CN117384785B - 一株耐受土壤重金属污染的氧化硫副球菌及其在促进植物生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，公开了一株耐受土壤重金属污染的氧化硫副球菌及其在促进植物生长中的应用。该氧化硫副球菌命名为xhzg01，已在2023年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27722，微生物分类命名为Paracoccus sulfuroxidans。本发明提供的氧化硫副球菌xhzg01对重金属镉、铬和铅均具有较高的耐受性，能够钝化土壤中的重金属，有效减少重金属胁迫下植物对重金属的吸收和积累，促进植物生长。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株耐受土壤重金属污染的氧化硫副球菌及其在促进植物生长中的应用。
背景技术
近年来，随着农业和工业生产规模的扩大，由于农药的长期积累以及工业废水的不达标排放等原因，重金属沉积滞留在土壤中，难以被自然降解，导致土壤重金属污染日益严重。土壤中的重金属会对植物产生毒害作用，抑制植物的生长，造成农作物减产甚至绝收；此外，当土壤中的重金属被植物吸收后，植物难以代谢这些重金属，会造成重金属随着生物链传递、富集和扩大，危害动物及人体健康。因此，对重金属污染土壤修复技术的研究具有重要意义。
一些微生物能够利用其代谢活动降低土壤中重金属的毒性，其作用方式主要包括以下几种：一是通过吸附作用，利用微生物自身的细胞结构如细胞壁吸附和固定重金属离子；二是通过生物溶剂作用，利用微生物与重金属发生化学反应，将重金属转化成无毒或毒性较低的物质；三是利用微生物吸收和代谢重金属，在代谢过程中降低重金属的毒性。
目前已报道过的土壤重金属污染修复菌主要见于芽孢杆菌属、假单胞菌属、微球菌属、微球菌属等，尚未报道过氧化硫副球菌(Paracoccus sulfuroxidans)这一种内存在能够钝化土壤重金属，并促进植物在重金属胁迫下生长的菌株。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一株耐受土壤重金属污染的氧化硫副球菌及其在促进植物生长中的应用。该氧化硫副球菌菌株对重金属镉、铬和铅具有较好的耐受性，当接种到重金属污染土壤中时，能够有效钝化重金属，并减少植物对重金属的吸收和积累，促进植物生长。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了一株耐受土壤重金属污染的氧化硫副球菌，所述氧化硫副球菌命名为xhzg01，已在2023年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27722，微生物分类命名为Paracoccus sulfuroxidans。
本发明的氧化硫副球菌xhzg01分离自污水处理厂的活性污泥。本发明团队发现该菌株对重金属镉、铬和铅均具有较高的耐受性——经试验，该菌株对Cd(II)、Cr(VI)、Pb(II)的最高耐受浓度可达10mmol/L、15mmol/L、25mmol/L。并且，当将该菌株接种到重金属污染的土壤中时，其能够钝化土壤中的重金属，有效减少重金属胁迫下植物对重金属的吸收和积累，促进植物生长。
第二方面，本发明提供了一种可促进植物生长的微生物制剂，所述微生物制剂含有所述氧化硫副球菌。
作为优选，所述微生物制剂还含有壳寡糖、鱼蛋白和槐糖脂。
当将氧化硫副球菌xhzg01与壳寡糖、鱼蛋白和槐糖脂复配使用时，各组分之间能够较好地配合，产生协同效果，在更大程度上减少重金属胁迫下植物对重金属的吸收和积累，促进植物生长。
作为优选，所述壳寡糖的制备方法包括以下步骤：
(1)采用陶厄氏菌进行发酵，去除菌体，获得发酵液；所述陶厄氏菌命名为xhzg02，已在2023年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27723，微生物分类命名为Thauera humireducens；
(2)将壳聚糖分散到分散介质中后，进行等离子体辐射，获得初步降解壳聚糖溶液；
(3)将发酵液加入到初步降解壳聚糖溶液中，进行酶解，获得壳寡糖。
壳聚糖酶是一种能够将壳聚糖降解成壳寡糖的专一性酶，相较于化学和物理降解法制备壳寡糖而言，壳聚糖酶酶解法具有反应条件温和、副产物少、环境污染小等优点。但目前，已报道过的壳聚糖酶降解壳聚糖产生的壳寡糖聚合度大多低于5，鲜有降解产物聚合度在5～10之间的壳聚糖酶。而有研究(张小倩.基于多组学研究单一聚合度壳寡糖对小麦的代谢调控机制[D].中国科学院大学(中国科学院海洋研究所),2018.)对小麦幼苗喷施不同聚合度的壳寡糖，发现聚合度大于3是壳寡糖发挥促生长活性的必要条件，且聚合度为5～10的壳寡糖促进小麦幼苗生长以及增强其叶片光合作用的效果优于其他聚合度的壳寡糖。
Thauera humireducens是陶厄氏菌属中的一个种(目前暂无统一的中文译名)。本发明首次在该种内发现了一个能够产生壳聚糖酶的菌株xhzg02(分离自土壤)，利用其发酵液，不仅能够有效降解壳聚糖，且获得的壳寡糖聚合度为5～8。当将这种壳寡糖用于本专利的微生物制剂中时，相较于其他聚合度的壳寡糖而言，能够在更大程度上促进重金属胁迫下小麦幼苗的生长。
此外，利用等离子体产生的高能活性粒子初步降解壳聚糖，能够提高壳聚糖的溶解性，降低壳聚糖溶液粘度，有利于后续酶解过程中壳聚糖与壳聚糖酶相互接触，提高酶解效率。配合等离子体辐射处理，陶厄氏菌xhzg02的发酵液无需分离纯化出壳聚糖酶，直接用于酶解即可实现较好的壳聚糖降解效果，获得聚合度为5～8的壳寡糖。
作为优选，步骤(1)的具体过程包括以下步骤：将所述陶厄氏菌活化后，按照3～4％的接种量接种到发酵培养基中，在30～33℃下发酵2～3d，期间分批补充发酵培养基；发酵完成后，去除菌体，获得发酵液；所述发酵培养基的pH为6.8～7.5，包括以下浓度的组分：壳聚糖3～5g/L，蛋白胨8～12g/L，酵母提取物4～6g/L，氯化钠8～12g/L。
进一步地，所述分批补充发酵培养基的方法如下：在发酵开始后20～25h，补充一次发酵培养基，而后每隔7～12h补充一次发酵培养基，每次补充的发酵培养基体积为初始发酵培养基体积的20～30％。
作为优选，步骤(2)中，所述分散介质是浓度为0.5～1.0wt％的乙酸水溶液，所述壳聚糖与分散介质的质量体积比为9～15g：100mL。
作为优选，步骤(2)中，所述等离子体辐射的过程中，功率为100～120W，照射距离为2～4mm，等离子体温度为20～30℃，时间为30～40min。
作为优选，步骤(3)中，所述发酵液与初步降解壳聚糖溶液的体积比为3～6：10。
作为优选，步骤(3)中，在酶解前，调节pH至5.0～6.0；所述酶解的温度为45～50℃，时间为0.5～1h。
作为优选，所述微生物制剂中，所述氧化硫副球菌的含量为3.2×1010～1.6×1011CFU/g。
作为优选，所述微生物制剂中，壳寡糖、鱼蛋白和槐糖脂的含量分别为45～55wt％、15～25wt％和8～13wt％。
第三方面，本发明提供了所述氧化硫副球菌或所述微生物制剂在促进植物生长中的应用。
第四方面，本发明提供了所述氧化硫副球菌或所述微生物制剂在促进重金属胁迫下植物生长中的应用。
作为优选，所述重金属为镉、铬和铅中的一种或多种。
作为优选，在所述应用中，将所述氧化硫副球菌或所述微生物制剂与单质硫配合施用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的氧化硫副球菌xhzg01对重金属镉、铬和铅均具有较高的耐受性，能够钝化土壤中的重金属，有效减少重金属胁迫下植物对重金属的吸收和积累，促进植物生长；而目前尚未报道过该菌株所属的种(氧化硫副球菌Paracoccus sulfuroxidans)内存在能够钝化土壤重金属、促进重金属胁迫下植物生长的菌株。
(2)本发明将氧化硫副球菌xhzg01、壳寡糖、鱼蛋白和槐糖脂复配构成微生物制剂，当施用于重金属污染土壤中时，能够在更大程度上减少植物对重金属的吸收和积累，促进植物生长。
(3)本发明采用陶厄氏菌xhzg02的发酵液酶解制备壳寡糖，获得的壳寡糖聚合度为5～8，相较于其他聚合度的壳寡糖而言，能够在更大程度上促进重金属胁迫下小麦幼苗的生长；而目前尚未报道过该菌株所属的种(Thauera humireducens)内存在能够产生壳聚糖酶的菌株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一株耐受土壤重金属污染的氧化硫副球菌，所述氧化硫副球菌命名为xhzg01，已在2023年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27722，微生物分类命名为Paracoccus sulfuroxidans。
一种可促进植物生长的微生物制剂，含有上述氧化硫副球菌。
作为一种具体实施方式，所述微生物制剂还含有壳寡糖、鱼蛋白和槐糖脂。
作为一种具体实施方式，所述壳寡糖的制备方法包括以下步骤：
(1)采用陶厄氏菌进行发酵，去除菌体，获得发酵液；所述陶厄氏菌命名为xhzg02，已在2023年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27723，微生物分类命名为Thauera humireducens；
(2)将壳聚糖分散到分散介质中后，进行等离子体辐射，获得初步降解壳聚糖溶液；
(3)将发酵液加入到初步降解壳聚糖溶液中，进行酶解，获得壳寡糖。
作为一种具体实施方式，步骤(1)的具体过程包括以下步骤：将所述陶厄氏菌活化后，按照3～4％的接种量接种到发酵培养基中，在30～33℃下发酵2～3d，期间分批补充发酵培养基；发酵完成后，去除菌体，获得发酵液。所述发酵培养基的pH为6.8～7.5，包括以下浓度的组分：壳聚糖3～5g/L，蛋白胨8～12g/L，酵母提取物4～6g/L，氯化钠8～12g/L。所述分批补充发酵培养基的方法如下：在发酵开始后20～25h，补充一次发酵培养基，而后每隔7～12h补充一次发酵培养基，每次补充的发酵培养基体积为初始发酵培养基体积的20～30％。
作为一种具体实施方式，步骤(2)中，所述分散介质是浓度为0.5～1.0wt％的乙酸水溶液，所述壳聚糖与分散介质的质量体积比为9～15g：100mL。
作为一种具体实施方式，步骤(2)中，所述等离子体辐射的过程中，功率为100～120W，照射距离为2～4mm，等离子体温度为20～30℃，时间为30～40min。
作为一种具体实施方式，步骤(3)中，所述发酵液与初步降解壳聚糖溶液的体积比为3～6：10。
作为一种具体实施方式，步骤(3)中，在酶解前，调节pH至5.0～6.0；所述酶解的温度为45～50℃，时间为0.5～1h。
作为一种具体实施方式，所述微生物制剂中，所述氧化硫副球菌的含量为3.2×1010～1.6×1011CFU/g。
作为一种具体实施方式，所述微生物制剂中，壳寡糖、鱼蛋白和槐糖脂的含量分别为45～55wt％、15～25wt％和8～13wt％。
上述氧化硫副球菌或上述微生物制剂在促进植物生长中的应用。
上述氧化硫副球菌或上述微生物制剂在促进重金属胁迫下植物生长中的应用。
作为一种具体实施方式，所述重金属为镉、铬和铅中的一种或多种。
作为一种具体实施方式，在所述应用中，将所述氧化硫副球菌或所述微生物制剂与单质硫配合施用。
以下实施例目的在于进一步介绍和展示本发明的目的、技术方案和技术效果。因此，实施例应理解为仅用于更详细地展示本发明，而不以任何方式限制本发明的内容。
实施例中所用的原料、设备如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，所用的方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法。以下实施例中所述的菌株xhzg01、氧化硫副球菌xhzg01均指已在2023年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27722，微生物分类命名为Paracoccus sulfuroxidans。以下实施例中所述的陶厄氏菌xhzg02均指已在2023年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27723，微生物分类命名为Thauera humireducens的菌株。
实施例1：氧化硫副球菌xhzg01对重金属的耐受性
按照以下配方，配制液体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，(NH4)2SO4 1.5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.1g，硫粉1g，蒸馏水1L；pH＝7.0；121℃灭菌20min。固体培养基是在液体培养基的基础上加入琼脂20g。
在上述固体培养基配方基础上分别添加CdCl2·2.5H2O、K2CrO7、Pb(NO3)2，配制成分别含有不同浓度的Cd(II)(5、10、15、20、25、30mmol/L)、Cr(VI)(5、10、15、20、25、30mmol/L)、Pb(II)(5、10、15、20、25、30mmol/L)的重金属固体培养基。
用接种环挑取氧化硫副球菌xhzg01的单菌落，接种到液体培养基中，30℃、130r/min摇床培养至对数生长期，而后涂布于重金属固体培养基上，在30℃下倒置培养3d，观察培养基上菌落生长情况，根据培养基上是否有菌落生长来反映菌株xhzg01对重金属的耐受能力。结果显示，菌株xhzg01能够耐受的最高Cd(II)、Cr(VI)、Pb(II)浓度为10mmol/L、15mmol/L、25mmol/L。
实施例2：制备氧化硫副球菌xhzg01冻干菌粉
将100g脱脂乳粉、20g海藻糖、20g甘油、5g谷氨酸钠溶解于1L水中，121℃灭菌30min，制成冻干保护剂。用接种环挑取氧化硫副球菌xhzg01的单菌落，接种到液体培养基(按照实施例1中的方法配制)中，30℃、130r/min摇床培养至对数生长期，6000rpm离心10min，弃上清液，将收集到的菌泥用0.9％生理盐水清洗一次，向清洗后的菌泥中加入生理盐水重悬，制成菌悬液。将菌悬液与冻干保护剂等体积混合，在-20℃下预冷12h后，真空冷冻干燥，制得氧化硫副球菌xhzg01冻干菌粉。经测，获得的冻干菌粉中活菌数为1.6×1011CFU/g。
实施例3：制备壳寡糖
按照以下步骤，制备壳寡糖：
(1)制备发酵液：
按照以下配方，配制活化培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；pH＝7.0；121℃灭菌20min。
按照以下配方，配制发酵培养基：壳聚糖4g/L，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；pH＝7.0；121℃灭菌20min。
用接种环挑取陶厄氏菌xhzg02单菌落，接种到活化培养基中，30℃、150r/min摇床培养至对数生长期，获得种子液。而后按照3％的接种量，将种子液接种到1L发酵培养基中，在30℃下发酵24h后，补加300mL发酵培养基，此后每隔12h补加200mL发酵培养基，共发酵72h，而后离心取上清液以去除菌体，即获得发酵液。
(2)初步降解：
将100g壳聚糖(粘均分子量Mv＝834kDa)加入到1L 1.0wt％乙酸水溶液中，搅拌均匀后，进行等离子体辐射30min，工作气体为氦气，功率为120W，照射距离为2mm，等离子体温度为25℃，获得初步降解壳聚糖溶液。
(3)酶解：
取500mL发酵液加入到1L初步降解壳聚糖溶液中，调节pH至5.5，在45℃下搅拌酶解30min后，煮沸10min以灭酶，离心，取上清液，减压旋蒸去除溶剂，获得壳寡糖。取样，经薄层色谱法检测，产物壳寡糖由聚合度为5～8的壳寡糖组成。
实施例4：氧化硫副球菌xhzg01对土壤重金属的钝化效果
将实施例2中制得的冻干菌粉与蒸馏水按照1g:100mL的配比混合，制得菌株xhzg01菌液。取pH为6.85的未受重金属污染的正常土质土壤，加入CdCl2·2.5H2O、K2CrO7、Pb(NO3)2，制成含Cd2+25.3mg/kg、Cr6+37.6mg/kg、Pb2+130.8mg/kg的重金属污染土壤。将菌株xhzg01菌液和单质硫均匀施加到重金属污染土壤中，施加量为每千克土壤100mL菌液和15mg硫粉。维持土壤含水量为65％，在10d后，检测土壤中的有效重金属含量，重复3次取平均值，测得有效镉、有效铬、有效铅含量分别为10.45mg/kg、11.51mg/kg、48.77mg/kg，表明氧化硫副球菌xhzg01能够有效钝化土壤中的镉、铬和铅。
实施例5：微生物制剂对重金属胁迫下小麦幼苗生长的作用效果选取籽粒饱满、大小一致的小麦种子，用0.1％氯化汞进行表面消毒后，用流水冲洗干净，而后浸入水中，置于黑暗处吸水6h后取出，均匀摆放到铺有湿润滤纸的培养皿中，在25℃培养箱内黑暗催芽24h。挑选发芽状态一致的种子，按照每盆10粒、每组3盆，分别种植到各组土壤中，置于光照培养箱内进行培养，光照培养箱的参数设置如下：光周期14h/10h(光照/黑暗)，光照强度600μmol/(m2·s)，温度25℃/22℃(昼/夜)，相对湿度70％。各组具体设置如下：
CK组：采用未受重金属污染的正常土质土壤，在种植萌发的小麦种子15d前，向土壤中施加蒸馏水，施加量为每千克土壤100mL蒸馏水；
T1组：采用重金属污染土壤(按照实施例4中的方法制得)，在种植萌发的小麦种子15d前，向土壤中施加蒸馏水，施加量为每千克土壤100mL蒸馏水；
T2组：采用与T1组相同的重金属污染土壤，在种植萌发的小麦种子15d前，向土壤中施加菌株xhzg01菌液(通过将实施例2中制得的冻干菌粉与蒸馏水按照1g:100mL的配比混合制得)和硫粉，施加量为每千克土壤100mL菌液和15mg硫粉；
T3组：采用与T1组相同的重金属污染土壤，在种植萌发的小麦种子15d前，向土壤中施加微生物制剂溶液(通过将实施例2中制得的冻干菌粉、实施例3中制得的壳寡糖、鱼蛋白和槐糖脂按照1:2.5:1:0.5的质量比混合制成微生物制剂，再将微生物制剂与蒸馏水按照1g:100mL的配比混合制得)和硫粉，施加量为每千克土壤100mL微生物制剂溶液和15mg硫粉；
T4组：采用与T1组相同的重金属污染土壤，在种植萌发的小麦种子15d前，向土壤中施加促生长剂溶液(通过将实施例3中制得的壳寡糖、鱼蛋白和槐糖脂按照2.5:1:0.5的质量比混合制成促生长剂，再将促生长剂与蒸馏水按照1g:100mL的配比混合制得)和硫粉，施加量为每千克土壤100mL促生长剂溶液和15mg硫粉；
T5组：采用与T1组相同的重金属污染土壤，在种植萌发的小麦种子15d前，向土壤中施加微生物制剂溶液(通过将实施例2中制得的冻干菌粉、壳三糖、鱼蛋白和槐糖脂按照1:2.5:1:0.5的质量比混合制成微生物制剂，再将微生物制剂与蒸馏水按照1g:100mL的配比混合制得)和硫粉，施加量为每千克土壤100mL微生物制剂溶液和15mg硫粉；
T6组：采用与T1组相同的重金属污染土壤，在种植萌发的小麦种子15d前，向土壤中施加微生物制剂溶液(通过将实施例2中制得的冻干菌粉、壳十一糖、鱼蛋白和槐糖脂按照1:2.5:1:0.5的质量比混合制成微生物制剂，再将微生物制剂与蒸馏水按照1g:100mL的配比混合制得)和硫粉，施加量为每千克土壤100mL微生物制剂溶液和15mg硫粉。
在土壤中培养4周后，检测每组的株高、根长、地上部和地下部干重、地上部和地下部重金属积累量，检测结果见表1和表2。
表1小麦幼苗生长情况(n＝10)
表2小麦幼苗重金属积累和分布情况(n＝10)
从表1和表2可以看出：
(1)相较于T1组而言，T2～T4组的小麦幼苗生长速度提高，重金属的积累量减小，其中，T2组的效果优于T3和T4组。说明氧化硫副球菌xhzg01能够减小土壤中重金属Cd、Cr、Pb对小麦的毒害，有效促进小麦幼苗的生长，减少其对重金属的吸收和积累，并且，将氧化硫副球菌xhzg01与壳寡糖、鱼蛋白和槐糖脂复配，能够进一步提高作用效果。
(2)相较于T2组而言，T5和T6组的小麦幼苗生长速度明显较慢。说明相较于壳三糖和壳十一糖而言，采用本发明中的方法制得的壳寡糖，能够在更大程度上促进重金属胁迫下的小麦幼苗生长。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一株耐受土壤重金属污染的氧化硫副球菌，其特征在于，所述氧化硫副球菌命名为xhzg01，已在2023年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27722，微生物分类命名为Paracoccus sulfuroxidans。
2.一种可促进植物生长的微生物制剂，其特征在于，含有如权利要求1所述氧化硫副球菌。
3.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，还含有壳寡糖、鱼蛋白和槐糖脂。
4.如权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述壳寡糖的制备方法包括以下步骤：
（1）采用陶厄氏菌进行发酵，去除菌体，获得发酵液；所述陶厄氏菌命名为xhzg02，已在2023年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.27723，微生物分类命名为Thauera humireducens；
（2）将壳聚糖分散到分散介质中后，进行等离子体辐射，获得初步降解壳聚糖溶液；
（3）将发酵液加入到初步降解壳聚糖溶液中，进行酶解，获得壳寡糖。
5.如权利要求2或3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中，所述氧化硫副球菌的含量为3.2×1010~1.6×1011CFU/g。
6.如权利要求3或4所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中，壳寡糖、鱼蛋白和槐糖脂的含量分别为45~55wt%、15~25wt%和8~13wt%。
7.如权利要求1所述氧化硫副球菌或如权利要求2~6之一所述微生物制剂在促进植物生长中的应用。
8.如权利要求1所述氧化硫副球菌或如权利要求2~6之一所述微生物制剂在促进重金属胁迫下植物生长中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重金属为镉、铬和铅中的一种或多种。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，在所述应用中，将所述氧化硫副球菌或所述微生物制剂与单质硫配合施用。
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| 暗黑鳃金龟幼虫肠道微生物分子多态性及纤维素降解菌多样性研究;黄胜威;中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑;20121115(第11期);D046-42 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117384785A (zh) | 2024-01-12 |
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