜结构稳定。
运用本实施例方法，增加了竹芋核中索马甜的提取，相比于单纯果肉中索马甜的提取，索马甜的产量增加了26％，甜度损失率为23％。
实施例3
(1)将竹芋洗净，切分，加1.5倍非洲竹芋鲜果质量的冰，加2.5倍非洲竹芋鲜果质量的0.7％的甘油水溶液，果肉和核一起打浆；
(2)在浆液中同时接种黑曲霉ATCC 16404、ATCC 6275和枯草芽孢杆菌ATCC6051、ATCC 9327，发酵温度32℃，发酵16小时；黑曲霉ATCC 16404和ATCC 6275的种子培养基组分为0.2％碳酸钙，0.1％氯化镁，0.1％氯化亚铁，0.2％氯化钠，0.2％牛肉膏，0.2％蛋白胨，0.2％酵母粉，3％果糖，甘油1.5％，培养温度32℃；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的种子培养基组分为0.5％牛肉膏，0.7％蛋白胨，0.5％酵母粉，甘油0.8％，0.3％碳酸钙，0.15％氯化镁，0.8％氯化钠，培养温度为37℃。黑曲霉ATCC 16404和ATCC 6275的接种量分别为5％和3％；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的接种量分别为2％和3％。
(3)离心去除微生物及杂质；
(4)调节上清液的pH12，离心得到索马甜粗品；
(5)用5℃的0.5％的甘油水溶液溶解索马甜粗品，然后用葡聚糖凝胶(SephadexG50)过滤得到索马甜溶液；
(6)调节上清液的pH11，温度降至1℃，离心获得纯度高达65％的索马甜样品；
(7)索马甜保存于0.5％的甘油溶液中，索马甜结构稳定。
运用本实施例方法，增加了竹芋核中索马甜的提取，相比于单纯果肉中索马甜的提取，索马甜的产量增加了31％，甜度损失率为16％。
实施例4
(1)将竹芋洗净，切分，加1倍非洲竹芋鲜果质量的冰，加3倍非洲竹芋鲜果质量的0.6％的甘油水溶液，果肉和核一起打浆；
(2)在浆液中同时接种黑曲霉ATCC 16404、ATCC 6275和枯草芽孢杆菌ATCC6051、ATCC 9327，发酵温度35℃，发酵18小时；黑曲霉ATCC 16404和ATCC 6275的种子培养基组分为0.1％碳酸钙，0.1％氯化镁，0.1％氯化亚铁，0.1％氯化钠，0.3％牛肉膏，0.2％蛋白胨，0.1％酵母粉，3％果糖，甘油2％，培养温度32℃；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的种子培养基组分为0.3％牛肉膏，0.7％蛋白胨，0.6％酵母粉，甘油1％，0.3％碳酸钙，0.15％氯化镁，0.8％氯化钠，培养温度为35℃。黑曲霉ATCC 16404和ATCC6275的接种量分别为3％和3％；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的接种量分别为2％和3％。
(3)离心去除微生物及杂质；
(4)调节上清液的pH13，离心得到索马甜粗品；
(5)用7℃的0.8％的甘油水溶液溶解索马甜粗品，然后用葡聚糖凝胶(SephadexG50)过滤得到索马甜溶液；
(6)调节上清液的pH12，温度降至3℃，离心获得纯度高达61％的索马甜样品；
(7)索马甜保存于0.5％的甘油溶液中，索马甜结构稳定。
运用本实施例方法，增加了竹芋核中索马甜的提取，相比于单纯果肉中索马甜的提取，索马甜的产量增加了28％，甜度损失率为21％。
实施例5
(1)将竹芋洗净，切分，加1.8倍非洲竹芋鲜果质量的冰，加2.2倍非洲竹芋鲜果质量的1％的甘油水溶液，果肉和核一起打浆；
(2)在浆液中接种黑曲霉ATCC 16404、ATCC 6275和枯草芽孢杆菌ATCC 6051、ATCC9327，发酵温度28℃，发酵16小时；黑曲霉ATCC 16404和ATCC 6275的种子培养基组分为0.15％碳酸钙，0.07％氯化镁，0.1％氯化亚铁，0.3％氯化钠，0.2％牛肉膏，0.2％蛋白胨，0.1％酵母粉，3％果糖，甘油1.5％，培养温度32℃；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的种子培养基组分为0.4％牛肉膏，0.6％蛋白胨，0.5％酵母粉，甘油0.6％，0.28％碳酸钙，0.1％氯化镁，0.8％氯化钠，培养温度为37℃。黑曲霉ATCC 16404和ATCC 6275的接种量分别为5％和2％；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的接种量分别为1.5％和2％。
(3)离心去除微生物及杂质；
(4)调节上清液的pH至11，离心得到索马甜粗品；
(5)用5℃的0.7％的甘油水溶液溶解索马甜粗品，然后用葡聚糖凝胶(SephadexG50)过滤得到索马甜溶液；
(6)调节上清液的pH至12，温度降至2℃，离心获得纯度高达58％的索马甜样品；
(7)索马甜保存于0.5％的甘油溶液中，索马甜结构稳定。
运用本实施例方法，增加了竹芋核中索马甜的提取，相比于单纯果肉中索马甜的提取，索马甜的产量增加了30％，甜度损失率为18％。
对比例6
(1)将竹芋洗净，切分，去除核籽，加1.5倍非洲竹芋鲜果质量的冰，加2.5倍非洲竹芋鲜果质量的0.7％的甘油水溶液，打浆；
(2)在浆液中同时接种黑曲霉ATCC 16404、ATCC 6275和枯草芽孢杆菌ATCC6051、ATCC 9327，发酵温度32℃，发酵16小时；黑曲霉ATCC 16404和ATCC 6275的种子培养基组分为0.2％碳酸钙，0.1％氯化镁，0.1％氯化亚铁，0.2％氯化钠，0.2％牛肉膏，0.2％蛋白胨，0.2％酵母粉，3％果糖，甘油1.5％，培养温度32℃；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的种子培养基组分为0.5％牛肉膏，0.7％蛋白胨，0.5％酵母粉，甘油0.8％，0.3％碳酸钙，0.15％氯化镁，0.8％氯化钠，培养温度为37℃。黑曲霉ATCC 16404和ATCC 6275的接种量分别为5％和3％；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的接种量分别为2％和3％。
(3)离心去除微生物及杂质；
(4)调节上清液的pH12，离心得到索马甜粗品；
(5)用5℃的0.5％的甘油水溶液溶解索马甜粗品，然后用葡聚糖凝胶(SephadexG50)过滤得到纯度较高的索马甜溶液；
(6)调节上清液的pH11，温度降至1℃，离心获得纯度高达64％的索马甜样品；
(7)索马甜保存于0.5％的甘油溶液中，索马甜结构稳定。
运用实施例3的方法，仅从竹芋果肉中提取索马甜，其索马甜的产量为实施例3的76％，甜度损失率为18％。

Claims (1)

1.一种基于微生物发酵从非洲竹芋中提取索马甜的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将竹芋洗净，切分，加冰，所述加冰质量为非洲竹芋鲜果质量的1-2倍，加0.6-0.8％的甘油水溶液，加0.6-0.8％的甘油水溶液质量为非洲竹芋鲜果质量的2-3倍，果肉和核一起打浆；
(2)在浆液中同时接种黑曲霉ATCC 16404、ATCC 6275和枯草芽孢杆菌ATCC 6051、ATCC9327，发酵温度28-35℃，发酵15-18小时；
(3)离心去除微生物及杂质；
(4)调节上清液的pH至11-12，离心得到索马甜粗品；
(5)用5-6℃的0.5％的甘油水溶液溶解索马甜粗品，然后用葡聚糖凝胶Sephadex G50过滤得到索马甜溶液；
(6)调节步骤(5)获得的索马甜溶液的pH至11-12，温度降至1-2℃，离心获得索马甜样品；
(7)索马甜保存于0.5％的甘油溶液中；
所述步骤(2)中，黑曲霉ATCC 16404和ATCC 6275的种子培养基组分为0.1-0.2％碳酸钙，0.05-0.1％氯化镁，0.05-0.1％氯化亚铁，0.1-0.3％氯化钠，0.2-0.3％牛肉膏，0.1-0.2％蛋白胨，0.1-0.2％酵母粉，2-3％果糖，甘油1-2％，培养温度30-32℃；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC 9327的种子培养基组分为0.3-0.5％牛肉膏，0.5-0.7％蛋白胨，0.3-0.6％酵母粉，甘油0.5-1％，0.2-0.3％碳酸钙，0.1-0.15％氯化镁，0.5-0.8％氯化钠；黑曲霉ATCC 16404和ATCC 6275的接种量分别为3-5％和2-3％；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和ATCC9327的接种量分别为1-2％和2-3％。
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