CN111558613A - 一种生物炭-降解菌复合材料及其在修复PAEs污染土壤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物炭‑降解菌复合材料及其在修复PAEs污染土壤中的应用。本发明制备的生物炭‑XB菌复合材料，能有效保证嗜吡啶红球菌XB菌在土壤中保持相对的稳定，提高嗜吡啶红球菌XB菌活性及其氧化能力，利用本发明的生物炭‑XB菌复合材料，可使污染土壤中DBP和DEHP的去除率分别高达94.3％和83.7％，显著高于单独使用嗜吡啶红球菌XB菌的效果，可大大降低土壤中PAEs的含量，同时减少蔬菜对PAEs的吸收累积，从而保证农产品的质量安全。

Description

一种生物炭-降解菌复合材料及其在修复PAEs污染土壤中的 应用

技术领域

本发明属于土壤污染修复技术领域，具体地，涉及一种降生物炭-降解菌复合材料及其在修复PAEs污染土壤中的应用。

背景技术

邻苯二甲酸酯(PAEs)又称酞酸酯，作为增塑剂被广泛应用于塑料薄膜、个人护理产品、包装材料和农药等的生产原料。近年来，农用塑料薄膜被广泛应用，到2018年，我国农用塑料薄膜使用量高达246.5万吨，PAEs很容易地从塑料薄膜中释放到环境介质中，导致农业土壤受到PAEs的污染严重，部分农田中的PAEs含量高达克/千克数量级，如新疆棉田中6种优先控制PAEs总浓度最高达1232mg/kg，其中以DBP和DEHP污染最为严重，部分土壤中的DBP和DEHP已经超过了美国的土壤控制标准；土壤中的PAEs能被蔬菜等农作物吸收累积，有调查研究发现蔬菜中也普遍检测到PAEs，含量达毫克/千克数量级，影响农作物质量安全。

由于PAEs是一种典型的内分泌干扰物，具有致畸、致癌和致突变性，其对人体健康的长期影响已经引起了全世界的关注。目前，美国环保局将包括邻苯二甲酸正二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)在内的6种PAEs化合物列为优先控制污染物。目前，微生物降解修复土壤PAEs污染是公认最可靠和最经济的技术。已有报道筛选获得PAEs降解菌可以高效甚至完全消除PAEs，然而，在现实的蔬菜栽培中使用这些降解菌，由于受多种环境因素的影响，其对PAEs的消除效率大大降低。

因此如何提高降解菌对土壤中PAEs污染物的生物利用度以提高功能微生物的修复效果，从而有效地修复PAEs污染土壤，对于保障农作物安全生产具有重要的意义。

发明内容

本发明旨在提供一种降生物炭-降解菌复合材料及其在修复PAEs污染土壤中的应用，本发明制备的生物炭-XB菌复合材料，能有效保证嗜吡啶红球菌XB菌在土壤中保持相对的稳定，避免了嗜吡啶红球菌XB菌与其他土壤微生物的竞争作用，提高嗜吡啶红球菌XB菌活性及其氧化能力，可大大降低土壤中PAEs的含量，同时减少蔬菜对PAEs的吸收累积，从而保证农产品的质量安全。

本发明的目的是提供一种生物炭-嗜吡啶红球菌XB菌复合材料。

本发明的另一目的是提供上述复合材料在降低土壤PAEs污染方面的应用。

本发明的再一目的是提供一种降低土壤PAEs污染的产品。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案实现的：

本发明提供了一种生物炭-嗜吡啶红球菌XB菌复合材料，所述菌剂的制备包括以下步骤：

所述复合材料的制备包括以下步骤：

S1.将嗜吡啶红球菌XB菌接种至LB固体培养基上，在恒温箱里28～37℃培养12～24h得到活化的嗜吡啶红球菌XB菌；挑取活化的嗜吡啶红球菌XB菌至LB液体培养基中，震荡培养得到嗜吡啶红球菌XB菌悬液；将菌悬液在3～5℃，4500～5000r/min离心5～10min后，用0.9～1.2％的灭菌生理盐水冲洗菌体，重悬制成菌悬液的浓度为7.5～8.0×10⁸cfu/mL的备用菌液；

S2.将稻草清洗、切段、烘干，在马弗炉中以600～800℃热解4～6h制得生物炭；生物炭冷却至室温后，用酸洗涤脱矿，再用去离子水洗涤去除残留的酸；得到的生物炭烘干、研磨过筛，再将过筛的生物炭粉末于121～130℃下灭菌20～30min，冷却至室温备用；

S3.取步骤S1的备用菌液与步骤S2冷却至室温的生物炭粉末按照100～150mL：50～60g的比例混合均匀，再于30～35℃下干燥，即制得所述降解PAEs的复合材料。

优选地，所述PAEs为邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和/或邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)。

优选地，步骤S3所述备用菌液与生物炭粉末按照100mL：50g的比例混合均匀。

优选地，步骤S1所述震荡培养的震荡速度为120～150r/min，培养为在30～35℃培养10～12h。

最优选地，步骤S1所述震荡培养的震荡速度为150r/min，培养为在30℃℃培养12h。

优选地，步骤S2是将过筛的生物炭粉末于121℃下灭菌30min，

优选地，步骤S1所述冲洗菌体为重复3～5次冲洗菌体。

优选地，步骤S2所述用酸洗涤脱矿为用0.1～0.2M HCl洗涤。

优选地，步骤S2所述烘干为在70～80℃下烘干。

最优选地，步骤S2所述烘干为在80℃下烘干。

优选地，步骤S2所述研磨过筛为过80～100目筛。

优选地，所述LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸馏水1L，琼脂18g，pH为7.2～7.4，经高压蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌21min得到。

优选地，所述LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸馏水1L，pH为7.2～7.4，经高压蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌21min得到。

本发明还提供了上述复合材料在降低土壤PAEs污染方面的应用，是将所述复合材料按照土壤量1～5％(w/w)的比例施加到土壤中。

优选地，将所述复合材料按照土壤量2％(w/w)的比例施加到土壤中。

本发明生物炭-XB菌复合材料的使用可使污染土壤中DBP和DEHP的去除率分别高达94.3％和83.7％，显著高于单独使用嗜吡啶红球菌XB菌的效果，且能显著降低菜心植株中的DBP和DEHP含量，能高效去除土壤和蔬菜中的PAEs，从而保证蔬菜等农产品的质量安全。

基于上述生物炭-XB菌复合材料，本发明还请求保护一种包含上述生物炭-XB菌复合材料的用于降低土壤PAEs污染的产品。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明的生物炭-XB菌复合材料能使接种到生物炭中的嗜吡啶红球菌XB菌在土壤中保持相对的稳定，避免了与其他土壤微生物的竞争，提高了嗜吡啶红球菌XB菌活性及其氧化能力，土壤中的脱氢酶活性和二乙酸荧光素水解活性显著提高，从而能更有效地降解土壤中的PAEs，减少农作物从土壤中吸收累积PAEs。

(2)在土壤中的DBP和DEHP浓度高达100mg/kg条件下，通过向土壤中添加本发明的复合材料，土壤中DBP和DEHP的去除率能高达94.3％和83.7％，显著高于单独使用XB菌处理组。

(1)本发明的具有降解PAEs的复合材料适用范围广，在高、中、低浓度PAEs污染土壤的环境中均可实现有效降低土壤中的PAEs，从而减少了农作物对PAEs的吸收累积。

附图说明

图1为不同处理组土壤中DBP和DEHP的残留浓度；

图2为不同处理组土壤中脱氢酶和荧光素二乙酸酯水解酶活性；

图3为不同处理组菜心地上部DBP和DEHP的含量；

图4为不同处理组土壤中DBP和DEHP的去除率。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1一种生物炭-XB菌复合材料

(1)嗜吡啶红球菌XB菌液的制备

从冰箱拿出装有嗜吡啶红球菌XB菌的甘油管，待温度上升至室温后，转移至超净工作台。在酒精灯旁用灼烧冷却后的接种环蘸取少量菌液在LB固体培养基平板中划线，后倒置存放于30℃的恒温箱培养24h；LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸馏水1L，琼脂：18g，经高压蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌21min，注意培养基的pH为7.2；将培养出菌体后的固体培养基转移至超净工作台，在酒精灯附近用灼烧冷却后的接种环挑取活化后的嗜吡啶红球菌XB菌至LB液体培养基中，封上封口膜，在150r/min的摇床里，30℃培养12h；LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、蒸馏水1L，pH 7.2，经高压蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌21min；将上述菌悬液在4℃，4500r/min离心5min后，弃去上清液，用0.9％的灭菌生理盐水冲洗菌体，重复三次并重悬制成菌悬液浓度为8.0×108cfu/mL的备用菌液。

(2)稻草生物炭的制备

以稻草为原材料制备生物炭，将稻草切成块，然后用去离子水清洗去除表面的粘合剂，其次是在烘箱中以80℃干燥；将干稻草置于瓷坩埚中并盖上密封盖，在马弗炉中以600℃热解4h制得生物炭，热解过程中保持负压和缺氧环境；生物炭冷却至室温后，用0.1MHCl洗涤脱矿，再用去离子水洗涤，彻底去除残留的酸；得到的生物炭在80℃下烘干，轻轻研磨并过100目筛。

(3)生物炭-XB菌复合材料的制备

将生物炭先在121℃下灭菌30min，然后在烘箱中以80℃干燥，取100ml上述菌悬液与50g冷却至室温的生物炭充分混匀，将接种了XB菌的生物炭于35℃的烘箱中干燥，制得生物炭-XB菌复合材料。

实施例2菜心盆栽试验

1、栽培方法

(1)将水稻土风干、粉碎、混匀；将DBP和DEHP溶于丙酮中，然后加入到上述土壤中并搅拌混匀，将污染土在避光条件下老化两周，制得污染土壤。土壤浓度设置了3组处理，分别为高DBP和DEHP浓度，各100mg/kg、低DBP和DEHP浓度，各20mg/kg，以及未添加DBP和DEHP组，每组处理设置了3个重复。

(2)将DBP和DEHP污染土壤放入盆中，下端出水孔用托盘堵住，每盆用土2.5kg，老化两周后，高浓度处理组中DBP和DEHP的浓度分别为74.3mg/kg和82.6mg/kg，低浓度处理组中DBP和DEHP的浓度分别为13.4mg/kg和16.3mg/kg。

(3)用自来水浇至土壤湿润，待土壤干燥后将其倒出破碎并分别加入50g生物炭-XB菌复合材料、100mL菌液或50g生物炭混匀后再装盆，对照组不添加任何组分直接装盆。

(4)采用河砂为育苗基质，将基质与少量非污染土混匀后放入育苗板，铺平，然后将消毒后的菜心种子均匀播入河砂中，再用少量基质覆盖，用自来水浇淋，育苗过程中每天早晚浇水一次。

(5)待幼苗长至3～4片真叶时，将幼苗移植至步骤(3)的盆中，每株菜心间的株距保持在5～8cm，菜心种植的全过程不使用农药。

(6)菜心长至50天时，收割菜心地上植株部分，同时采集土壤样品。

2、指标测定

(1)DBP和DEHP的残留浓度测定方法

将蔬菜和土壤样品经冷冻干燥、粉碎过60目钢筛后，称取土壤(低浓度处理组：5.0g，高浓度处理组：2.0g)、蔬菜(2.0g)至聚四氟乙烯管中，加入20mL二氯甲烷:正己烷(1:1v/v)进行超声萃取20min，然后置于离心机以3500rpm离心10min，重复3次。将提取液收集混合后过氧化铝-中性硅胶-无水硫酸钠玻璃柱净化，然后用30mL甲醇:二氯甲烷(3:7)洗脱，收集液用旋转蒸发仪浓缩至<1mL，加入内部标准品(苯甲酸苄酯)，用正己烷稀释至1.0mL后进行GC/MS分析。

(2)土壤酶活性的测定方法

土壤脱氢酶活性的测定：称取5g新鲜土壤至聚乙烯离心管中，加入5mL氯化三苯基四氮唑溶液(0.5％)，然后置于恒温培养箱中以30℃培养6h，加入5mL甲醇后再放入摇床中300rpm震荡1h，震荡结束后置于离心机以4000r/min离心5min，收集上清液用分光光度计以485nm波长进行比色测定。

荧光素二乙酸酯水解酶的测定：称取5g新鲜土壤样品至50mL锥形瓶中，加入15mLpH值为7.6的磷酸盐缓冲液和0.2mL荧光素二乙酸酯溶液(荧光素二乙酸酯0.05g+丙酮25mL)，然后置于摇床中以200r/min，30℃培养20min,培养结束后加入15mL二氯甲烷：甲醇溶液(2:1)，然后转移样品于50mL离心管中置于离心机进行离心分离，收集上清液在分光光度计上以490nm波长测定荧光素吸光度值。

(3)土壤中DBP和DEHP去除率的计算

去除率＝(C0-C1)/C0

C0:老化后土壤中DBP或DEHP的原始浓度

C1:添加不同材料处理后土壤中DBP或DEHP浓度

3、结果分析

(1)土壤中DBP和DEHP的残留浓度如图1所示，由图1可以看出，添加生物炭-XB菌复合材料后，土壤中DBP和DEHP的残留浓度显著降低了，而且效果显著优于单独添加嗜吡啶红球菌XB菌的处理，表明使用生物炭-XB菌复合材料大大提高了降解土壤PAEs的效果。

(2)土壤中的脱氢酶和荧光素二乙酸酯水解酶活性如图2所示，由图2可以看出，添加生物炭-XB菌复合材料后，土壤中的脱氢酶活性和二乙酸荧光素水解活性显著提高，且显著高于单独使用XB菌处理组，表明使用生物炭-XB菌复合材料显著提高了微生物活性及其氧化能力，从而提高了降解PAEs的效果。

(3)菜心地上部DBP和DEHP的含量如图3所示，由图3可以看出，添加生物炭-XB菌复合材料后，菜心中的DBP和DEHP的含量显著降低了，而且效果优于单独添加生物炭、XB菌处理组，表明使用生物炭-XB菌复合材料显著降低了菜心对DBP和DEHP(平均降低DBP：37.6％，DEHP：36.2％)的吸收，更好地保障了蔬菜的质量安全。

(4)土壤中DBP和DEHP的去除率如图4所示，由图4可以看出，添加生物炭-XB菌复合材料后，土壤中DBP和DEHP的去除率高达94.3％和83.7％，且显著高于单独使用XB菌处理组(对DBP和DEHP的去除率分别提高了19.2％和16.7％)，表明生物炭-XB菌复合材料是一种具有高效降解PAEs功能的材料。

以上所述实施例仅表达了本发明的部分实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种生物炭-嗜吡啶红球菌XB菌复合材料，其特征在于，所述复合材料的制备包括以下步骤：

S1.将嗜吡啶红球菌XB菌接种至LB固体培养基上，在恒温箱里28～37℃培养12～24h得到活化的嗜吡啶红球菌XB菌；挑取活化的嗜吡啶红球菌XB菌至LB液体培养基中，震荡培养得到嗜吡啶红球菌XB菌悬液；将菌悬液在3-5℃，4500～5000r/min离心5～10min后，用0.9～1.2％的灭菌生理盐水冲洗菌体，重悬制成菌悬液的浓度为7.5～8.0×10⁸cfu/mL的备用菌液；

S2.将稻草清洗、切段、烘干，在马弗炉中以600～800℃热解4～6h制得生物炭；生物炭冷却至室温后，用酸洗涤脱矿，再用去离子水洗涤去除残留的酸；得到的生物炭烘干、研磨过筛，再将过筛的生物炭粉末于121～130℃下灭菌20～30min，冷却至室温备用；

S3.取步骤S1的备用菌液与步骤S2冷却至室温的生物炭粉末按照100～150mL：50～60g的比例混合均匀，再于30～35℃下干燥，即制得所述降解PAEs的复合材料。

2.根据权利要求1所述复合材料，其特征在于，所述PAEs为邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和/或邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)。

3.根据权利要求1所述复合材料，其特征在于，步骤S1所述震荡培养的震荡速度为120～150r/min，培养为在30～35℃培养10～12h。

4.根据权利要求1所述复合材料，其特征在于，步骤S1所述冲洗菌体为重复3～5次冲洗菌体。

5.根据权利要求1所述复合材料，其特征在于，步骤S2所述用酸洗涤脱矿为用0.1～0.2M HCl洗涤。

6.根据权利要求1所述复合材料，其特征在于，步骤S2所述烘干为在70～80℃下烘干。

7.根据权利要求1所述复合材料，其特征在于，步骤S2所述研磨过筛为过80～100目筛。

8.权利要求1～7任一所述复合材料在降低土壤PAEs污染方面的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，是将所述复合材料按照土壤量1～5％(w/w)的比例添加到土壤中。

10.一种降低土壤PAEs污染的产品，其特征在于，包含权利要求1～7任一所述复合材料。

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