CN116371905A - 一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法,包括以下步骤:S1、土著微生物菌群富集、驯化;S2、菌悬液的制备;S3、固体菌剂的制备;S4、PAEs的去除;S5、降解特性验证;本发明以具有PAEs高效降解能力的功能土著菌群为对象,选取400~600℃热解条件下制备的雪松生物炭为固定化载体,采用吸附法,制备具有PAEs降解能力的功能土著菌群固体菌剂,对环境中PAEs具有较高的去除率。本产品安全有效,对环境友好,处理成本较低,适合大量推广。
Description
技术领域
本发明涉及环境污染物生物处理技术领域,具体是涉及种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法。
背景技术
邻苯二甲酸酯是一类由邻苯二甲酸和含有不同烷基侧链的醇通过酯化反应生成的内分泌干扰物质。PAEs不易溶于水,但易溶于甲醇、乙醇、正己烷、石油醚等有机试剂。随着PAEs酯基侧链增长,Kow增大,疏水性增强,PAEs理化性质决定了其在环境中的迁移和归趋。PAEs能够增强刚性聚合物柔韧性和弹性且能提高塑料产品的延伸性和耐久性,其作为增塑剂广泛应用于工农业生产以及日常用品中。
目前,全球PAEs消耗量巨大,且在环境中广泛存在。据报道,全球固体塑料年产量约为3亿吨,PAEs年消耗量约为600~800万吨。其中,中国作为最大的塑料生产及消费国之一,2019年塑料制品产量高达8200万吨左右。PAEs通过氢键、范德华力等非共价形式与聚合物结合,与化学结合相比,这种键合方式稳定性差,使PAEs极易在产品制造、储存过程中迁移释放到环境中。大量研究表明,PAEs在大气、水体、土壤、底泥等环境介质中广泛存在,甚至在动植物体及人体中也检测到一定量PAEs。PAEs作为一类内分泌干扰物质,即使在极低浓度下也存在致癌、致畸、致突变风险,进而对人体健康和生态系统造成严重威胁。
PAEs污染微生物修复技术的核心是PAEs高效降解菌的降解效能,但能否高效开发功能菌的降解潜能仍是研究重点。微生物投入环境后,其对生存环境较为敏感,并且会与环境中土著微生物产生竞争,因此考虑通过投加固定化微生物菌剂来解决此类问题。固定化菌剂以固定化载体作为保护剂,可以将微生物或微生物含有的特定降解酶限定于特定空间内。固定化载体可以富集高浓度生物量,同时还能为微生物提供碳源和营养物质,使微生物保持较高的活性,从而达到去除污染物和净化环境的目的。此外,固定化载体还能够进行回收和重复使用,从而节约了成本。目前,关于微生物固定化技术降解PAEs相关报道中,大多是以固定单一菌株为主,对于混合菌群固定化降解PAEs的研究还鲜有报道。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供了一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法。
本发明的技术方案是:一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法,包括以下步骤:
S1、土著微生物菌群富集、驯化
按照0.04~0.06g/mL的质量浓度向锥形瓶中加入的受PAEs污染的土壤样品与无菌水,随后将锥形瓶置于摇床中,在30~35℃的温度条件下,以150~200rpm的转速避光震荡培养6~8h取出,静置2h后,得到的上清液即为土著微生物菌液;其中,所述土著微生物菌液可在30~40℃的条件下生存;
按照体积比为4~6:94~96称取所述土著微生物菌液与含PAEs的无机盐培养基,然后将土著微生物菌液转接至含PAEs的无机盐培养基中,加入PAEs混标,使培养基中PAEs浓度达到设定值,然后在30℃的温度条件下,以150rpm的转速在摇床上震荡培养5~7d,相同条件下连续富集培养5代后,获得稳定的具有高效降解PAEs能力的功能土著微生物菌群L-3,采用甘油保藏法进行保藏;
S2、菌悬液的制备
将功能土著微生物菌群L-3接种于LB培养基中活化,所述活化方法为:在28~32℃的温度条件下,以150~200rpm的转速恒温震荡培养12~16h;再于4~6℃的温度条件下以5000~8000rpm的转速离心4~6min后收集菌体并弃去上清液,然后用无机盐培养基冲洗菌体后,再次离心并弃去上清液,清洗两次后将细菌的OD600值调整到1.0作为菌群悬液,在4℃的温度下暂存备用;
S3、固体菌剂的制备
用生物炭作为固定化载体;称取生物炭置于锥形瓶中灭菌后冷却至常温,将制备好的固定化载体按照固液比1:10g/mL的比例加入菌群悬液,并置于恒温震荡培养箱中,在30℃的条件下,以150~200rpm的转速培养24h后取出,随后在离心机中以8000rpm的速率离心处理5~10min后,得到上清液和下层固体,弃去上清液然后用灭过菌的无机盐培养基洗涤下层固体,再离心5~10min后弃上清液,重复此过程2~3次,置于灭过菌的烘箱中以25~30℃的温度烘干,最终所得固体即为功能土著微生物菌群固体菌剂;
S4、PAEs的去除
将步骤S3获得的固体菌剂按照5~6g/L的配比加入到污染体系中对PAEs进行去除。
进一步地,步骤S1中,受PAEs污染的土壤样品为长期受PAEs污染的土壤样品;
说明;实验结果表明,利用功能土著菌群固体菌剂对长期受PAEs污染的土壤样品具备较高的去除率。
进一步地,所述无机盐培养基由1.5g/L的(NH4)2SO4、0.5g/L的KH2PO4、1.91g/L的K2HPO4·3H2O、0.5g/L的NaCl以及0.2g/L的MgSO4·7H2O组成;pH为7.0;
所述LB培养基包括以下组分:5.0g的酵母提取物、10.0g的胰化蛋白胨以及10.0g的氯化钠;加入1L的纯超水并调节pH为7.0,在温度为121℃的条件下灭菌20~25min;
说明:上述配方制备得到的无机盐培养基与LB培养基能够对土著微生物菌群L-3、土著微生物菌液进行更优的处理同时有效降低了夹杂物的存在,使得固体菌剂的降解率更高。
进一步地,所述PAEs为邻苯二甲酸二甲酯和/或邻苯二甲酸二乙酯和/或邻苯二甲酸二丁酯和/或邻苯二甲酸丁基苄酯和/或邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯和/或邻苯二甲酸二正辛酯。
进一步地,步骤S3中,所述生物炭是采用园林废弃物雪松在400~600℃炭化条件下制备得到的;
说明:实施例数据证明,400~600℃烧制的生物炭自由基合格且产率较高,得到的固定化菌剂具备较优的降解效果。
进一步地,步骤S3中,所述固定化载体的制备方法为:
1)将园林废弃物雪松自然晒干,用水清洗2~3次,先在100~110℃烘箱中杀青25~35min,然后50~60℃的温度下烘烤24h,粉碎15~20min后过40目筛,得到粉碎后的雪松,备用;
2)取粉碎后的雪松置于坩埚中,压实并盖上坩埚盖,置于气氛炉中,密封并打开氮气阀门,往炉内通10~15min氮气;
3)以5~8℃/min的升温速率调节气氛炉内温度为250~300℃,然后再以10~15℃/min的升温速率调节气氛炉内温度为400~600℃,恒温炭化1.5~2.5h后以5~8℃/min的降温速率降至300~350℃,然后再以10~15℃/min的降温速率降至室温后将生物炭取出,即得到相应温度的炭化粗产物;
式中:为炭化前粉碎后的雪松的质量,单位为g;为炭化后粉碎后的雪松的质量,单位为g;为粉碎后的雪松中水分的质量,单位为g;
5)将步骤4)中获得的炭材料先用质量浓度为0.05~0.15%的HCl溶液进行清洗,接着用超纯水冲洗3~5次后烘干,即可获得固定化载体;
说明:雪松比表面积较高,选取园林废弃物雪松烧制成生物炭进行表征表征数据更优,生物炭可以给微生物提供栖息地和营养物质,改善微生物生存环境,提高功能菌活性,同时400~600℃烧制的生物炭自由基合格且产率较高,得到的固定化菌剂的降解率也较高;梯度升温的方式制备炭化粗产物能够使得粉碎后的雪松逐渐融化,生物炭能够分层机械混入雪松中,使得炉内粉碎后的雪松和生物炭之间的更均匀。同时梯度式升温可以保证坩埚内原材料能逐步升温融化,能够有效地避免一次升温时,因温度过高而导致的破坏;通过上述方法制备得到的固定化载体更加环保、低成本。
进一步地,步骤4)中,所述球磨工艺为:以4.0~5.0:1的球料质量比将氧化铝研磨球与冷却后的炭化粗产物加入球磨罐中,调节球磨机的转速为80~90r/min,研磨时间2.5~3h,得到生物炭材料,干燥备用;
说明:通过上述参数进行球磨处理能够获得纳米结构的生物炭从而提升生物炭与邻苯二甲酸酯类之间的孔隙作作用,能增大生物炭的内外表面积,以及增加了生物炭表面的含氧官能团,从而提升对于土壤中PAEs的吸附能力。
进一步地,在步骤1)之后且在步骤2)之前对所述粉碎后的雪松进行活化处理;所述活化步骤为:先用质量浓度为0.5~1.5%的壳聚糖与纳米SiO2按照体积比为1:0.2~0.3混合后得到的混合液对粉碎后的雪松进行3~5次喷雾处理;其中,喷枪压力为0.15~0.2MPa,喷射粒径为0.3~1mm;然后按照固液比为3~5g/mL将粉碎后的雪松置入到质量浓度为1.5~2.0mol/L的活化溶液中,并在超声条件下浸渍10~15min,过滤掉浸泡滤液后取出放入真空环境内,并利用氮气对粉碎后的雪松表面吹扫至干燥;超声波密度为35~45W/cm2;
所述活化溶液按照质量百分比计,由70~80%的Na2CO3、10~15%的FeCO3、2.5~4.5%的磷酸氢二铵以及余量的蒸馏水组成;
说明:先用上述浓度的壳聚糖与纳米SiO2的混合溶液对粉碎后的雪松喷雾处理能够在保鲜的同时有效促进雪松表皮细胞的活化,进一步提升后续与活化溶液反应时的活化效果;Na2CO3与磷酸氢二铵、FeCO3混合后的混合溶液能够进一步提升粉碎后的雪松的比表面积,同时碳酸钠溶于少量水放热使得磷酸氢二铵受热分解产生的磷酸和偏磷酸物质能够进一步促进雪松孔道结构发展,磷酸和偏磷酸转化为五氧化二磷,五氧化二磷与其他氧化物作用对雪松碳化过程催化促进,使雪松的碳化过程加深,生成的可燃气体减少,固相产物产率增加,并且磷酸氢二铵的少量加入能够对粉碎后的雪松表面进行清洗灭菌,利于后续的炭化过程,避免掺杂从而降低固定化载体的纯度。
进一步地,还包括步骤S5,
S5、降解特性验证:
将固体菌剂加入到污染体系中之后,取15~25mL含有固体菌剂的污染体系置于恒温培养箱中3~5天,检测污染体系中PAEs含量的变化;
说明:降解特性验证能够对制备得到的土著菌群固体菌剂的去除率进行验证。
进一步地,步骤S1中,所述甘油保藏法的操作步骤为:按体积比为1:1的比例将获得的功能土著微生物菌群L-3与体积浓度为30%的甘油混合,并置于-80℃的冰箱中保存备用;
说明:甘油保藏法操作简单、高效、保藏期一般可达15年以上,是目前公认的最有效的菌种长期保藏的技术之一;选用体积浓度为30%的甘油能够对功能土著微生物菌群L-3有效保存,避免功能土著微生物菌群L-3在冰冻过程中产生冰晶体从而降低细胞的存活率,从而降低后续对PAEs的降解效果。
本发明的有益效果是:
(1)本发明以具有PAEs高效降解能力的功能土著菌群为对象,选取400~600℃热解条件下制备的雪松生物炭为固定化载体,采用吸附法,制备具有PAEs降解能力的功能土著菌群固体菌剂,对环境中PAEs具有较高的去除率。本产品安全有效,对环境友好,处理成本较低,适合大量推广。
(2)本发明直接从长期受PAEs污染的土壤中富集土著微生物,在持续高浓度PAEs选择压力下进行驯化,对PAEs具有降解广谱性和高效性,且固定化后能长期保持活性。
(3)本发明对总PAEs降解率可以达到89%,其中低分子量PAEs的降解率可以达到95%以上。
附图说明
图1为功能土著菌群属水平相对丰度;
图2为功能土著菌群的生物扫描电镜图;
图3为本发明的固定化载体的扫描电镜图;
图4为本发明的功能土著菌群固体菌剂的扫描电镜图;
图5为本发明的功能土著菌群固体菌剂对PAEs的降解率柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式来对本发明进行更进一步详细的说明,以更好地体现本发明的优势。本发明的实施例中DMP是邻苯二甲酸酯的缩写、DEP是邻苯二甲酸二乙酯的缩写、DBP是邻苯二甲酸二丁酯的缩写,BBP是邻苯二甲酸丁基苄酯的缩写,DEHP是邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的缩写,DnOP是邻苯二甲酸二正辛酯的缩写。
实施例1
一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法,包括以下步骤:
S1、土著微生物菌群富集、驯化
按照0.05g/mL的质量浓度向锥形瓶中加入的受PAEs污染的土壤样品与无菌水,随后将锥形瓶置于摇床中,在32℃的温度条件下,以180rpm的转速避光震荡培养7h取出,静置2h后,得到的上清液即为土著微生物菌液;土著微生物菌液可在35℃的条件下生存;其中,受PAEs污染的土壤样品为受PAEs污染时间超过3年的土壤样品;
其中,PAEs为邻苯二甲酸二甲酯;
按照体积比为5:95称取土著微生物菌液与含PAEs(含5mg/L的DMP、5mg/L的DEP、5mg/L的DBP、5mg/L的BBP、5mg/L的DEHP、5mg/L的DnOP)的无机盐培养基,然后将土著微生物菌液转接至含PAEs的无机盐培养基中,加入PAEs混标,使培养基中PAEs浓度达到80mg/L(即含80mg/L的DMP、80mg/L的DEP、80mg/L的DBP、80mg/L的BBP、80mg/L的DEHP、80mg/L的DnOP),然后在30℃的温度条件下,以150rpm的转速在摇床上震荡培养6d,相同条件下连续富集培养5代后,获得稳定的具有高效降解PAEs能力的功能土著微生物菌群L-3,采用甘油保藏法进行保藏;其中,甘油保藏法的操作步骤为:按体积比为1:1的比例将获得的功能土著微生物菌群L-3与体积浓度为30%的甘油混合,并置于-80℃的冰箱中保存备用;提取功能土著微生物菌群总DNA,送交由北京擎科生物科技有限公司进行纯化测序,分析土著微生物菌群的细菌群落结构组成,结果如图1所示;
无机盐培养基由1.5g/L的(NH4)2SO4、0.5g/L的KH2PO4、1.91g/L的K2HPO4·3H2O、0.5g/L的NaCl以及0.2g/L的MgSO4·7H2O组成;pH为7.0;
S2、菌悬液的制备
将功能土著微生物菌群L-3接种于LB培养基中活化,活化方法为:在30℃的温度条件下,以180rpm的转速恒温震荡培养14h;再于5℃的温度条件下以6500rpm的转速离心5min后收集菌体并弃去上清液,然后用无机盐培养基冲洗菌体后,再次离心并弃去上清液,清洗两次后将菌体的OD600值调整到1.0作为菌群悬液,在4℃的温度下暂存备用;
LB培养基包括以下组分:5.0g的酵母提取物、10.0g的胰化蛋白胨以及10.0g的氯化钠;加入1L的纯超水并调节pH为7.0,在温度为121℃的条件下灭菌22min;
取1mL活化后的功能土著微生物菌群L-3,吸取1mL菌群悬液经8000rpm离心4min,去上清液,加入PBS洗菌3次,在收获的菌体沉淀中加入1mL 2.5%体积浓度的戊二醛充分混匀,4℃静置过夜;然后倒掉固定液,用0.1M,pH=7.0的PBS漂洗样品三次,漂洗时间15min/次;用质量浓度为1%的锇酸溶液固定样品1.5h;取出锇酸废液,用0.1M,pH=7.0的PBS继续漂洗样品三次,每次15min;用梯度浓度(包括30%,50%,70%,80%,90%和95%五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理,每种浓度处理15min,再用质量浓度为100%的乙醇处理两次,每次处理20min;然后用乙醇与醋酸异戊酯按照体积比为1:1混合后的混合液处理样品30min,再用纯醋酸异戊酯处理样品1h或放置过夜,并于临界点干燥;扫描电镜观察其形态,结果如图2所示;
S3、固体菌剂的制备
用生物炭作为固定化载体;其中,生物炭是采用园林废弃物雪松在500℃炭化条件下制备得到的;称取生物炭置于锥形瓶中灭菌后冷却至常温,将制备好的固定化载体按照固液比1:10g/mL的比例加入菌群悬液,并置于恒温震荡培养箱中,在30℃的条件下,以170rpm的转速培养24h后取出,随后在离心机中以8000rpm的速率离心处理7min后,得到上清液和下层固体,弃去上清液然后用灭过菌的无机盐培养基洗涤下层固体,再离心7min后弃上清液;重复此过程2次,置于灭过菌的烘箱中以28℃的温度烘干,最终所得固体即为功能土著微生物菌群固体菌剂;利用扫描电镜对获得的固体菌剂进行扫描,如图4所示;
步骤S3中,固定化载体的制备方法为:
1)将园林废弃物雪松自然晒干,用水清洗3次,先在105℃烘箱中杀青30min,然后在55℃的温度下烘烤24h,粉碎18min后过40目筛,得到粉碎后的雪松,备用;
对粉碎后的雪松进行活化处理;活化步骤为:先用质量浓度为1.0%的壳聚糖与纳米SiO2按照体积比为1:0.25混合后得到的混合液对粉碎后的雪松进行4次喷雾处理;其中,喷枪压力为0.18MPa,喷射粒径为0.6mm;按照固液比为4g/mL将粉碎后的雪松置入到质量浓度为1.8mol/L的活化溶液中,并在超声条件下浸渍1.8h,过滤掉浸泡滤液后取出并放入真空环境内,并利用氮气对粉碎后的雪松表面吹扫至干燥;超声波密度为40W/cm2;活化溶液按质量百分比计,由75%的Na2CO3、12%的FeCO3、3.5%的磷酸氢二铵以及余量的蒸馏水组成;
2)取粉碎后的雪松置于坩埚中,压实并盖上坩埚盖,置于气氛炉中,密封并打开氮气阀门,往炉内通13min氮气;
3)以6℃/min的升温速率调节气氛炉内温度为270℃,然后再以12℃/min的升温速率调节气氛炉内温度为500℃,恒温炭化2h后以6℃/min的降温速率降至320℃,然后再以12℃/min的降温速率降至室温后将生物炭取出,即得到相应温度的炭化粗产物;
式中:m雪松为炭化前粉碎后的雪松的质量,单位为g;m生物炭为炭化后粉碎后的雪松的质量,单位为g;m水为粉碎后的雪松中水分的质量,单位为g;
步骤4)中,球磨工艺为:以4.5:1的球料质量比将氧化铝研磨球与冷却后的炭化粗产物加入球磨罐中,调节球磨机的转速为85r/min,研磨时间2.8h,得到生物炭材料,干燥备用
5)将步骤4)中获得的炭材料先用质量浓度为0.1%的HCl溶液进行清洗,接着用超纯水冲洗4次后烘干,即可获得固定化载体;利用扫描电镜对获得的生物炭进行扫描,如图3所示;
S4、PAEs的去除
将步骤S3获得的固体菌剂按照5g/L的配比加入到污染体系中对PAEs进行去除;
S5、降解特性验证:
将固体菌剂加入到污染体系中之后,取10ml含有固体菌剂的污染体系置于恒温培养箱中3~5天,检测污染体系中PAEs含量的变化。
实施例2
与实施例1不同的是,按照0.04g/mL的质量浓度向锥形瓶中加入的受PAEs污染的土壤样品与无菌水,随后将锥形瓶置于摇床中,在30℃的温度条件下,以150rpm的转速避光震荡培养6h取出,静置2h后,得到的上清液即为土著微生物菌液;其中,受PAEs污染的土壤样品为受PAEs污染时间超过5年的土壤样品。
实施例3
与实施例1不同的是,按照0.06g/mL的质量浓度分别向锥形瓶中加入的长期受PAEs污染的土壤样品与无菌水,随后将锥形瓶置于摇床中,在35℃的温度条件下,以200rpm的转速避光震荡培养8h取出,静置2h后,得到的上清液即为土著微生物菌液;其中,受PAEs污染的土壤样品为受PAEs污染时间超过7年的土壤样品。
实施例4
与实施例1不同的是,步骤S1中,按照体积比为4:96称取土著微生物菌液与含PAEs的无机盐培养基,然后将土著微生物菌液转接至含PAEs的无机盐培养基中,加入PAEs混标,使培养基中PAEs浓度达到80mg/L,然后在30℃的温度条件下,以150rpm的转速在摇床上震荡培养6d,相同条件下连续富集培养5代后,获得稳定的具有高效降解PAEs能力的功能土著微生物菌群L-3。
实施例5
与实施例1不同的是,步骤S1中,按照体积比为6:94称取土著微生物菌液与含PAEs的无机盐培养基,然后将土著微生物菌液转接至含PAEs的无机盐培养基中,加入PAEs混标,使培养基中PAEs浓度达到80mg/L,然后在30℃的温度条件下,以150rpm的转速在摇床上震荡培养6d,相同条件下连续富集培养5代后,获得稳定的具有高效降解PAEs能力的功能土著微生物菌群L-3。
实施例6
与实施例1不同的是,步骤S2中,将功能土著微生物菌群L-3接种于LB培养基中活化,在28℃的温度条件下,以150rpm的转速恒温震荡培养12h,再于4℃的温度条件下以5000rpm的转速离心4min后收集菌体并弃去上清液,然后用无机盐培养基冲洗菌体后,再次离心并弃去上清液,清洗两次后将菌体的OD600值调整到1.0作为菌群悬液,在4℃的温度下暂存备用。
实施例7
与实施例1不同的是,步骤S2中,将功能土著微生物菌群L-3接种于LB培养基中活化,在32℃的温度条件下,以200rpm的转速恒温震荡培养16h,再于4℃的温度条件下以8000rpm的转速离心6min后收集菌体并弃去上清液,然后用无机盐培养基冲洗菌体后,再次离心并弃去上清液,清洗两次后将菌体的OD600值调整到1.0作为菌群悬液,在4℃的温度下暂存备用。
实施例8
与实施例1不同的是,步骤S3中,其中,生物炭是采用园林废弃物雪松在400℃炭化条件下制备得到的。
实施例9
与实施例1不同的是,步骤S3中,其中,生物炭是采用园林废弃物雪松在600℃炭化条件下制备得到的。
实施例10
与实施例1不同的是,步骤S3中,在30℃的条件下,以150rpm的转速培养24h后取出,随后在离心机中以8000rpm的速率离心处理5min后,得到上清液和下层固体,弃去上清液然后用灭过菌的无机盐培养基洗涤下层固体,再离心5min后弃上清液;重复此过程2次,置于灭过菌的烘箱中以25℃的温度烘干,最终所得固体即为功能土著微生物菌群固体菌剂。
实施例11
与实施例1不同的是,步骤S3中,在30℃的条件下,以200rpm的转速培养24h后取出,随后在离心机中以8000rpm的速率离心处理10min后,得到上清液和下层固体,弃去上清液然后用灭过菌的无机盐培养基洗涤下层固体,再离心10min后弃上清液;重复此过程3次,置于灭过菌的烘箱中以30℃的温度烘干,最终所得固体即为功能土著微生物菌群固体菌剂。
实施例12
与实施例1不同的是,固定化载体的制备方法1)中:将园林废弃物雪松自然晒干,用水清洗2次,先在100℃烘箱中杀青25min,然后50℃的温度下烘烤24h,粉碎15min后过40目筛,得到粉碎后的雪松,备用。
实施例13
与实施例1不同的是,固定化载体的制备方法1)中将园林废弃物雪松自然晒干,用水清洗3次,先在110℃烘箱中杀青35min,然后60℃的温度下烘烤24h,粉碎20min后过40目筛,得到粉碎后的雪松,备用。
实施例14
与实施例1不同的是,固定化载体的制备方法1)中活化溶液由70%的Na2CO3、10%的FeCO3、2.5%的磷酸氢二铵以及余量的蒸馏水组成。
实施例15
与实施例1不同的是,固定化载体的制备方法1)中活化溶液由80%的Na2CO3、15%的FeCO3、4.5%的磷酸氢二铵以及余量的蒸馏水组成。
实施例16
与实施例1不同的是,固定化载体的制备方法3)中,以5℃/min的升温速率调节气氛炉内温度为250℃,然后再以10℃/min的升温速率调节气氛炉内温度为400℃,恒温炭化1.5h后以5℃/min的降温速率降至300℃,然后再以10℃/min的降温速率降至室温后将生物炭取出,即得到响应温度的炭化粗产物。
实施例17
与实施例1不同的是,固定化载体的制备方法3)中,以8℃/min的升温速率调节气氛炉内温度为300℃,然后再以15℃/min的升温速率调节气氛炉内温度为600℃,恒温炭化2.5h后以8℃/min的降温速率降至350℃,然后再以15℃/min的降温速率降至室温后将生物炭取出,即得到响应温度的炭化粗产物。
实施例18
与实施例1不同的是,固定化载体的制备方法5)中,将步骤4)中获得的炭材料先用质量浓度为0.05%的HCl溶液进行清洗,接着用超纯水冲洗3次后烘干,即可获得固定化载体。
实施例19
与实施例1不同的是,固定化载体的制备方法5)中,将步骤4)中获得的炭材料先用质量浓度为0.15%的HCl溶液进行清洗,接着用超纯水冲洗5次后烘干,即可获得固定化载体。
对照例
对照例1:与实施例1不同的是,将具有高效降解PAEs能力的功能土著微生物菌群L-3置于-80℃的冰箱中保存备用。
对照例2:与实施例1不同的是,步骤S3中,选用园林废弃物雪松在800℃炭化条件下制备的生物炭作为固定化载体。
对照例3:与实施例1不同的是,固定化载体的制备方法1)中活化溶液由75%的Na2CO3以及余量的蒸馏水组成。
对照例4:与实施例1不同的是,固定化载体的制备方法3)中,以5℃/min的升温速率升至600℃,恒温炭化2h后然后再以5℃/min的降温速率降至室温。
对照例5:与实施例1不同的是,固定化载体的制备方法5)中,将步骤4)中获得的炭材料用超纯水冲洗4次后烘干。
对照例6:与实施例1不同的是,步骤S3中,固定化载体的制备方法1)中,对粉碎后的雪松进行活化处理;活化步骤为:按照固液比为4g/mL将粉碎后的雪松置入到质量浓度为1.8mol/L的活化溶液中,并在超声条件下浸渍1.8h,过滤掉浸泡滤液后取出并放入真空环境内,并利用氮气对粉碎后的雪松表面吹扫至干燥;超声波密度为40W/cm2;活化溶液按质量百分比计,由75%的Na2CO3、12%的FeCO3、3.5%的磷酸氢二铵以及余量的蒸馏水组成。
实验例
1、功能土著菌群固体菌剂对PAEs的降解性能测定
采用LC-20AT高效液相色谱仪(配有SPD-2A紫外检测器),检测时间为40min,进样系统的进样量为20μL;分离系统以乙腈-水为流动相、初始流速为1.0mL/min,采用梯度洗脱的方式分离PAEs,色谱柱为Φ4.6×250mm Inertsil ODS-P液相色谱柱,柱温为40℃;检测系统采用紫外检测器检测、开启双波长检测模式,分别为205nm和225nm;
向含有20mg/L浓度PAEs(即含20mg/L DMP、20mg/L DEP、20mg/LDBP、20mg/L BBP、20mg/L DEHP和20mg/L DnOP)的20mL MSM培养液中加入0.1g实施例1制备得到的功能土著菌群固体菌剂,以不加固体菌剂作为对照,并调节pH为7.0,每组三个重复,在30℃,150rpm恒温摇床培养5d,分别于1、3、5d取样,向取出的锥形瓶中加入40mL色谱纯甲醇,水浴超声震荡1h;超声结束后涡旋摇匀,将上清液用0.22μm有机相滤膜过滤并转入2mL棕色液相小瓶,用高效液相色谱仪进行检测;功能土著菌群固体菌剂对六种混合PAEs的降解效果如图5所示;继续分别向含有20mg/L浓度PAEs(即含20mg/L DMP、20mg/L DEP、20mg/L DBP、20mg/LBBP、20mg/L DEHP和20mg/L DnOP)的20mL MSM培养液中加入0.1g实施例2~实施例19,对照例1~3制备得到的功能土著菌群固体菌剂,并调节pH为7.0,统计对六种混合PAEs的降解效果如表1所示:
表1实施例1~19、对照例1~5制备得到的功能土著菌群固体菌剂对六种混合PAEs的降解测试表
结论:由图4可得,该菌剂在5天振荡培养下对六种PAEs具有显著的降解效果。特别是针对短链PAEs(如DMP、DEP),固体菌剂对这两种PAEs在第3天的降解率均能超过99%。对中链PAEs(如DBP、BBP)的降解速度也较快,固体菌剂对DBP的降解率在第3天时能达到96%,而对BBP的降解率也能达到86%。但对长链PAEs(如DEHP、DnOP)的降解速度相对较慢,固体菌剂对DEHP的降解率在第3天时只能达到55%,在第5天时可达到80%,而对DnOP的降解率在第3天时仅有36%,在第5天时能达到67%;功能土著菌群固体菌剂在5d时间内对六种PAEs的总降解率能达到89%以上;
由表1数据中实施例1与对照例1对比可得,体积浓度为30%的甘油能够对功能土著微生物菌群L-3有效保存,避免功能土著微生物菌群L-3在冰冻过程中产生冰晶体从而降低细胞的存活率,从而降低后续对PAEs的降解效果;
由实施例1、实施例8、实施例9以及对照例2数据对比可得,800℃烧制的生物炭自由基较多,产率也低,固定化后固定化菌剂降解率较低,合理的烧制温度为400~600摄氏度,从经济性考虑,实施例1为最优方案;
由实施例1、实施例14、实施例15以及对照例3的数据可得,磷酸氢二铵、FeCO3对碳酸钠对雪松的活化效果能够产生较为明显的促进作用,使雪松的碳化过程加深,固相产物产率增加,并且磷酸氢二铵的少量加入能够对起到表面进行清洗灭菌的作用,避免掺杂从而降低固定化载体的纯度;由实施例1、实施例16、实施例17以及对照例4的数据可得,梯度式升温能够促进雪松的炭化作用,避免快速升温状态下雪松薄壁组织遭到爆炸性破坏,从而使得炭化材密度降低,从而降低对于环境中PAEs的去除率;由实施例1、实施例18、实施例19以及对照例5的数据可得,通过HCl能够对活化液中余量的Na2CO3进行去除,从而减少对后续功能土著菌群固体菌剂降解PAEs的影响;由实施例1与对照例6的数据对比可以得出,对雪松进行活化处理的过程中,优先用壳聚糖与纳米二氧化硅对雪松表面处理能够促进雪松的活化效果,从而促进对PAEs的去除;综合起来,实施例1为最优方案。
Claims (10)
1.一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、土著微生物菌群富集、驯化
按照0.04~0.06g/mL的质量浓度向锥形瓶中加入受PAEs污染的土壤样品与无菌水,随后将锥形瓶置于摇床中,在30~35℃的温度条件下,以150~200rpm的转速避光震荡培养6~8h取出,静置2h后,得到的上清液即为土著微生物菌液;
按照体积比为4~6:94~96称取所述土著微生物菌液与含PAEs的无机盐培养基,然后将土著微生物菌液转接至含PAEs的无机盐培养基中,加入PAEs混标,使培养基中PAEs浓度达到设定值,然后在30℃的温度条件下,以150rpm的转速在摇床上震荡培养5~7d,相同条件下连续富集培养5代后,获得稳定的具有高效降解PAEs能力的功能土著微生物菌群L-3,采用甘油保藏法进行保藏;
S2、菌悬液的制备
将功能土著微生物菌群L-3接种于LB培养基中活化,所述活化方法为:在28~32℃的温度条件下,以150~200rpm的转速恒温震荡培养12~16h;再于4~6℃的温度条件下以5000~8000rpm的转速离心4~6min后收集菌体并弃去上清液,然后用无机盐培养基冲洗菌体后,再次离心并弃去上清液,清洗两次后将细菌的OD600值调整到1.0作为菌群悬液,在4℃的温度下暂存备用;
S3、固体菌剂的制备
用生物炭作为固定化载体;称取生物炭置于锥形瓶中灭菌后冷却至常温,将制备好的固定化载体按照固液比1:10g/mL的比例加入菌群悬液,并置于恒温震荡培养箱中,在30℃的条件下,以150~200rpm的转速培养24h后取出,随后在离心机中以8000rpm的速率离心处理5~10min后,得到上清液和下层固体,弃去上清液然后用灭过菌的无机盐培养基洗涤下层固体,再离心5~10min后弃上清液;重复此过程2~3次,置于灭过菌的烘箱中以25~30℃的温度烘干,最终所得固体即为功能土著微生物菌群固体菌剂;
S4、PAEs的去除
将步骤S3获得的固体菌剂按照5~6g/L的配比加入到污染体系中对PAEs进行去除。
2.根据权利要求1所述的一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法,其特征在于,受PAEs污染的土壤样品为长期受PAEs污染的土壤样品。
3.根据权利要求1所述的一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法,其特征在于,所述无机盐培养基由1.5g/L的(NH4)2SO4、0.5g/L的KH2PO4、1.91g/L的K2HPO4·3H2O、0.5g/L的NaCl以及0.2g/L的MgSO4·7H2O组成;pH为7.0;
所述LB培养基包括以下组分:5.0g的酵母提取物、10.0g的胰化蛋白胨以及10.0g的氯化钠;加入1L的纯超水并调节pH为7.0,在温度为121℃的条件下灭菌20~25min。
4.根据权利要求1所述的一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法,其特征在于,所述PAEs为邻苯二甲酸二甲酯和/或邻苯二甲酸二乙酯和/或邻苯二甲酸二丁酯和/或邻苯二甲酸丁基苄酯和/或邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯和/或邻苯二甲酸二正辛酯。
5.根据权利要求1所述的一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法,其特征在于,步骤S3中,所述生物炭是采用园林废弃物雪松在400~600℃炭化条件下制备得到的。
6.根据权利要求1所述的一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法,其特征在于,步骤S3中,所述固定化载体的制备方法为:
1)将园林废弃物雪松自然晒干,用水清洗2~3次,先在100~110℃烘箱中杀青25~35min,然后50~60℃的温度下烘烤24h,粉碎15~20min后过40目筛,得到粉碎后的雪松,备用;
2)取粉碎后的雪松置于坩埚中,压实并盖上坩埚盖,置于气氛炉中,密封并打开氮气阀门,往炉内通10~15min氮气;
3)以5~8℃/min的升温速率调节气氛炉内温度为250~300℃,然后再以10~15℃/min的升温速率调节气氛炉内温度为400~600℃,恒温炭化1.5~2.5h后以5~8℃/min的降温速率降至300~350℃,然后再以10~15℃/min的降温速率降至室温后将生物炭取出,即得到相应温度的炭化粗产物;
式中:m雪松为炭化前粉碎后的雪松的质量,单位为g;m生物炭为炭化后粉碎后的雪松的质量,单位为g;m水为粉碎后的雪松中水分的质量,单位为g;
5)将步骤4)中获得的炭材料先用质量浓度为0.05~0.15%的HCl溶液进行清洗,接着用超纯水冲洗3~5次后烘干,即可获得固定化载体。
7.根据权利要求6所述的一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法,其特征在于,步骤4)中,所述球磨工艺为:以4.0~5.0:1的球料质量比将氧化铝研磨球与冷却后的炭化粗产物加入球磨罐中,调节球磨机的转速为80~90r/min,研磨时间2.5~3h,得到生物炭材料,干燥备用。
8.根据权利要求6所述的一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法,其特征在于,在步骤1)之后且在步骤2)之前对所述粉碎后的雪松进行活化处理;所述活化步骤为:先用质量浓度为0.5~1.5%的壳聚糖与纳米SiO2按照体积比为1:0.2~0.3混合后得到的混合液对粉碎后的雪松进行3~5次喷雾处理;其中,喷枪压力为0.15~0.2MPa,喷射粒径为0.3~1mm;然后按照固液比为3~5g/mL将处理后的雪松置入到质量浓度为1.5~2.0mol/L的活化溶液中,并在超声条件下浸渍1.5~3h,过滤掉浸泡滤液后取出并放入真空环境内,并利用氮气对粉碎后的雪松表面吹扫至干燥;超声波密度为35~45W/cm2;
所述活化溶液按质量百分比计,由70~80%的Na2CO3、10~15%的FeCO3、2.5~4.5%的磷酸氢二铵以及余量的蒸馏水组成。
9.根据权利要求1所述的一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法,其特征在于,还包括步骤S5,
S5、降解特性验证:
将固体菌剂加入到污染体系中之后,取15~25mL含有固体菌剂的污染体系置于恒温培养箱中3~5天,检测污染体系中PAEs含量的变化。
10.根据权利要求1所述的一种利用功能土著菌群固体菌剂去除环境中PAEs的方法,其特征在于,步骤S1中,所述甘油保藏法的操作步骤为:按体积比为1:1的比例将获得的功能土著微生物菌群L-3与体积浓度为30%的甘油混合,并置于-80℃的冰箱中保存备用。
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GR01 | Patent grant | ||
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